李秋紅，阿納斯，李曰強(qiáng)，尹玉建

（西王集團(tuán)有限公司，山東濱州256209）

雙酶法生產(chǎn)葡萄糖酸鋅的新工藝

李秋紅，阿納斯*，李曰強(qiáng)，尹玉建

（西王集團(tuán)有限公司，山東濱州256209）

介紹一種雙酶法生產(chǎn)葡萄糖酸鋅的新工藝。新工藝采用葡萄糖作為主要原料，葡萄糖氧化酶在過(guò)氧化氫酶的協(xié)同作用下將葡萄糖氧化為葡萄糖酸，同時(shí)流加一定濃度的氧化鋅懸液進(jìn)行中和，最終生成葡萄糖酸鋅。研究葡萄糖濃度、pH、溫度、空氣流量對(duì)葡萄糖酸鋅合成工藝的影響，并對(duì)葡萄糖酸鋅結(jié)晶的最適宜條件進(jìn)行初步研究。通過(guò)本工藝生產(chǎn)的葡萄糖酸鋅純度可達(dá)99.6%，可用于食品、醫(yī)藥、飼料、化妝品等諸多領(lǐng)域。

葡萄糖；葡萄糖氧化酶；過(guò)氧化氫酶；新工藝

鋅是微量元素的一種，具有促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育，改善味覺(jué)的作用，是一種必需微量元素。鋅缺乏時(shí)會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)與智力發(fā)育低于正常，味覺(jué)、嗅覺(jué)差，厭食[1]。缺鋅時(shí)要及時(shí)補(bǔ)充，以前多采用硫酸鋅補(bǔ)鋅，但是硫酸鋅對(duì)胃腸道刺激作用大，容易引起惡心嘔吐等現(xiàn)象，因此，硫酸鋅現(xiàn)在逐漸被葡萄糖酸鋅所代替，葡萄糖酸鋅是弱酸弱堿鹽，對(duì)腸道刺激遠(yuǎn)比硫酸鋅小，且進(jìn)入腸道以后容易吸收，利用率高，1986年被列為150種有發(fā)展前途的藥品之一，是目前抗缺鋅癥的首選藥物[2]，在臨床上有很大的應(yīng)用。

葡萄糖酸鋅不僅用于醫(yī)藥方面，還廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)，如葡萄糖酸鋅幼兒飲用水、葡萄糖酸鋅奶飲料、葡萄糖酸鋅果凍等，將葡萄糖酸鋅添加到各種食品中制成保健食品，用食補(bǔ)代替藥補(bǔ)。隨著人們生活水平的提高，人們“有病治病，無(wú)病健身”的思想，這無(wú)疑為葡萄糖酸鋅提供了更為廣泛的市場(chǎng)。

另外，葡萄糖酸鋅還可以添加在飼料中作為動(dòng)物的補(bǔ)鋅制劑，還可以添加在化妝品中預(yù)防和治療由于缺鋅引起的唑瘡。

由于葡萄糖酸鋅在各個(gè)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，它的制備研究得到越來(lái)越多的關(guān)注。據(jù)文獻(xiàn)[3-6]記載，葡萄糖酸鋅的合成多以葡萄糖酸鈣和濃硫酸為原料，制取葡萄糖酸，然后經(jīng)過(guò)純化和氧化鋅發(fā)生復(fù)分解反應(yīng)制取葡萄糖酸鋅。這種工藝具有原料不易獲取，操作危險(xiǎn)，產(chǎn)品純度低等缺陷。雙酶法生產(chǎn)葡萄糖酸鋅的新工藝可以分為兩個(gè)主要工段，即葡萄糖酸鋅的制備工段和葡萄糖酸鋅的結(jié)晶工段。葡萄糖酸鋅的制備工段，最重要的是酶促反應(yīng)能夠平穩(wěn)快速地進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)中最直觀的反映就是反應(yīng)周期。新工藝通過(guò)研究葡萄糖初始濃度、溫度、pH和通風(fēng)量對(duì)酶促反應(yīng)周期的影響，優(yōu)化以上工藝條件，并通過(guò)研究結(jié)晶時(shí)葡萄糖酸鋅溶液的干物濃度對(duì)結(jié)晶的影響和溫度對(duì)結(jié)晶產(chǎn)率的影響，優(yōu)化葡萄糖酸鋅結(jié)晶濃度和結(jié)晶溫度。

