陳蓉蓉，蒲含林，姜華，鄭元升

（暨南大學(xué)細胞生物學(xué)系，廣東廣州510632）

牛大力多糖的分離純化及抗氧化活性研究

陳蓉蓉，蒲含林*，姜華，鄭元升

（暨南大學(xué)細胞生物學(xué)系，廣東廣州510632）

建立了熱水提取、乙醇沉淀、三氟乙酸除蛋白、Sephadex G-75凝膠過濾層析法，從牛大力分離純化得到一種水溶性多糖，命名為MSP-1。通過紅外光譜和離子色譜對其結(jié)構(gòu)和單糖組成進行初步分析，結(jié)果表明MSP-1主要由鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖和果糖組成。同時對牛大力水提物、醇沉物和粗多糖進行體外抗氧化活性研究，結(jié)果表明，三者的抗脂質(zhì)過氧化作用和對·OH自由基和DPPH·自由基清除能力：VC＞牛大力水提物＞牛大力醇沉物＞牛大力粗多糖，并呈量效關(guān)系。

牛大力；多糖；抗氧化

牛大力（Millettia Speciosa Champ.）別名：金鐘根、牛牯大力等，為豆科崖豆藤屬植物美麗崖豆藤的干燥根，性味甘、平，具有補虛潤肺，強筋活絡(luò)的功用[1]。臨床上已證明其對多種慢性疾病有治療作用，主要用來治腰痛、腎虛帶下、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腰肌勞損、慢性肝炎、病后體虛等。呂世靜等[2]通過溶血空斑試驗、小鼠血清抗體凝集效價、IL-2活性測定等實驗研究牛大力對實驗小鼠B淋巴細胞分泌特異性抗體及T淋巴細胞產(chǎn)生白細胞介素2的免疫調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)牛大力多糖具有增強免疫力的功能。從目前這些研究來看，牛大力多糖具有潛在的開發(fā)應(yīng)用價值，且牛大力多糖結(jié)構(gòu)分析與清除自由基的研究還少見報道。本研究旨在分析其一級結(jié)構(gòu)組成以及體外抗氧化作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛大力購自廣州天河石牌東百康源大藥房，經(jīng)鑒定為豆科崖豆藤屬植物美麗崖豆藤（Millettia Speciosa Champ.）的根。DPPH為美國sigma公司，硫代巴比妥酸（TBA）為中國醫(yī)藥（集團）上海化學(xué)試劑公司，VC為美國羅氏公司，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 受試動物

昆明種小白鼠，雌雄各半，二至三月齡，體重18 g～22g。由暨南大學(xué)實驗動物中心提供，常規(guī)實驗室飼養(yǎng)。

1.3 牛大力粗多糖的提取、純化

牛大力干品切片（3 kg）→粉碎→80℃水浴浸提2 h三次→合并濾液→離心，取上清液（水提物）→濃縮→加入乙醇至含醇量達80%（醇沉物），-4℃冰箱靜置12 h→離心，收集沉淀→適量熱水溶解，緩慢加入15%三氯乙酸，攪拌至無沉淀生成，離心，合并上清液→透析2 d，濃縮，凍干→先后加入無水乙醇、丙酮，不斷攪拌，洗去色素，過濾→冷凍干燥，得到粉狀牛大力多糖（粗多糖）。

1.4 牛大力粗多糖的純化

分離柱為Sephadex G-75葡聚糖凝膠層析柱。層析柱先用超純水平衡12 h后，上樣前將樣品溶解后離心，過0.45μm微孔濾膜。分離條件為室溫，以超純水為流動相洗脫，流速為0.5mL/min，苯酚硫酸法跟蹤檢測，收集主峰，合并洗脫液，濃縮，冷凍干燥得到純化多糖。

1.5 牛大力多糖結(jié)構(gòu)分析

1.5.1 牛大力的元素分析前處理

牛大力切片粉碎，干燥，稱取1.000 0 g牛大力于瓷坩堝中，置電阻爐中高溫加熱至600℃完全灰化，冷卻，加入1mL濃HNO3溶解后，定容。測定條件為等離子體15 L/min，等離子發(fā)射功率為1 300W，輔助氣流量0.2 L/min，霧化器0.70，觀測距離15.0，等離子體軸向觀測。同樣條件以硝酸及雙蒸水作空白對照，按外標法測定各元素含量[3]。

