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(1北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心,農(nóng)業(yè)部華北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京100097;2山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 山西太原 030005)

大蔥CMS 58不育系及保持系花藥和花粉的顯微觀(guān)察

王 嬋1，2趙 泓1劉倩純1裴雁曦2*王永勤1*

(1北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心,農(nóng)業(yè)部華北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京100097;2山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 山西太原 030005)

利用石蠟切片技術(shù)對(duì)大蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育系 58 A1、58 A2及其保持系58 B的花藥發(fā)育過(guò)程進(jìn)行了比較,并利用掃描電鏡技術(shù)觀(guān)察了3個(gè)樣品的花粉粒。石蠟切片結(jié)果顯示：大蔥不育系58 A1花藥絨氈層提前解體,影響了正常小孢子的形成,導(dǎo)致花粉敗育;而58 A2的花藥絨氈層異常增厚,擠壓藥室內(nèi)的小孢子,小孢子內(nèi)的物質(zhì)流失,導(dǎo)致花粉敗育。58 A2藥室內(nèi)壁細(xì)胞細(xì)胞壁沒(méi)有加厚,花藥同側(cè)的2個(gè)花粉囊之間的細(xì)胞層極厚,可能是花藥成熟后無(wú)法開(kāi)裂的主要原因。掃描電鏡結(jié)果顯示：花粉粒呈長(zhǎng)球形或超長(zhǎng)球形,具單溝,外壁為腦紋狀雕紋,不育系的成熟花粉粒很少或多數(shù)為干癟花粉粒。

大蔥;CMS;花藥;花粉;石蠟切片;掃描電鏡

大蔥(Allium fistulosum L.)是蔥科蔥屬中二、三年生草本植物,廣泛栽培于亞洲東部的中國(guó)、韓國(guó)和日本(Inden & Asahira, 1990),在我國(guó)最少有2 600年的栽培歷史(崔連偉 等,2004),常常作為一種綠色保健蔬菜、調(diào)味品。植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育(cytoplasmic male sterility,CMS)廣泛存在于高等植物中, 表現(xiàn)為雄性器官不能形成有活力的花粉,而雌性器官的發(fā)育和植株的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)正常, 其遺傳方式是母性遺傳。目前已經(jīng)在300多種植物中發(fā)現(xiàn)雄性不育現(xiàn)象(Kaul, 1988)。由于CMS可免除人工去雄的復(fù)雜操作,因此是雜種種子生產(chǎn)的重要途徑之一,為此,許多學(xué)者將研究?jī)?nèi)容集中在植物雄性不育機(jī)理上。

高等植物的花粉粒由花粉母細(xì)胞經(jīng)過(guò)減數(shù)分裂后發(fā)育形成。花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂形成四分體,隨著胼胝質(zhì)壁的溶解,四分體的4個(gè)子細(xì)胞彼此分離,成為4個(gè)各含有1個(gè)細(xì)胞核的小孢子(也稱(chēng)作單核花粉粒)。小孢子經(jīng)過(guò)分裂、生長(zhǎng)發(fā)育為成熟的花粉粒(吳鴻和郝剛,2012)。Laser和Lesrten (1972)統(tǒng)計(jì)62例CMS花粉敗育時(shí)期后發(fā)現(xiàn)雙子葉植物在花粉造孢細(xì)胞至四分體時(shí)期敗育較多,而單子葉植物中不育花粉敗育的高峰出現(xiàn)在單核期至雙核期;同時(shí)也有學(xué)者認(rèn)為花粉敗育與絨氈層及中層細(xì)胞的異常行為有關(guān)。另外對(duì)花粉超微結(jié)構(gòu)的觀(guān)察也揭示了植物CMS敗育的機(jī)理。目前已經(jīng)有學(xué)者在細(xì)胞學(xué)水平上研究了大蔥不育系敗育的原因。席湘媛(1991)曾指出大蔥花粉敗育發(fā)生在單核小孢子期的早期,王曉靜等(2007)也對(duì)大蔥不育機(jī)理進(jìn)行了研究,總結(jié)出敗育有兩種類(lèi)型：中層延遲解體和絨氈層提前解體;席湘媛(2000)還對(duì)大蔥的花粉進(jìn)行了超微結(jié)構(gòu)的觀(guān)察,總結(jié)出了發(fā)育過(guò)程中脂滴、各種細(xì)胞器等的變化情況。