1 材料與方法

1.1 材料

葡萄糖氧化酶GC199、過(guò)氧化氫酶CA1000L：杰能科生物工程有限公司；結(jié)晶葡萄糖：口服級(jí)，山東西王糖業(yè)有限公司；氧化鋅：分析純，萊陽(yáng)經(jīng)濟(jì)開(kāi)發(fā)區(qū)精細(xì)化工廠。

1.2 儀器

FMG-10L不銹鋼發(fā)酵罐：南京金昶電子；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵：鞏義市英峪予華儀器廠；RE52CS-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮；B-260恒溫水浴鍋：上海亞榮；GZX-9070MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱：上海博訊；JJ-1定時(shí)電動(dòng)攪拌器：江蘇中大儀器；DT-500電子天平：常熟市金羊天平儀器廠；BCD-551WSY雙開(kāi)門(mén)冰箱：青島海爾。

1.3 方法原理

葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下氧化為葡萄糖酸，過(guò)程中產(chǎn)生過(guò)氧化氫，過(guò)氧化氫有很強(qiáng)的氧化性，對(duì)葡萄糖氧化酶有一定的毒害作用，過(guò)氧化氫酶的加入就是為了迅速分解過(guò)氧化氫，使過(guò)氧化氫分解為水和氧氣，使得葡萄糖氧化酶繼續(xù)作用，并可以補(bǔ)充部分的氧氣，使得氧化反應(yīng)得以繼續(xù)進(jìn)行。反應(yīng)過(guò)程中向反應(yīng)體系中緩慢加入一定濃度的氧化鋅懸液，以維持體系正常的pH環(huán)境，保護(hù)酶的活性，并保證葡萄糖酸鋅的最終生成。

1.4 方法

1.4.1 葡萄糖酸鋅的制備

配制300 g/L的葡萄糖溶液6 000mL，置于不銹鋼發(fā)酵罐中，設(shè)定酶反應(yīng)溫度為35℃，反應(yīng)過(guò)程中流加100 g/L氧化鋅的懸液，調(diào)節(jié)控制pH在6.0左右，先后加入過(guò)氧化氫酶和葡萄糖氧化酶。通入無(wú)菌空氣，控制通氣量為5 L/min，當(dāng)反應(yīng)液中還原糖濃度降為0時(shí)，結(jié)束反應(yīng)。

將反應(yīng)液升溫至95℃滅酶，加入活性炭脫色，過(guò)濾得濾液，在真空度為0.095MPa條件下，60℃蒸發(fā)濃縮至干物濃度為30%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）停止。冰水浴冷卻結(jié)晶。真空抽濾得葡萄糖酸鋅晶體。所得晶體在80℃下，烘干4 h，得成品葡萄糖酸鋅（實(shí)驗(yàn)流程見(jiàn)圖1）。將母液真空濃縮至干物濃度為30%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）進(jìn)行二次結(jié)晶，干燥后得葡萄糖酸鋅。兩次結(jié)晶的收率為98.5%，所得葡萄糖酸鋅純度為99.6%。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程Fig.1 Experiment process

1.4.2 葡萄糖初始濃度對(duì)酶促反應(yīng)周期的影響

分別配制葡萄糖初始濃度為260、280、300、320、340、360、380、400 g/L的反應(yīng)液，其他反應(yīng)條件保持不變，按照1.4.1的過(guò)程充分反應(yīng)，當(dāng)反應(yīng)液中葡萄糖濃度為0時(shí)反應(yīng)結(jié)束，記錄反應(yīng)周期。

1.4.3 pH對(duì)酶促反應(yīng)周期的影響

配制葡萄糖初始濃度為300 g/L，反應(yīng)過(guò)程中流加100 g/L的氧化鋅懸液控制反應(yīng)體系的pH分別為3、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8，其他反應(yīng)條件保持不變，按照1.4.1的過(guò)程充分反應(yīng)，當(dāng)反應(yīng)液中葡萄糖濃度為0時(shí)反應(yīng)結(jié)束，記錄反應(yīng)周期。