1.5.2 牛大力多糖的元素組成分析

使用CHNS/O元素分析儀對牛大力多糖進行C、H、N等元素分析。實驗條件為通氣載氣：20 PSI（0.14MPa），氧氣：15 PSI（0.1MPa），氣動氣：（0.4MPa）；燃燒管溫度（925），還原管溫度（640）。

1.5.3 紅外光譜分析

稱取1.0mg干燥牛大力多糖組分（MSP-1）于KBr混合壓片中，在4 000 cm-1～400 cm-1范圍進行紅外掃描。

1.5.4 離子色譜分析

牛大力多糖MSP-1水解：配制1.0mg/mL牛大力多糖溶液，取1mL于具塞試管中，加入4.0 g/L三氟乙酸溶液1.0mL，封口，在水浴鍋80℃下水解反應(yīng)1 h，加水溶解并定容至2.0mL檢測[4]。

色譜條件為CarboPACTMPAl0糖分離柱（2mm i.d× 250mm），CarboPACTMPAl0糖保護柱（2mm i.d×50mm），AminoPACTrap氨基酸捕集柱（2mm i.d×50mm）；流動相為14.0mmol/LNaOH，流量0.2mL/min，進樣量25μL，柱溫30℃。

1.6 牛大力抗脂質(zhì)過氧化作用

昆明種小鼠脫頸椎處死，迅速取出肝組織，放入到4℃預(yù)冷的生理鹽水中，洗凈殘血，吸干水分，稱重，用生理鹽水制備成3%肝勻漿。在具塞試管各加入3mL肝勻漿后，實驗組加入三部位不同濃度牛大力提取物1mL，陽性組加入VC溶液1mL，對照管加入1mL雙蒸水，再各加入6mmol/LFeSO4100μL，60 mmol/LH2O240μL，混勻，37℃溫育90min；再加入15%TCA 1mL沉淀蛋白振蕩終止反應(yīng)，加入0.67%TBA 1mL混勻，煮沸15min，冰浴冷卻；用分光光度計測定在515 nm處的吸光度。按脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的摩爾消光系數(shù)ε=1.56×104mol/（L·cm）計算MDA的產(chǎn)量[5-6]。

1.7 牛大力對·OH自由基的清除作用

反應(yīng)體系包含100μmol/L抗壞血酸20μL，100μmol/LCuSO420μL，還原型細胞色素C（II）注射液40μL，再加入提取物或者PBS（PH7.4，0.15mol/L）緩沖液20μL，PBS緩沖液1.9mL，混勻后在37℃水浴1 h，取出后于分光光度計上測定550 nm處的吸光度。

式中：Fo為貯備液的熒光值；Fx為貯備液+樣品的熒光值。

1.8 牛大力對二苯代苦味肼基自由基（DPPH·）清除作用

向2.5mL 6.5×10-5mol/lDPPH·溶液中加入0.5mL的樣品溶液，空白對照用等量雙蒸水代替，總體積3mL，混勻，室溫下封閉反應(yīng)15min后測定在517 nm波長的測吸光度Ai。每一吸光度平行測3次，取其平均值，DPPH·清除率計算式：

式中：Ai為2.5mL 6.5×10-5mol/LDPPH乙醇溶液與0.5mL試樣混合液在517 nm處吸光值；Aj為2.5mL乙醇與0.5mL試樣混合液在517 nm處吸光值；A0為2.5mL 6.5×10-5mol/LDPPH乙醇溶液與0.5mL雙蒸水混合液在517 nm處吸光值[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛大力多糖的純化

牛大力多糖通過凝膠柱的分離純化結(jié)果見圖1。

圖1 凝膠柱層析法純化牛大力多糖Fig.1 Elution profile of crude polysaccharide on Sephadex G-75

圖1顯示，經(jīng)過Sephadex G-75葡聚糖凝膠柱分離純化后，洗脫曲線圖有兩個多糖峰，可見牛大力多糖（polysaccharide of Millettia Speciosa Champ.，MSP）含有2個不同分子量范圍的多糖。其中，先洗脫下來的多糖峰的總糖含量較高，并且為一對稱峰。洗脫液經(jīng)透析、凍干后得純化多糖，命名為MSP-1。

