孟實，張曉書，趙余慶，*

（1.九州大學(xué)農(nóng)學(xué)部應(yīng)用生物，日本福岡812-0053；2.沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院，遼寧沈陽110016）

樹莓與藍莓中多酚類成分的HPLC測定

孟實1，張曉書2，趙余慶2，*

（1.九州大學(xué)農(nóng)學(xué)部應(yīng)用生物，日本福岡812-0053；2.沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院，遼寧沈陽110016）

利用HPLC法對樹莓與藍莓中的生理活性成分進行含量測定。HPLC法采用Kromasil C18色譜柱（150mm，4.6mm）；流動相采用色譜純乙腈（A）-含0.1%磷酸水溶液（B）梯度洗脫，0～16min，5%A；19min，10%A；23min，13%A；40min，14%A；43min，17%A；48min，22%A；51min，24%A；52min，24%A；58min，26%A；60min，30%A；65min，60%A；68min，70%A；72min～78min，100%A；流速為1mL/min；柱溫30℃；檢測波長為280 nm；每次進樣10μL，測定樹莓與藍莓95%乙醇提取物中沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素、表兒茶素、原花青素B2、矢車菊素、鞣花酸、樹莓酮、白藜蘆醇、水楊酸的含量；這十種多酚類成分在三種漿果中含量高低不等，其中鞣花酸含量在黑樹莓中最高（0.97μg/g），紅樹莓次之（0.51μg/g），藍莓最低（0.36μg/g）。藍莓與樹莓中富含多種多酚類物質(zhì)，是其具有多種生物活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。

藍莓；紅樹莓；黑樹莓；HPLC

樹莓屬薔薇科懸鉤子屬植物，果實酸甜可口，具有很高的營養(yǎng)價值，澀精益腎助陽明目、醒酒止渴、化痰解毒之功效，主治腎虛、遺精、醉酒、丹毒等癥。葉性微苦，具有清熱利咽、解毒、消腫、斂瘡等作用，主治咽喉腫痛、多發(fā)性膿腫、乳腺炎等癥，在湖南湘西地區(qū)，群眾常將嫩葉搗碎飼喂動物治療腹瀉。同時，樹莓中含有人體所必需的大量的VC、VE、SOD等營養(yǎng)物質(zhì)，能改善人體新陳代謝及增強免疫力，有很高的藥用價值。樹莓的果實除鮮食外還大部分制成速凍果實、果汁、果酒和果醬等食品，是國內(nèi)近年興起的第3代水果之一[1]。紅樹莓較為常見，其熱量較低，膳食纖維含量較高，樹莓籽中不飽和脂肪酸含量較高，籽中含有脂溶性維生素如胡蘿卜素和生育酚，果肉中含有水溶性VC。黑樹莓作為近來日益流行的品種含有的生物活性的化學(xué)物質(zhì)種類繁多，其中最為主要的是天然酚酸類成分。它們芳香環(huán)上都連有羥基，是植物次生代謝產(chǎn)生的非營養(yǎng)成分。藍莓為越橘屬，約有450種，主要者約18種，分布于全世界亞寒帶、溫帶及亞熱帶。中國的大、小興安嶺山區(qū)有野生藍莓，近年已進行人工馴化栽培。而源生于北美洲者泛稱美國藍莓，約百年前由F.V.Coville開始人工栽培[2]。盡管測定方法各不相同，漿果的抗氧化能力一直居各類水果之首，大約是其他水果的4倍，蔬菜的40倍。該漿果類植物中主要的活性物質(zhì)有黃酮、酚醛酸、木脂素和單寧四類。本課題組對其可能存在的十種活性成分進行了含量測定。兒茶素和表兒茶素具有抗氧化、防輻射、護膚美容、減緩香煙毒害等多種功效[3]。在對鼠和人體組織移植所做的體內(nèi)和體外試驗中，鞣花酸表現(xiàn)出對化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)癌變及其他多種癌變有明顯的抑制作用[4]。純天然水果中的鞣花酸能僅將體內(nèi)壞細胞摧毀，不會損傷體內(nèi)好細胞。所以平常攝取此營養(yǎng)素可以預(yù)防癌細胞的形成，也是抗癌的最佳天然補充食品。白藜蘆醇具有預(yù)防心血管病，抗腫瘤，抑制血小板凝集，延緩衰老等功效[5-8]。本研究對樹莓和藍莓中沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素、表兒茶素、原花青素B2、矢車菊素、鞣花酸、樹莓酮、白藜蘆醇、水楊酸的多酚類含量進行系統(tǒng)全面的測定，以對以上幾種水果的多酚類含量提供有效的參考。

