劉憲夫，孫利芹，王長海

（1.南京農(nóng)業(yè)大學海洋生物學重點實驗室，江蘇南京210095；2.煙臺大學生命科學學院，山東煙臺264005）

小球藻油脂不同提取方法的比較

劉憲夫1，2，孫利芹2，王長海1，*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學海洋生物學重點實驗室，江蘇南京210095；2.煙臺大學生命科學學院，山東煙臺264005）

小球藻因其高的油脂含量和生長特性成為生物柴油研究的重要微藻資源之一，而研究表明油脂提取方法的不同通常直接關(guān)系到生物柴油的質(zhì)量。研究了索氏提取、有機溶劑浸提兩種油脂提取方法及不同細胞前處理方法對小球藻油脂提取率的影響，并比較了不同方法提取的油脂組成成分差異。結(jié)果表明，在不同的提取方法中，油脂得率、油脂中中長鏈脂肪酸（C14-C22）占總脂肪酸比例及脂肪酸提取純度各不相同。其中，氯仿-甲醇浸提法是一種簡便快捷高效的油脂提取方法，其油脂得率為（22.40±0.89）%，中長鏈脂肪酸（C14-C22）比例為85.84%；索氏提取法中無水乙醇作為提取溶劑獲得的得率最高為（24.37±0.21）%，石油醚提取的油脂脂肪酸成分最多，達到10種。

小球藻；油脂提?。粴庀嗌V

隨著全球石化燃料的日益枯竭，可再生資源的尋求顯得尤為重要。油脂是一類重要的可再生資源，微藻油脂與植物油脂相似，可代替植物油脂，還可以用來生產(chǎn)生物柴油。微藻的能源化利用有望成為“后石油時代”破解能源危機的一把金鑰匙[1-2]。近年來，從微藻中制備生物柴油的研究也引起了我國政府、科研機構(gòu)和企業(yè)的重視，被列為科技部“973”和“863”計劃的重點項目之一。目前對產(chǎn)油藻的研究主要有葡萄藻（Botryococcus braunii）、小球藻（Chlorella pyrenoidosa）等[3]。其中以小球藻為原料生產(chǎn)的生物質(zhì)燃油非常宜于柴油發(fā)動機的燃燒，同時由于小球藻的高含油量和生長迅速的特征，因此被認為是最有工業(yè)化潛力的生物柴油的重要生產(chǎn)藻株之一[4-5]。目前從微藻中提取油脂的方法主要有碾磨法、酸水解法、索氏抽提法和加熱回流法等[6]。早期研究表明[7]，對于相同的原料采用的提取方法不同，所獲得的油脂提取率是不同的。生物柴油通常是指由中長鏈脂肪酸形成的單烷基酯，即脂肪酸甲酯（C14-C22）組成的[8]。因此探討油脂提取方法對油脂脂肪酸組成的影響，對優(yōu)質(zhì)微藻生物柴油的制備有重要意義。本研究即在上述背景下，以小球藻為材料，考察了不同提取方法（索氏提取法和有機溶劑浸提法）及小球藻細胞不同前處理方法對油脂提取率和脂肪酸組成的影響，旨在尋找到一種油脂得率較高、可以制備優(yōu)質(zhì)生物柴油的油脂提取方法，為微藻能源化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小球藻（Chlorella pynenoidosa），原種由中國海洋大學微藻種質(zhì)庫（MACC）提供，經(jīng)進一步分離純化后由煙臺大學海洋生化工程研究所保存。

石油醚、乙醚、丙酮、正己烷、乙酸乙酯、無水乙醇、異丙醇、環(huán)己烷、氯仿、甲醇、甲苯均為分析純。脂肪酸甲酯標準品為Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 小球藻的培養(yǎng)與采收

小球藻培養(yǎng)用海水取自煙臺大學近海，經(jīng)過濾、高溫滅菌后使用。采用f/2培養(yǎng)液，室溫（22±1）℃，光照2 500 lx（日光燈），連續(xù)充氣培養(yǎng)。在細胞生長至指數(shù)生長末期（培養(yǎng)至7 d～8 d左右）離心采收，低溫烘干封口于干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 油脂提取方法