旋光度的測定，稱取多糖組分（MSP-1）0.2mg，蒸餾水溶解并定容至2mL，用WZZ-1型自動指示旋光儀于室溫（26℃）下測定多糖旋光度，以蒸餾水為參照調(diào)零。通過測定MSP-1旋光度為-15°。

2.2 牛大力多糖的結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 牛大力的元素分析

牛大力的元素分析結(jié)果見表1。

表1 ICP-AES測定牛大力主要的元素含量Table1 ICP-AES analysis of the element of Millettia Speciosa Champ

如表1所示，本研究測定了牛大力切片中的19種元素，約占1.139%。其中Ca、K、Mg、Al、Fe和Mn等含量較為豐富，同時其含有豐富的微量元素，約占0.1271%。重金屬砷、汞、鉛、鎘、鉻等微量元素在體內(nèi)蓄積至一定量時可引起免疫系統(tǒng)和多種功能損害[8]?！端幱弥参锛爸苿┻M出口綠色行業(yè)標準》中對重金屬的限量指標（mg/kg）：鉛（Pb）≤5.0、鎘（Cd）≤0.3、砷（As）≤2.0。本研究藥材中重金屬均符合標準。

2.2.2 紅外光譜分析

牛大力多糖的紅外圖譜見圖2。

MSP-1紅外光譜見圖2，3 304 cm-1附近的強圓底峰形是分子間或分子內(nèi)的O－H伸縮振動峰，表明其存在羥基；2 927 cm-1的小尖峰為C－H（－CH2）伸縮振動峰；1 764 cm-1處有C=O伸縮振動的吸收峰；1236 cm-1、1 332 cm-1的吸收峰是C－H的彎曲振動，這些吸收峰顯示MSP-1具有多糖的特征。1 017 cm-1和1 077 cm-1的強吸收峰是C－O－C和C－OH的彎曲振動峰，表面此多糖為吡喃糖，832cm-1處為α－吡喃環(huán)C－H彎曲振動特征峰，755 cm-1處為吡喃糖對稱環(huán)伸縮振動，表面糖苷鍵為α－型糖苷鍵。結(jié)果說明MSP-1為α－型吡喃多糖。

圖2 牛大力多糖MSP-1紅外光譜Fig.2 The IR spectrum of MSP-1

2.2.4 離子色譜分析

通過離子色譜來分析牛大力多糖的組成，結(jié)果見圖3。

圖3 離子色譜測定牛大力多糖的單糖組成Fig.3 IC analysis of the complete hydrolysis of polysaccharide

圖3實驗結(jié)果所示，牛大力多糖MSP-1主要由葡萄糖和果糖組成，此外還有少量的鼠李糖、半乳糖、及甘露糖。

3 牛大力多糖體外抗氧化活性

3.1 抗脂質(zhì)過氧化作用

牛大力多糖的抗脂質(zhì)過氧化作用的結(jié)果見圖4。

圖4 抗脂質(zhì)過氧化作用Fig.4 The inhibition of lipid-peroxidation

由圖4可以看出，與不同濃度的牛大力提取物共同孵育，肝勻漿內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的含量均有不同程度的降低，表明牛大力提取物均能有效抑制肝勻漿的自發(fā)性脂質(zhì)過氧化作用，且抑制作用具有一定的量效關(guān)系。以IC50來評價抗脂質(zhì)過氧化的能力：VC＞牛大力水提物＞牛大力醇沉物＞牛大力粗多糖。

3.2 對·OH自由基的清除作用

牛大力多糖對·OH自由基的清除作用的結(jié)果見圖5。

圖5 牛大力提取物對羥基自由基的清除作用Fig.5 Oxhydryl scavenging activity of extraction from Millettia Speciosa Champ