大蔥CMS 58有兩個(gè)不育系58 A1和58 A2,兩者敗育的表型不同：前者為花藥提前開(kāi)裂,后者表現(xiàn)為花藥褐化。為了探究這兩個(gè)不育系的敗育類(lèi)型,本試驗(yàn)對(duì)兩者及其保持系的花藥進(jìn)行了石蠟切片觀(guān)察,且對(duì)花藥和花粉進(jìn)行了掃描電鏡觀(guān)察,以期為大蔥育種中CMS 58的利用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為已經(jīng)選育成的穩(wěn)定遺傳的大蔥不育系58 A1、58 A2及保持系58 B,2012年6月種植于北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心試驗(yàn)地,于2013年開(kāi)花前采集不同大小的花蕾進(jìn)行顯微觀(guān)察。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 利用壓片法確定花藥發(fā)育時(shí)期 用醋酸洋紅染色法壓片觀(guān)察花藥,根據(jù)花粉發(fā)育的一些明顯特征來(lái)確定花藥發(fā)育的時(shí)期,從而確定四分體時(shí)期的花蕾大小。

1.2.2 石蠟切片的制備與觀(guān)察（蘇立娟，2005；Li et al.， 2006；王原媛 等，2010） 采集不同發(fā)育時(shí)期的可育及不育花蕾,在FAA固定液中固定2～24 h。不同濃度的乙醇依次脫水后,用二甲苯透明,用石蠟浸蠟及包埋,輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)切片,切片厚度為6 μm。展片與烤片之后用二甲苯脫蠟,乙醇梯度脫水,蘇木精染色后用中性樹(shù)膠封片, OLYMPUS顯微鏡觀(guān)察并照相。

1.2.3 掃描電鏡樣品的制備與觀(guān)察（曲波 等，2006） 取上述各樣品的成熟花藥,置于防塵處干燥,在解剖鏡下將花粉撒到樣品托的雙面膠帶上,在IB-5離子濺射儀中真空噴金鍍膜,在日立s-3400N型掃描電鏡下觀(guān)察并拍照。每個(gè)樣品測(cè)量20粒花粉的極軸長(zhǎng)和赤道軸長(zhǎng),取平均值。同時(shí),直接將各樣品的成熟花藥撒到樣品托的雙面膠帶上,同樣對(duì)其進(jìn)行掃描電鏡觀(guān)察。掃描電鏡在北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 大蔥花藥發(fā)育時(shí)期的確定

利用普通光學(xué)顯微鏡,通過(guò)醋酸洋紅染色法對(duì)采集到的花蕾進(jìn)行花粉發(fā)育時(shí)期的觀(guān)察。在對(duì)花粉發(fā)育的各個(gè)時(shí)期進(jìn)行全面觀(guān)察后發(fā)現(xiàn),四分體時(shí)期是最容易觀(guān)察和識(shí)別的時(shí)期,即使不使用任何染液,也可以很輕易地正確識(shí)別。為了提高工作效率,對(duì)處于四分體時(shí)期的30個(gè)花蕾的形態(tài)特征進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。處于四分體時(shí)期的花蕾的平均長(zhǎng)度、直徑和柄長(zhǎng)分別為(2.40±0.15) mm、(1.46±0.21) mm和(3.73±1.84 )mm。經(jīng)多次反復(fù)驗(yàn)證,將花蕾長(zhǎng)度作為判定小孢子發(fā)育的四分體時(shí)期較為可靠。以此長(zhǎng)度為分界線(xiàn),花蕾長(zhǎng)度約為3.4 mm和5.4 mm時(shí)可分別收集到單核花粉粒和成熟花粉粒時(shí)期,花蕾約為2.2 mm時(shí)可收集到花粉母細(xì)胞發(fā)育的各個(gè)時(shí)期。由此,在田間通過(guò)測(cè)量花蕾的大小就可以估算出其花藥發(fā)育的大致時(shí)期,為后續(xù)試驗(yàn)樣品的采集奠定了基礎(chǔ)。

2.2 大蔥雄性不育系及其保持系花藥發(fā)育過(guò)程

通過(guò)石蠟切片觀(guān)察大蔥保持系58 B的花藥,發(fā)現(xiàn)每個(gè)花蕾中有6個(gè)花藥,花藥橫切面似蝴蝶形。每個(gè)花藥均由中央的一個(gè)藥隔及周?chē)?個(gè)花粉囊組成的。4個(gè)花粉囊分為左右兩半,中間由藥隔相連,每個(gè)花粉囊由花粉囊壁和花粉囊室(藥室)組成。在大蔥6個(gè)花藥外圍有兩輪花被,每輪3片(圖1)?；ǚ勰冶谟赏庵羶?nèi)分別由表皮、藥室內(nèi)壁、中層及絨氈層四部分組成。