1.2.2.1 索氏提取法

準確稱取小球藻藻粉0.2 g放入濾紙包中，稱重得m1，放入索氏提取器中。分別選用石油醚、乙醚、丙酮、正己烷、乙酸乙酯、無水乙醇、異丙醇、環(huán)己烷8種單一有機溶劑進行提取，直至提取到無色，取出濾紙包烘干至恒重，稱重得m2，m1與m2之差即為油脂重量，按公式1計算油脂得率。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)有機溶劑得油脂備用。每個實驗重復3次。

1.2.2.2 有機溶劑浸提法

準確稱取小球藻藻粉m10.2 g放入50mL離心管中，分別采用氯仿-甲醇（2∶1）、丙酮-石油醚（1∶1）、乙醚-石油醚（1∶1）三種溶劑組合進行提取，3 h后離心轉(zhuǎn)移上層有機溶劑，重新加入溶劑再次抽提，重復三次。小球藻藻粉殘渣烘干至恒重，稱重得m2，m1與m2之差即為油脂重量，按公式1計算油脂得率。分別合并有機溶劑相并旋干得油脂備用。每個實驗重復3次。

1.2.2.3 小球藻細胞前處理方法[9]

酸熱法：準確稱取小球藻藻粉m10.2g，加入4mol/L鹽酸，震蕩混勻，室溫下放置30min，，然后沸水浴3min，立即放于-20℃速冷。

超聲法：準確稱取小球藻藻粉m10.2 g，加入10mL蒸餾水振蕩混勻后，超聲處理，功率200W，全程時間20min，其中脈沖時間10 s，間隔時間4 s。

酸熱耦合超聲波法：準確稱取小球藻藻粉m10.2g，先按上述酸熱法處理，后再按上述超聲法處理。

上述三種方法處理后的小球藻藻粉采用氯仿-甲醇（2∶1）進行油脂浸提，浸提方法同1.2.2.2。

1.2.3 油脂脂肪酸組成分析

1.2.3.1 樣品甲酯化

精確稱取5mg油脂提取物中加入帶塞試管中，加入3mL石油醚∶甲苯（1∶1）的混合溶劑，待油脂溶解，加入3mL 0.4mol/L的KOH-CH30H溶液，混勻，室溫靜置10min，加蒸餾水至瓶頸部，靜置，取上層液分析[10]。

1.2.3.2 氣相色譜分析

采用島津GC-2010氣相色譜儀，氫火焰離子化檢測器，DB-5毛細管柱（30m×0.25mm×0.25μm）。升溫程序：150℃保留1min，以10℃/min升至250℃，保留40min。進樣口、檢測器的溫度為290℃。載氣為高純度氮氣，流速為9.6mL/min，進樣量0.8μL。以面積歸一化法計算各脂肪酸組分的相對含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 油脂提取方法比較

2.1.1 不同提取方法下小球藻油脂得率的比較

表1為采用不同方法提取小球藻油脂的油脂得率。

表1 索氏提取法、浸提法油脂得率Table1 The extraction efficiency of Soxhlet extraction and extract approach

從表1中可以看出在索氏提取法中，無水乙醇的提取效果最好，油脂提取得率達到24.37%，這和馬帥等[7]運用乙醇法對微藻油脂提取的結(jié)果相似。其次為乙酸乙酯、異丙醇。環(huán)己烷的油脂得率也達到了15.08%，油脂提取得率較小的是正己烷和石油醚。實驗中采用的不同溶劑提取油脂實驗重復率都較好，說明各有機相對小球藻中粗脂的提取較穩(wěn)定。不同溶劑提取的油脂的顏色不同，石油醚、正己烷提取的油脂呈現(xiàn)黃色，油脂提取率較大的無水乙醇、乙酸乙酯等油脂呈現(xiàn)綠色，可能因為有些溶劑對色素等提取效果較好造成的，因而采用不同的溶劑，油脂提取得率相差較大。

采用混合溶劑浸提法提取小球藻油脂結(jié)果（表1）顯示，氯仿-甲醇的提取效果最好，提取率達到22.40%。丙酮-石油醚提取效果次之，油脂提取率為17.81%。乙醚-石油醚提取油脂得率較差，僅為12.61%。