1.4.4 溫度對(duì)酶促反應(yīng)周期的影響

酶促反應(yīng)溫度分別控制為30、35、40、45、50、55℃，其他反應(yīng)條件保持不變，按照1.4.1的過(guò)程充分反應(yīng)，當(dāng)反應(yīng)液中葡萄糖濃度為0時(shí)反應(yīng)結(jié)束，記錄反應(yīng)周期。

1.4.5 通氣量對(duì)酶促反應(yīng)周期的影響

控制通氣量分別為2、3、4、4.5、5、6、7、8 L/min，其他反應(yīng)條件保持不變，按照1.4.1的過(guò)程充分反應(yīng)，當(dāng)反應(yīng)液中葡萄糖濃度為0時(shí)反應(yīng)結(jié)束，記錄反應(yīng)周期。

1.4.6 葡萄糖酸鋅濃度對(duì)結(jié)晶的影響

將經(jīng)過(guò)酶促反應(yīng)制得的葡萄糖酸鋅濾液蒸發(fā)濃縮到干物濃度分別為20%、25%、30%、35%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）置于冰水浴中放置10 h，通過(guò)觀察不同干物濃度下的葡萄糖酸鋅濃縮液的結(jié)晶情況，優(yōu)化葡萄糖酸鋅濃縮液結(jié)晶時(shí)的濃度。

1.4.7 結(jié)晶溫度對(duì)葡萄糖酸鋅產(chǎn)率的影響

將酶促反應(yīng)獲得的反應(yīng)液升溫滅酶，加入活性炭脫色，過(guò)濾得濾液，60℃蒸發(fā)濃縮至干物濃度為30%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）停止。將濃縮液分別置于冰水浴中和室溫條件下冷卻結(jié)晶，稱取所得到的葡萄糖酸鋅成品的質(zhì)量，并分別計(jì)算一次結(jié)晶產(chǎn)率。通過(guò)比較不同溫度下葡萄糖酸鋅的產(chǎn)率優(yōu)化結(jié)晶溫度。

2 結(jié)果與討論

2.1 葡萄糖初始濃度對(duì)酶促反應(yīng)周期的影響

葡萄糖初始濃度對(duì)酶促反應(yīng)周期的影響見(jiàn)圖2。

圖2 葡萄糖初始濃度對(duì)反應(yīng)周期的影響Fig.2 Effect of glucose initial concentration

由圖2可知，當(dāng)葡萄糖初始濃度低于300 g/L時(shí)，隨著葡萄糖濃度的增加反應(yīng)周期成直線性增加，此時(shí)溶氧足夠，反應(yīng)周期與底物濃度成正比，即葡萄糖濃度越高，反應(yīng)周期越長(zhǎng)；當(dāng)葡萄糖初始濃度在300 g/L～340 g/L之間時(shí)，反應(yīng)會(huì)有一個(gè)較為快速穩(wěn)定的周期，此時(shí)的葡萄糖濃度和溶氧達(dá)到一種平衡，使得葡萄糖氧化酶和過(guò)氧化氫酶能夠充分發(fā)揮作用；當(dāng)葡萄糖初始濃度超過(guò)340 g/L時(shí)，反應(yīng)周期明顯加長(zhǎng)，這是因?yàn)槠咸烟菨舛冗^(guò)高，反應(yīng)體系溶氧降低，會(huì)降低葡萄糖氧化酶的活性，延緩反應(yīng)的進(jìn)行。但是，如果葡萄糖濃度低，設(shè)備的利用率不高，相應(yīng)的會(huì)增加生產(chǎn)成本。因此，選擇一個(gè)合適的葡萄糖濃度是十分必要的。生產(chǎn)上一般控制葡萄糖的初始濃度在300g/L～340g/L之間。

2.2 pH對(duì)酶促反應(yīng)周期的影響

pH在酶促反應(yīng)體系是一個(gè)重要的控制指標(biāo)，合適的pH，不僅會(huì)促進(jìn)反應(yīng)產(chǎn)物的生成，還是葡萄糖氧化酶和過(guò)氧化氫酶賴以存活和發(fā)揮促進(jìn)作用的重要條件。因此，合適的pH選擇至關(guān)重要。葡萄糖氧化酶[7]適宜的pH值范圍為3.5～6.5，過(guò)氧化氫酶適宜的pH范圍為4.0～8.0。結(jié)合葡萄糖氧化酶和過(guò)氧化氫酶要求的適宜pH，通過(guò)實(shí)驗(yàn)，考察了pH在3～8范圍內(nèi)的反應(yīng)周期的變化，結(jié)果如圖3。