圖1大蔥單個(gè)花蕾的橫切圖

處于減數(shù)分裂時(shí)期的花粉母細(xì)胞,細(xì)胞體積較大,核內(nèi)物質(zhì)濃厚,染色極深。此時(shí)期中層細(xì)胞不發(fā)達(dá),絨氈層細(xì)胞大,細(xì)胞質(zhì)濃厚,有規(guī)則地排列在小孢子母細(xì)胞的一周(圖2-A)。小孢子母細(xì)胞經(jīng)減數(shù)分裂后形成四分體,四分體被透明的胼胝質(zhì)壁包圍,此時(shí)絨氈層細(xì)胞仍整齊排列,但部分中層細(xì)胞已經(jīng)開(kāi)始解體(圖2-B)。隨后,四分體細(xì)胞外的胼胝質(zhì)被絨氈層細(xì)胞分泌的胼胝質(zhì)酶分解,釋放出小孢子,絨氈層細(xì)胞開(kāi)始解體(圖2-C)。此后小孢子經(jīng)雙核期、三核期后發(fā)育為呈卵圓形的成熟花粉粒,同時(shí)伴隨著絨氈層和中層細(xì)胞的消失。藥室內(nèi)壁細(xì)胞內(nèi)壁縱向條紋狀加厚,但在花藥同側(cè)上下2個(gè)花粉囊間的若干細(xì)胞壁并未加厚(圖2-D)。當(dāng)花粉粒完全成熟時(shí),暴露在空氣中的花藥失水,纖維層收縮,花藥由此處開(kāi)裂,散出花粉粒。這就是晴天有利于花藥散粉,而陰雨天時(shí)花藥不容易散粉的原因。

圖2大蔥不育系及保持系花藥發(fā)育的顯微結(jié)構(gòu)

不育系58 A1的花藥會(huì)提前開(kāi)裂,表現(xiàn)出不育性。對(duì)其花藥發(fā)育進(jìn)行觀(guān)察,發(fā)現(xiàn)在小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)期,部分絨氈層已經(jīng)開(kāi)始提前解體 (圖2-E),四分體時(shí)期藥室內(nèi)側(cè)環(huán)狀的絨氈層細(xì)胞結(jié)構(gòu)已經(jīng)消失,藥室中可以見(jiàn)到絨氈層細(xì)胞的斷片。由于絨氈層細(xì)胞的提前解體,可以明顯地觀(guān)察到扁平的中層細(xì)胞(圖2-F)。小孢子時(shí)期絨氈層完全消失,部分小孢子細(xì)胞胞質(zhì)外流,呈透明不規(guī)則球形(圖2-G)。到花粉粒成熟期,藥室內(nèi)成熟的花粉粒極少,藥室內(nèi)壁細(xì)胞細(xì)胞壁加厚,出現(xiàn)特有的縱向條狀,花藥同側(cè)的2個(gè)花粉囊之間的細(xì)胞層較厚(圖2-H)。

不育系58 A2的花藥在發(fā)育過(guò)程中會(huì)褐化,表現(xiàn)出不育性。對(duì)其花藥發(fā)育進(jìn)行觀(guān)察,與保持系的相比,其小孢子母細(xì)胞時(shí)期及四分體時(shí)期,組成花粉囊壁的4層細(xì)胞沒(méi)有明顯異常,絨氈層細(xì)胞一直保持環(huán)狀結(jié)構(gòu),細(xì)胞內(nèi)胞質(zhì)濃厚,染色極深,與保持系沒(méi)有明顯差別 (圖2-I、J)。但是在小孢子時(shí)期,本應(yīng)開(kāi)始程序性死亡的絨氈層細(xì)胞異常增厚,中層細(xì)胞略有增厚,花粉囊向內(nèi)萎縮,單個(gè)藥室酷似鞋狀(圖2-K)。中層細(xì)胞明顯增厚,花粉囊繼續(xù)向內(nèi)萎縮,小孢子被擠壓成一條染色極深的團(tuán)塊狀物質(zhì)而無(wú)法發(fā)育成花粉粒。藥室內(nèi)壁細(xì)胞細(xì)胞壁沒(méi)有加厚,花藥同側(cè)的2個(gè)花粉囊之間的細(xì)胞層極厚(圖2-L)。這種結(jié)構(gòu)是58 A2的花藥成熟后無(wú)法開(kāi)裂的主要原因。