與索氏提取方法相比較，氯仿-甲醇浸提法所獲得的油脂提取率（22.4%）僅次于索氏提取中的無水乙醇，與乙酸乙酯提取率相當，但這種現(xiàn)象并沒有發(fā)生在乙醚-石油醚、丙酮-石油醚混合溶劑中。但由于索氏提取法耗時較長，操作繁瑣，而且需要的樣品量較大，因而不適用于對微藻細胞中的油脂含量實行在線監(jiān)測。而溶劑浸提法中，氯仿-甲醇的提取率高，且操作步驟相對簡單，適用于微藻生長過程中對其細胞油脂含量實現(xiàn)在線監(jiān)測。

2.1.2 不同小球藻細胞前處理方法的比較

表2為小球藻細胞經(jīng)不同前處理后采用氯仿-甲醇浸提的結(jié)果。

表2 不同小球藻細胞前處理方法的比較Table2 The comparison of different Pre-treatment methods on Chlorella cells

數(shù)據(jù)分析顯示：對小球藻細胞經(jīng)過前破碎處理，小球藻的油脂得率有一個提升，但提升效果并不是很明顯。其中酸熱超聲耦合時對油脂的提取效果最好，油脂得率為24.58%。超聲法比酸熱法油脂得率稍高。

2.2 油脂脂肪酸組成分析

2.2.1 不同油脂提取方法中油脂脂肪酸組成分析

兩種提取方法下提取的小球藻粗油脂脂肪酸組成分析見表3和表4。

由數(shù)據(jù)分析可知：不同提取方法下小球藻油脂的脂肪酸組成差別不是很大，不同方法提取的小球藻的油脂都主要由C16、C18、C20脂肪酸組成。C16脂肪酸中C16∶0較多的存在在，占總脂肪酸的12.04%～26.92%，C16∶1占總脂肪酸的5%左右。C18脂肪酸中C18∶0和C18∶1含量較多，綠藻綱微藻最主要的脂肪酸C18∶3含量很少，有的提取方法甚至都沒有檢測到。在C20脂肪酸中小球藻屬中藻類不應具有的二十碳五烯酸（C20∶5）卻占有很大比例，占到總脂肪酸的5.53%～26.01%，這與馮福應等[11]的研究結(jié)果比較相似，與蔣敏霞[12]等研究結(jié)果有所不同，這可能與小球藻的藻種及培養(yǎng)條件不同有關(guān)。C8-C12等短鏈脂肪酸以及C22、C24長鏈脂肪酸含量很少，有的提取方法甚至沒有檢測到。

表3 索氏提取法提取油脂脂肪酸組成分析（占總脂肪酸含量%）Table3 The fatty acid composition analysis of the lipin cxtracted from Soxhlet extraction

表4 浸提法和藻細胞不同前處理提取油脂的脂肪酸組成分析（占總脂肪酸含量%）Table4 The fatty acid composition analysis of the lipin from extract approach and different Pre-treatment methods on Chlorella cells

續(xù)表4 浸提法和藻細胞不同前處理提取油脂的脂肪酸組成分析（占總脂肪酸含量%）Continue table4 The fatty acid composition analysis of the lipin from extract approach and different Pre-treatment methods on Chlorella cells

在提取方法相同溶劑不同的情況下，提取獲得的油脂組成也有所差別。在索氏提取法中，正己烷、石油醚提取的脂肪酸成分較多，分別為9種和10種，異丙醇、丙酮提取物中脂肪酸的成分比較少，都為5種，其它溶劑提取物中脂肪酸的成分為6種～8種。在浸提法中，乙醚-石油醚提取物中有最多的9種脂肪酸成分，超聲處理、酸熱處理、酸熱耦合超聲處理提取的油脂中脂肪酸成分較少，均為6種，而未經(jīng)處理、丙酮-石油醚提取物中都含有8種脂肪酸成分。綜上，在索氏提取法和浸提法中，只要單一或者混合提取溶劑中含有石油醚，提取的油脂中就含有較多脂肪酸成分，與其它有機溶劑提取的油脂相比，多了C10∶0、C12∶0兩種或者其中一種脂肪酸。造成這種結(jié)果的原因可能與石油醚的極性小，酯類、醇類的極性大有關(guān)。生物柴油是由中長鏈脂肪酸甲酯（C14-C22）組成的，石油醚作為提取溶劑雖然提取出較多的脂肪酸成分，但提取出的短鏈脂肪酸（C10、C12）并不利于生物柴油的生產(chǎn)。