1 材料與方法

1.1 樣品前處理

取藍莓、紅樹莓和黑樹莓凍干粉各40 g，分別兩次加入400mL的95%乙醇超聲波提取，提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后取適量經(jīng)濾膜過濾待用。

1.2 試劑與儀器設(shè)備

高效液相色譜儀（L-2200Hitachi：日本）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（OSB－2000 EYELA：日本）；Sartorius電子天平：中國。

沒食子酸、原兒茶酸、矢車菊素、原花青素B2、白藜蘆醇、鞣花酸、水楊酸和樹莓酮對照品（質(zhì)量分數(shù)均為98%）由天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司提供，兒茶素（批號878-200102）、表兒茶素對照品（批號877-200001）由中國藥品生物制品檢定所提供。甲醇為色譜純、乙腈為色譜純、雙重蒸餾水。藍莓和樹莓的產(chǎn)地見表1。

表1 藍莓和樹莓的產(chǎn)地Table1 The products of blueberry and raspberries

1.3 測定方法

沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素、表兒茶素、原花青素B2、矢車菊素、鞣花酸、樹莓酮、白藜蘆醇、水楊酸的測定，液相條件如下：

Kromasil C18色譜柱（150mm，4.6mm）；流動相采用色譜純乙腈（A）-含0.1%磷酸水溶液（B）梯度洗脫，0～16min，5%A；19 min，10%A；23min，13%A；40 min，14%A；43min，17%A；48min，22%A；51min，24%A；52min，24%A；58min，26%A；60min，30%A；65min，60%A；68min，70%A；72～78min，100%A；流速為1mL/min；柱溫30℃；檢測波長為280 nm；每次進樣10μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的繪制

標準曲線沒食子酸：1.0mg；原兒茶酸：1.3mg；兒茶素：0.8mg；表兒茶素：1.2mg；原花青素B2：0.8mg；矢車菊素：0.5mg；鞣花酸：1.3mg；樹莓酮：1.2mg；白藜蘆醇：1.1mg；水楊酸：1.4mg置于5mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。沒食子酸標準曲線y=2E+06x-273 975 R2=0.9965結(jié)果表明，沒食子酸在0.2μg～2.8μg線形關(guān)系良好。原兒茶酸標準曲線y=788910x-111788R2=0.9998結(jié)果表明，原兒茶酸在0.2μg～2.8μg線形關(guān)系良好。兒茶素標準曲線y=540 822x-73 815 R2=0.999 7結(jié)果表明，兒茶素在0.2μg～2.8μg線形關(guān)系良好。表兒茶素標準曲線y=602 376x-99 405R2= 0.999 4結(jié)果表明，表兒茶素在0.2μg～2.8μg線形關(guān)系良好。原花青素B2標準曲線y=85 567x-57 927，R2= 0.999 1結(jié)果表明，原花青素B2在0.2μg～2.8μg線形關(guān)系良好。