2.3 大蔥雄性不育系及保持系花粉粒特征

大蔥保持系58 B成熟花藥的掃描電鏡可看出許多成熟花粉粒從花藥藥室中散出(圖3-A)?；ǚ哿槌L(zhǎng)球形,赤道面觀(guān)為窄橢圓形,極面觀(guān)為一裂圓形,極赤比(P/E)為2.48,具有單溝,溝長(zhǎng)達(dá)到兩極(圖3-B)?；ǚ哿Ｍ獗诰哂心X紋狀雕飾,表面多孔穴和坑(圖3-C)。

大蔥不育系58 A1的成熟花藥中無(wú)明顯的花粉粒(圖3-D)。極少數(shù)的花粉粒顯示其為長(zhǎng)球形,赤道面觀(guān)為稍寬的橢圓形,極面觀(guān)為一裂圓形,極赤比為1.92。具有單溝,溝較深,溝長(zhǎng)一端達(dá)到極端,另一端終止于極端附近(圖3-E)?；ǚ弁獗诘募y狀及表面與保持系相似,但其上有一個(gè)明顯裂口(圖3-F)。

大蔥不育系58 A2的成熟花藥與保持系的相比,藥室明顯變扁,說(shuō)明花粉囊萎縮內(nèi)陷(圖3-G)。成熟的花粉粒多為空癟狀(圖3-H),呈超長(zhǎng)球形,赤道面觀(guān)為不規(guī)則形。與保持系相比,該花粉粒的單溝較深且達(dá)兩極。外壁也為腦紋狀,但表面的孔和穴相對(duì)較少(圖3～I(xiàn))。

圖3大蔥不育系及保持系花藥及花粉掃描電鏡

3 結(jié)論與討論

3.1 石蠟切片觀(guān)察花藥發(fā)育

本試驗(yàn)通過(guò)觀(guān)察不育系與保持系的花藥石蠟切片,發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)大蔥不育植株在細(xì)胞學(xué)上以不同的方式表現(xiàn)出敗育現(xiàn)象,其中58 A1花藥中的絨氈層,在小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)期就開(kāi)始提前解體,其成熟期小孢子近球形,光學(xué)顯微鏡下透明;而58 A2花藥中絨氈層在小孢子單核期異常增厚,其成熟期小孢子極度皺縮,光學(xué)顯微鏡下染色極深。之前的相關(guān)研究表明了大蔥的敗育發(fā)生在單核小孢子時(shí)期(席湘媛,1991;王曉靜 等,2007),這與本試驗(yàn)的結(jié)果不完全相同,這可能是由于研究對(duì)象為不同來(lái)源的雄性不育系導(dǎo)致的。因此,正如Laser和Lesrten(1972)報(bào)道的那樣,敗育可能發(fā)生在花粉發(fā)育的各個(gè)階段,只是有些比較明顯,而有些不明顯從而不易觀(guān)察到。

王曉靜等(2007)在對(duì)大蔥雄性不育系及保持系花藥和花粉發(fā)育的細(xì)胞學(xué)比較研究中指出,大蔥雄性不育系的小孢子有兩種敗育類(lèi)型,第一種是絨氈層細(xì)胞正常發(fā)育,但中層細(xì)胞發(fā)生了延遲解體的現(xiàn)象,與逐漸縮小的藥室一起擠壓小孢子造成不育。第二種類(lèi)型是絨氈層提前解體, 不能提供小孢子發(fā)育所需的營(yíng)養(yǎng), 造成小孢子的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核逐漸解體, 僅剩下內(nèi)空的花粉粒。謝潮添等 (2005)利用光學(xué)顯微鏡對(duì)大白菜雄性不育兩用系的不育花藥進(jìn)行了觀(guān)察,認(rèn)為絨氈層細(xì)胞中脂類(lèi)代謝的異?？赡苁且鸹ǚ蹟∮脑?但經(jīng)過(guò)電鏡對(duì)超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀(guān)察,發(fā)現(xiàn)不育花藥中絨氈層細(xì)胞的異常不是導(dǎo)致花粉敗育的原因,而是花粉異常的結(jié)果。楊曉麗等(2008)在對(duì)芝麻核雄性不育系小孢子敗育過(guò)程的超微結(jié)構(gòu)觀(guān)察中發(fā)現(xiàn),不育小孢子外壁與可育小孢子外壁存在明顯差異,尤其是缺少基粒棒。在小孢子發(fā)育成花粉粒的過(guò)程中,不育小孢子內(nèi)含物集縮并逐漸減少。