圖3 pH對(duì)反應(yīng)周期的影響Fig.3 Effect of pH

由圖3可知，當(dāng)pH小于4時(shí)，pH偏低，酶促反應(yīng)基本不進(jìn)行；pH大于6.5時(shí)，隨pH的增加，體系環(huán)境越來(lái)越不適宜酶促反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)周期會(huì)相應(yīng)加長(zhǎng)；當(dāng)pH在5.5～6.5之間時(shí)反應(yīng)能夠平穩(wěn)快速的進(jìn)行。因此，pH控制在5.5～6.5之間比較合適。

2.3 溫度對(duì)酶促反應(yīng)周期的影響

溫度對(duì)酶促反應(yīng)周期的影響見(jiàn)圖4。

圖4 氧化反應(yīng)溫度對(duì)反應(yīng)周期的影響Fig.4 Effect of reaction temperature

溫度是反應(yīng)體系又一個(gè)重要的控制指標(biāo)，對(duì)酶的活性尤為重要。葡萄糖氧化酶的適用溫度是30℃～60℃，過(guò)氧化氫酶的適用溫度是30℃～65℃，最適宜溫度為40℃。溫度過(guò)低不利于激活酶的活性；溫度過(guò)高，會(huì)增加能耗，增加生產(chǎn)成本。因此要綜合考慮，選擇一個(gè)適宜的反應(yīng)溫度，既要保證酶的活性，又要把能耗控制在最低。由圖4不難發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溫度控制在35℃左右時(shí)，反應(yīng)能夠較為快速的進(jìn)行，反應(yīng)周期最短，能耗也低，綜合以上考慮，氧化反應(yīng)的反應(yīng)溫度一般控制在35℃左右。

2.4 通氣量對(duì)酶促反應(yīng)周期的影響

體系的通氣量和溶氧量息息相關(guān)，通氣量低，溶氧不足，酶促反應(yīng)受到抑制，反應(yīng)周期大大延長(zhǎng)；若通氣量過(guò)大，氧氣來(lái)不及溶解即被帶出，同樣會(huì)造成溶解氧不足，延緩酶促反應(yīng)的進(jìn)行。并且通氣量過(guò)大，部分料液會(huì)被出氣帶出，造成罐容的減少，料液的損失，產(chǎn)物收率低。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)1.4.5得到通風(fēng)量與反應(yīng)周期的關(guān)系，如圖5。

圖5 通氣量對(duì)反應(yīng)周期的影響Fig.5 Effect of air rate

由圖5可知，當(dāng)通風(fēng)量小于5 L/min時(shí)，溶氧不足，反應(yīng)周期長(zhǎng)；當(dāng)通風(fēng)量大于5 L/min時(shí)，周期有上升趨勢(shì)；當(dāng)通風(fēng)量為5 L/min時(shí)，反應(yīng)周期短，此時(shí)，供氧充足，氧化反應(yīng)能保持一個(gè)平穩(wěn)快速的速度進(jìn)行。因此，通風(fēng)量為5L/min是一個(gè)理想的通風(fēng)量。

2.5 葡萄糖酸鋅濃度對(duì)結(jié)晶的影響

將葡萄糖酸鋅濾液分別濃縮至干物濃度為20%、25%、30%、35%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）等不同的濃度，冰水浴中放置10 h，使充分結(jié)晶，當(dāng)葡萄糖酸鋅濃度大于30%時(shí)，晶核可以較快的形成，晶體析出較快。結(jié)晶沉淀和固液比情況如圖6所示。

圖6 葡萄糖酸鋅濃度對(duì)結(jié)晶的影響Fig.6 Effect of zinc gluconate concentration

當(dāng)葡萄糖酸鋅濃度為20%、25%、30%時(shí)，結(jié)晶顆粒較大，沉淀情況良好，固液能夠很好的分離；當(dāng)葡萄糖酸鋅濃度為35%時(shí)，由于濃度過(guò)高，結(jié)晶3 h，葡萄糖酸鋅來(lái)不及形成晶體便析出成膏狀，造成“糊罐”現(xiàn)象，固液無(wú)法分離，達(dá)不到結(jié)晶目的。綜合考慮結(jié)晶狀況和設(shè)備的利用率，葡萄糖酸鋅濃度為30%無(wú)疑是最佳選擇。