矢車菊素標準曲線y=293 173x-66 482 R2= 0.999 7結(jié)果表明，矢車菊素在0.2μg～2.8μg線形關(guān)系良好。鞣花酸標準曲線y=994 654x-213 775 R2= 0.999 7結(jié)果表明，鞣花酸在0.2μg～2.8μg線形關(guān)系良好。樹莓酮標準曲線y=469 659x-120 798R2=0.999 7結(jié)果表明，樹莓酮在0.2μg～2.8μg線形關(guān)系良好。白藜蘆醇標準曲線y=285 053x-36 380 R2=0.999 1結(jié)果表明，白藜蘆醇在0.2μg～2.8μg線形關(guān)系良好。水楊酸標準曲線y=2E+06x-104 852R2=0.999 4結(jié)果表明，水楊酸在0.2μg～2.8μg線形關(guān)系良好。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 精密度試驗

精密稱取黑樹莓提取物10μL連續(xù)進樣5次，測定色譜峰面積。結(jié)果顯示沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素、表兒茶素、原花青素B2、矢車菊素、鞣花酸、樹莓酮、白藜蘆醇、水楊酸的平均RSD%分別為0.54%、0.51%、0.65%、0.67%、1.32%、0.69%、1.39%、1.66%、0.78%、0.48%。

2.2.2 重復(fù)性試驗

精密稱取黑樹莓提取物10μL共5份，進樣，測定色譜峰面積。結(jié)果顯示白藜蘆醇、食子酸、原兒茶酸、兒茶素、表兒茶素、原花青素B2、矢車菊素、鞣花酸、樹莓酮、白藜蘆醇、水楊酸的平均RSD%分別為1.25%、1.32%、1.41%、1.02%、1.08%、1.05%、1.38%、1.43%、1.06%和1.56%，表明本試驗測定方法的重復(fù)性良好。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗

分別在0、4、8、12、24 h精密吸取黑樹莓提取物10μL進樣，測定色譜峰面積。結(jié)果顯示沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素、表兒茶素、原花青素B2、矢車菊素、鞣花酸、樹莓酮、白藜蘆醇及水楊酸的平均RSD%分別為0.96%、1.62%、1.33%、1.29%、0.78%、1.21%、1.43%、1.89%、1.12%和0.99%，表明在此時間內(nèi)供試品溶液性質(zhì)穩(wěn)定。

2.2.4 加樣回收率試驗

精取黑樹莓提取物，共5份，分別加入0.05mg的沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素、表兒茶素、原花青素B2、矢車菊素、鞣花酸、樹莓酮、白藜蘆醇及水楊酸對照品，分別精密吸取10μL進樣，測定，平均回收率分別為100.72%、99.63%、100.97%、100.78%、100.11%、99.89%、100.56%、100.55%、100.79%、100.71%。RSD%分別為1.62%、1.08%、0.83%、1.02%、1.22%、1.45%、1.24%、0.97%、0.88%、1.78%。

2.2.5 HPLC測定結(jié)果

樣品中沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素、表兒茶素、原花青素B2、矢車菊素、鞣花酸、樹莓酮、白藜蘆醇、水楊酸含量見表1取酒樣經(jīng)0.22μm濾膜超濾備用。取對照品和供試品溶液進樣測定，色譜圖見圖1。定量方法采用外標法，結(jié)果見表2。

從表2中可以看出，十種單體成分平均回收率在95%～110%，變異系數(shù)小于5%。該方法滿足了定性和定量測定的需要。

圖1 對照品（A）和黑樹莓（B）的HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances（A）and black raspberry（B）

表2 黑樹莓、紅樹莓和藍莓的HPLC含量測定結(jié)果Table2 HPLC determination results of ten compounds in black raspberry，red raspberry and blueberry μg/g