不同方法和提取溶劑所提取的油脂中各脂肪酸所占總脂肪酸比例有所差別。在索氏提取法中，正己烷作為提取溶劑，C8∶0、C22∶0、C24∶0的占總脂肪酸比例最高，C16∶1、C18∶0、C18∶1、C20∶5占總脂肪酸最高比例分別出現(xiàn)在丙酮、異丙醇、石油醚、乙酸乙酯作為提取溶劑的方法中，比例分別達到：5.79%、8.43%、32.83%、26.01%。在浸提法中，C10∶0、C12∶0、C18∶3在乙醚-石油醚作為提取溶劑提取的油脂中比例最高，C14∶0、C16∶0占總脂肪酸最高比例分別出現(xiàn)在丙酮-石油醚、酸熱處理方法中，比例分別達到：4.30%、26.92%?？梢姼鶕?jù)所需要的脂肪酸可選擇不同的油脂提取方法。

2.2.2 不同油脂提取方法中油脂中長鏈脂肪酸（C14-C22）組成分析

由于生物柴油通常是指由中長鏈脂肪酸形成的單烷基酯，即脂肪酸甲酯（C14-C22）組成的，因此提取的油脂中中長鏈脂肪酸（C14-C22）占總脂肪酸的比例關(guān)系到生物柴油的燃燒性能。由表3和表4中可以看出：在不同提取方法下中長鏈脂肪酸（C14-C22）占總脂肪酸的比例可達到68.4%～91.08%，中長鏈脂肪酸（C14-C22）比例較高，這說明用小球藻油脂制備生物柴油的思路是正確的。在索氏提取法中，中長鏈脂肪酸（C14-C22）比例可達到69.35%～87.82%。其中異丙醇作為提取溶劑的比例最高為87.82%，無水乙醇、乙酸乙酯、石油醚次之，乙醚最低，為69.35%。在浸提法中，中長鏈脂肪酸（C14-C22）比例可達到68.4%～91.08%。藻粉經(jīng)過酸熱處理后最高，為91.08%，未經(jīng)處理比例次之，達到85.84%。乙醚-石油醚作為浸提溶劑比例最低，僅為68.4%。綜上，在索氏提取法異丙醇作為提取溶劑以及浸提法中藻粉未經(jīng)處理、藻粉酸熱處理方法下，中長鏈脂肪酸（C14-C22）比例都比較高，都高于85.8%?？梢?，藻粉未經(jīng)處理，采用氯仿-甲醇作為提取溶劑的浸提法所提取的油脂是適用于生物柴油生產(chǎn)的。

2.2.3 不同油脂提取方法粗提物中脂肪酸純度分析

由于對不同提取方法提取的油脂進行甲酯化時稱取的油脂重量相同，因此，進行氣相色譜分析后，脂肪酸峰面積大小可代表單位重量粗油脂中脂肪酸含量的差異。由表3和表4中，在索氏提取法中，正己烷、無水乙醇、石油醚等作為提取溶劑時峰面積較大，表明這些方法提取的粗油脂中所檢測脂肪酸的含量較高。在浸提法中，小球藻藻粉未經(jīng)前處理，粗提物油脂中所檢測脂肪酸的含量較高，而經(jīng)過酸熱、超聲、酸熱耦合超聲處理后，粗油脂中所檢測脂肪酸的含量均有明顯下降。乙醚-石油醚、丙酮-石油醚均沒有采用氯仿-甲醇作為提取溶劑檢測出的脂肪酸的含量高。綜上，浸提法中，小球藻不經(jīng)處理，采用氯仿-甲醇作為提取溶劑所提取的粗油脂中含有較多含量的脂肪酸。