2.6 結(jié)晶溫度對(duì)葡萄糖酸鋅產(chǎn)率的影響

按照實(shí)驗(yàn)1.4.7制得葡萄糖酸鋅成品，稱量計(jì)算，分別得出冰水浴條件下冷卻結(jié)晶和室溫條件下結(jié)晶葡萄糖酸鋅成品的產(chǎn)率分別為87.23%和76.55%，溫度越低葡萄糖酸鋅的產(chǎn)率越高。這是因?yàn)闇囟仍降推咸烟撬徜\在水中的的溶解度越小，葡萄糖酸鋅越容易結(jié)晶析出，理論產(chǎn)率高低與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。因此，葡萄糖酸鋅結(jié)晶時(shí)，溫度越低越好，結(jié)合生產(chǎn)實(shí)踐，一般控制在0℃（冰水?。?/p>

2.7 產(chǎn)品質(zhì)量分析

雙酶法生產(chǎn)葡萄糖酸鋅的新工藝采用葡萄糖氧化酶和過(guò)氧化氫酶直接將葡萄糖氧化為葡萄糖酸，然后與氧化鋅發(fā)生復(fù)分解反應(yīng)制備葡萄糖酸鋅。相比較于傳統(tǒng)的生產(chǎn)工藝，該法既沒(méi)有催化氧化法帶來(lái)的重金屬污染，也沒(méi)有發(fā)酵法帶來(lái)的蛋白質(zhì)和輔料雜質(zhì)的影響，產(chǎn)品純度高，可以達(dá)到99.6%。對(duì)在優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)條件下獲得的葡萄糖酸鋅精品進(jìn)行產(chǎn)品質(zhì)量分析，結(jié)果如表1所示，各項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到食品添加劑葡萄糖酸鋅（GB8820-2010）《食品添加劑葡萄糖酸鋅》所要求的產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)[8-9]，因此，按本工藝制備的葡萄糖酸鋅產(chǎn)品完全可以作為食品添加劑使用。

表1 葡萄糖酸鋅的質(zhì)量指標(biāo)分析結(jié)果Table1 Analysis results of the zinc gluconate

3 結(jié)論

1）經(jīng)過(guò)一系列的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，得出葡萄糖酸鋅生產(chǎn)的最適宜條件為：葡萄糖初始濃度在300 g/L～340 g/L之間，氧化反應(yīng)pH控制在5.5～6.5之間，氧化反應(yīng)溫度為35℃，通氣量為5 L/min，結(jié)晶濃度為30%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），冷卻結(jié)晶采取冰水浴。

2）新工藝生產(chǎn)的葡萄糖酸鋅成品符合GB8820-2010的要求，完全達(dá)到食品添加劑的各項(xiàng)指標(biāo)，可以應(yīng)用于食品領(lǐng)域。

[1]劉薇芝,胡漢昆,劉萍,等.葡萄糖酸鋅藥理作用與臨床應(yīng)用[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2009,28(8):1060-1061

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A Novel Enzymatic Process for Zinc Gluconate Production

LI Qiu-hong，ANAS*，LI Yue-qiang，YIN Yu-jian
（Xiwang Group Company Limited，Binzhou 256209，Shandong，China）

A new production method for zinc gluconate production is introduced in this article.According to this method，selected enzyme of Glucose oxidase catalyzes the oxidation of glucose，as substrate，to gluconic acid in the presence of oxygen supply with simultaneous production of hydrogen peroxide（H2O2）while gluconic acid is neutralized by zinc oxide to produce zinc gluconate.The present paper studies the influences of following parameters such as glucose concentration，pH，temperature，air flow rate，and optimum crystallization conditions on zinc gluconate processing.The purity of the zinc gluconate can reach up to99.6%.Zinc gluconate produced using enzymatic method can be used in the area of food，pharmaceutical，feed，cosmetic industries，etc.

glucose；glucose oxidase；catalase；novel process

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.03.004

2012-09-26

李秋紅（1982—），女（漢），助理工程師，本科，研究方向：食品生物技術(shù)。

*通信作者：阿納斯（1964—），男，中級(jí)工程師，博士，研究方向：玉米深加工。