3 結(jié)論與討論

樹莓與藍莓作為一種風(fēng)味品質(zhì)優(yōu)良、營養(yǎng)價值高的小漿果，具有較高營養(yǎng)保健價值和經(jīng)濟價值，富含在其他水果中含量少或不含的特殊營養(yǎng)成分，在歐美等國家受到普遍歡迎，已經(jīng)逐漸發(fā)展成為第三代新興水果，具有很高的經(jīng)濟效益。由測定數(shù)據(jù)顯示，兒茶素含量藍莓最高（190.43μg/g），黑樹莓（11.76μg/g），紅樹莓最低（4.81μg/g）。沒食子酸含量黑樹莓最高（1.02μg/g），紅樹莓之（0.14μg/g）藍莓最低（0.01μg/g）。表兒茶素含量紅樹莓最高（1.94μg/g），藍莓次之（1.12μg/g），黑樹莓最低（0.69μg/g），鞣花酸含量黑樹莓最高（0.97μg/g），紅樹莓次之（0.51μg/g），藍莓最低（0.36μg/g）。鞣花酸是被科學(xué)家廣泛認同的具有抑制致癌物質(zhì)活性的成分，從數(shù)據(jù)可以看出其含量在黑樹莓中最高，這也說明黑樹莓對于腫瘤的預(yù)防具有一定的前景。但根據(jù)液相譜圖可以看出，除此幾種成分以外，仍有其他成分存在，對于這些成分的鑒別以及藥理活性等相關(guān)研究工作正在進行中。

[1]陳介甫,李亞東,徐哲．藍莓的主要化學(xué)成分及生物活性[J].藥學(xué)學(xué)報,2010,45(4):422-429

[2]劉孟軍．中國野生果樹[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社:1998:227-231

[3]Ngoc TM.Lipoxygenase inhibitory constituents from rhubarb[J]. Arch Pharm Res,2008,31(5):598-605

[4]Angelika R,Ronald EW.Ellagic acid content of red raspberry juice as influenced by cultivar,processing,and environmental factors[J].J. Agric Food Chem,1993,41:1951-1960

[5]李華,張予林,袁春,等．葡萄與葡萄酒中白藜蘆醇分析方法的研究現(xiàn)狀[J].中國食品學(xué)報,2005,5(1):104-109

[6]Shang J.Resveratrol improves non-alcoholic fatty liver disease by activating AM Pactivated protein kinase[J].Acta Pharmacol Sin,2008, 29(6):698-706

[7]Carsten RE.Resveratrol reduces radiation-induced chromosome aberration frequencies in mouse bone marrow cells[J].Radiat Res, 2008,169(6):633-8

[8]Dani C.Antioxidant Protection of Resveratrol and Catechin in Saccharomyces cerevisiae[J].J Agric Food Chem,2008,56(11):4268-72

Analysis of Phenolic Compounds in Blue Berry and Raspberry by HPLC

MENG Shi1，ZHANG Xiao-shu2，ZHAO Yu-qing2，*
（1.Department of Applied Biology，F(xiàn)aculty of Agriculture，Kyushu University，F(xiàn)ukuoka，812-0053，Japan；2.Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang110016，Liaoning，China）

To assay the quantity of activities from blue berry and raspberry by absorption spectrometry and HPLC. The content of Gallic acid，protocatechuic acid，catechin，epicatechin，procyanidin B2，cyanidin，ellagic acid，raspberry ketone，resveratrol and salicylic acid were determined by HPLC analysis was detected by chromatography on Kromasil C18（4.6mm×150mm）chromatographic column.The mobile phase was chromatographic purity acetonitrile（A）-water solution containing 0.1%phosphoric acid（B）gradient elution，0-16min，5%A；19min，10%A；23min，13%A；40min，14%A；43min，17%A；48min，22%A；51min，24%A；52min，24%A；58min，26%A；60min，30%A；65min，60%A；68min，70%A；72min-78min，100%A，flow rate was 1mL/minatλ280nm.The content of phenolic compounds in these three kinds of berry was different.The content of ellagic acid from high to low order：black raspberry（0.97μg/g），red raspberry（0.51μg/g），blueberry（0.36μg/g）. Blue berry and raspberry are particularly rich in phenolic compounds，which were the basics of their biological active diversity.

blueberry；red raspberry；black raspberry；HPLC

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.03.022

2013-01-04

孟實（1989—），男（漢），碩士研究生，主要從事功能食品研究。

*通信作者：趙余慶（1957—），男（漢），教授，博士生導(dǎo)師，主要從事功能食品研究。