圖5結(jié)果顯示，牛大力的提取物均能有效清除·OH自由基，并呈量效關(guān)系。VC在0.25μg/mL時就達到82%，之后保持恒定。而牛大力提取物對·OH清除率開始較低，隨著濃度的增大，清除率提高；在濃度為0.2μg/mL時，牛大力水提物的清除率達50%，牛大力醇沉物的清除率為35%，牛大力多糖的清除率為23%，可見清除能力依次為：VC＞牛大力水提物＞牛大力醇沉物＞牛大力粗多糖。

3.3 對DPPH·自由基的清除作用

牛大力多糖對DPPH·自由基的清除作用的結(jié)果見圖6。

圖6 牛大力提取物對DPPH·自由基的清除作用Fig.6 DPPH·scavenging activity of extraction from Millettia Speciosa Champ

VC、牛大力水提物、牛大力醇沉物和牛大力多糖對DPPH·自由基均具有一定的清除作用（圖6），清除率呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。VC對DPPH·自由基清除率最高達到89%，而牛大力水提物、牛大力醇沉物和牛大力多糖對DPPH·自由基清除率分別為82%、62%、 53%，可見清除能力如下：維生素C＞牛大力水提物＞牛大力醇沉物＞牛大力粗多糖。

4 討論

植物多糖以其廣泛的治療作用和極低的細胞毒性，在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域具有寬廣的應(yīng)用前景。從天然植物中尋找新的清除體內(nèi)自由基的抗氧化劑成為了現(xiàn)代醫(yī)藥和功能食品行業(yè)發(fā)展的新方向。研究多糖及其衍生物的抗氧化作用，開發(fā)新的天然抗氧化劑，具有重要的現(xiàn)實意義。

本研究提取了牛大力多糖，采用Sephadex G-75葡聚糖凝膠柱分離純化得到一種多糖MSP-1，利用紅外光譜和離子色譜對其結(jié)構(gòu)和單糖組成進行了初步分析，確定其由鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖和果糖組成。通過測定牛大力元素含量，可知其Ca、K、Mg、Al、Fe和Mn等礦物質(zhì)元素含量高，同時含有豐富的微量元素Zn、Mn，這與其發(fā)揮抗炎、調(diào)節(jié)免疫的功能相關(guān)。研究了VC、牛大力水提物、牛大力醇沉物和牛大力粗多糖對自由基的清除能力和抗氧化活性。結(jié)果表明，四者的抗脂質(zhì)過氧化作用和對·OH自由基和DPPH·自由基清除能力：VC＞牛大力水提物＞牛大力醇沉物＞牛大力多糖?？梢娝嵛镉休^大的清除能力，這與牛大力提取物具有多種組分相關(guān)，特別是含有黃酮，異黃酮等組分，這些組分具有清除自由基和抗氧化作用。本研究可為牛大力多糖在抗氧化和抗衰老功能性食品中的應(yīng)用開發(fā)提供參考。

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Purified and Antioxidant Activity of Water-soluble Polysaccharide from Millettia Speciosa Champ

CHEN Rong-rong，PU Han-lin*，JIANG Hua，ZHENG Yuan-sheng
（Department of Cell biology，Jinan University，Guangzhou 510632，Guangdong，China）

A water-soluble polysaccharide （MSP-1） was obtained from Millettia Speciosa Champ. by hot water extraction， ethanol precipitation， trifluoroacetic acid method removing proteins and gel permeation chromatography. The structure of MSP-1 was characterized by Ion Chromatography and FTIR spectroscopy. The results showed that MSP -1 was mainly composed of rhamnose， galactose， glucose， mannose and fructose.Additionally， Antioxidant activity in vitro of different extractions from Millettia Speciosa Champ were studied by testing the scavenging effects of·OH， DPPH·and lipid peroxidantion. The results showed that three parts can effectively remove·OH， DPPH·， lipid peroxidantion and was dose -effect relationship. The order of radical scavenging activity was as follow： water extraction＞ethanol precipitation＞crude polysaccharide.

Millettia Speciosa Champ；polysaccharide；antioxidant activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.03.009

2012-07-12

陳蓉蓉（1987—），女（漢），在讀碩士，主要從事天然產(chǎn)物研究。

*通信作者：蒲含林（1964—），男（漢），副研究員，研究方向：天然產(chǎn)物研究。