在本試驗(yàn)中,58 A1與第二種敗育類(lèi)型相似, 58 A2既不屬于第一種敗育類(lèi)型,也不屬于第二種敗育類(lèi)型。在四分體發(fā)育成熟時(shí),本應(yīng)開(kāi)始程序化死亡的絨氈層細(xì)胞沒(méi)有及時(shí)解體,可能首先發(fā)生了小孢子細(xì)胞質(zhì)的泄漏,絨氈層細(xì)胞吸收泄漏出來(lái)的養(yǎng)分而異常增厚,逐漸失去營(yíng)養(yǎng)的小孢子核物質(zhì)也逐漸解體,外形上極度皺縮。

目前報(bào)道的大多數(shù)植物雄性不育系的敗育都是由于絨氈層出現(xiàn)異常行為。絨氈層能夠合成胼胝質(zhì)酶,分解四分體的胼胝質(zhì)壁。絨氈層還可以形成并分泌孢粉素,參與花粉粒外壁的形成,并為小孢子發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)。絨氈層細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能異常均會(huì)引起雄性不育。而謝潮添等(2005)發(fā)現(xiàn)不育材料的花藥在造胞細(xì)胞時(shí)期就已經(jīng)表現(xiàn)異常。

3.2 掃描電鏡觀(guān)察花粉粒

通過(guò)掃描電鏡觀(guān)察花粉粒,本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大蔥不育系58 A1及保持系的花粉粒為長(zhǎng)球形或超長(zhǎng)球形,極面觀(guān)都為一裂圓形,外壁紋狀及表面的空穴相似,這些特征與楊德奎等(2009)的報(bào)道結(jié)果相一致。不育系58 A2的正?；ǚ哿：苌倩蛘叨鄶?shù)為干癟的花粉粒。兩個(gè)不育系花粉粒單溝的深淺或長(zhǎng)短有區(qū)別：不育系58 A1的單溝深且只達(dá)一極,不育系58 A2的單溝也較深。從花藥外形上看,58 A2的藥室變扁,這與石蠟切片花粉囊壁向內(nèi)萎縮的結(jié)果相一致。

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Abstract：Comparision of anther and pollen development process between welsh onion(Allium fistulosum L.)CMS 58 A1, 58 A2and its maintainer line 58 B was conducted by using paraffin section technology. The pollen grains of these 3 samples were observed by scanning electron microscope. The results showed that the reason for welsh onion infertility might be caused by the following reasons：tapetum of 58 A1degenerated in advance leading microspore could not generate normally; while the tapetum of 58 A2thickened abnormally and squeezed the microspore leading its cytoplasm and nucleus flew away. The endothecium of 58 A2did not thicken in microspore stage, but the cell layer between 2 anthers was extremely thick. It caused the anthers could not split at maturity. The results of scanning electron microscope revealed that the pollen grain was of long ball or perprolate shape. The type of aperture was monocolpate. The ornamentation of outer wall was brain striatum. The sterile pollen was few or the majority of them were wizened.

Microscopic Observation on Anther and Pollen of Welsh Onion CMS 58 Male Sterile Line and Maintainer Line

WANG Chan1,2, ZHAO Hong1, LIU Qian-chu1, PEI Yan-xi2*, WANG Yong-qin1*

〔1Beijing Vegetable Research Center, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences,Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops (North China), Ministry of Agriculture, Beijing 100097, China ;2School of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030005, Shanxi, China〕

Welsh onion; CMS; Anther; Pollen; Paraffin section; Scanning electron microscopy

王嬋,碩士研究生,專(zhuān)業(yè)方向：蔬菜分子遺傳學(xué),E-mail：wangchanwww@163.com

*通訊作者(Corresponding authors)：裴雁曦,教授,博士生導(dǎo)師,專(zhuān)業(yè)方向：植物分子遺傳學(xué),E-mail：peiyanxi@sxu.edu.cn;王永勤,研究員,碩士生導(dǎo)師,專(zhuān)業(yè)方向：蔬菜遺傳育種,E-mail：wyqty@sohu.com

2014-02-26;接受日期：2014-05-19

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 (31372066),北京市農(nóng)林科學(xué)院科技創(chuàng)新能力建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)(KJCX20140111)