3 結(jié)論

微藻油脂的提取過程對生物柴油的生產(chǎn)非常重要。不同方法提取微藻油脂需同時考慮到兩個因素：油脂得率和油脂脂肪酸成分，因為這關(guān)系到生物柴油的產(chǎn)量和燃燒性能。在索氏提取法中無水乙醇作為提取溶劑提取油脂，雖然油脂得率較氯仿-甲醇稍高，但中長鏈脂肪酸（C14-C22）比例不及氯仿-甲醇直接浸提法提取的油脂。另外考慮到索氏提取法耗時較長，操作繁瑣，而且需要的樣品量較大。氯仿-甲醇浸提法所獲得的油脂提取率雖次于索氏提取中法中的無水乙醇，但提取物經(jīng)過氣相分析發(fā)現(xiàn)：該方法提取的油脂脂肪酸成分、中長鏈脂肪酸（C14-C22）比例、粗提物中脂肪酸純度均非常適于生產(chǎn)生物柴油。而小球藻藻粉經(jīng)過不同前處理與未經(jīng)處理相比，油脂得率沒有明顯提高，粗提物中脂肪酸純度反而有了明顯降低。綜上，結(jié)合不同油脂提取方法的油脂得率及脂肪酸組成，氯仿-甲醇直接浸提法是一種適于生物柴油生產(chǎn)的小球藻油脂提取方法。

[1]楊勛,劉平懷,郝宗娣,等.富油微藻Monoraphidium sp．的分離及其油脂提取工藝研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2011,39(32):19988-19990, 20124

[2]高春芳,余世實,吳慶余.微藻生物柴油的發(fā)展[J].生物學通報, 2011,46(6):1-5

[3]王金娜,嚴小軍,周成旭,等.產(chǎn)油微藻的篩選及中性脂動態(tài)積累過程的檢測[J].生物物理學報,2010,16(6):472-480

[4]Scragg A H,Morrison J,Shales SW.The use of a fuel containing Chlorella vulgaris in a diesel engine[J].Enzyme and Microbial Technology,2003,33(7):884-889

[5]張學成,時艷俠,孟振.小球藻紫外線誘變及高含油藻株篩選[J].中國海洋大學學報,2007,37(5):749-753

[6]Lee S J,Yoon B D,Oh H M.Rapid method for the determination of lipid from the green alga Botryococcus braunii[J].Biotechnol,1998, 12(7):553-556

[7]馬帥,付莉莉,汪萌,等.從微藻中提取粗脂的方法比較[J].中國油脂,2010,35(5):77-79

[8]盧麗娜,孫利芹,田煥玲,等.32株海洋微藻總脂含量及其脂肪酸組成的研究[J].中國油脂,2009,34(11):68-73

[9]王敏,李市場,劉紅霞,等.黏紅酵母Rhodotorula glutinis微生物油脂提取工藝研究[J]中國糧油學報,2010,25(6):71-75

[10]王麗新,高云,高偉佳.黑甜玉米油脂肪酸的氣相色譜分析[J].食品科學,2007,28(1):237-238

[11]馮福應,楊文,林偉,等.海洋微藻Chlorella sp.1061的脂類特征與分類探討[J].海洋與湖沼,2004,35(5):453-458

[12]蔣霞敏,鄭亦周.14種微藻總脂含量和脂肪酸組成研究[J].水生生物學報,2003,27(3):243-247

The Comparison of Different Extraction Method of Lipin from Chlorella

LIU Xian-fu1，2，SUN Li-qin2，WANG Chang-hai1，*
（1.Nanjing Agricultural University Marine Biology Key Laboratory，Nanjing210095，Jiangsu，China；2.Shandong Yantai University Marine Institute，Yantai264005，Shandong，China）

Chlorella has become one of the important microalgae resources for biodiesel research because of its high fat content and growth characteristics，and there is a lot of research showing that the lipin extraction method is usually directly related to the quality of biodiesel.We investigate the Soxhlet extraction and organic solvent extraction of lipin extraction method and the influence of extraction rate of chlorella lipin extracted by different pre-cell approach methods，and compared the composition differences of lipin extracted by different methods.The results show that the different extraction methods result in different lipin yield，different ratio of long-chain fatty acids（C14-C22）to total fatty acids and different extract purity of fatty acids.Among them，chloroform-methanol extraction method is a simple and efficient method of lipin extraction，with lipin yield of（22.40±0.89）%and 85.84%long chain fatty acids（C14-C22）；In Soxhlet extraction，we get the highest yield rate of（24.37±0.21）% with Anhydrous alcohol as an extraction solvent，and we get up to10 kinds of fatty acids with petroleum ether as an extraction solvent.

chlorella；oil extracted；gas chromatography

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.03.006

2012-09-14

“十二五”支撐計劃（2011BAD14B01）

劉憲夫（1987—），男（漢），碩士生，主要從事微藻生物能源方面的而研究。

*