周永輝，王淑杰，黃全勇，陳儉清，李艷華

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150030；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱150001）

豬鏈球菌（Streptococcussuis，S.suis）已成為我國(guó)當(dāng)前引起人獸共患病的一種重要的病原菌，可引起人畜的急性、熱性傳染病，會(huì)使人出現(xiàn)腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、持久性聽(tīng)力缺失,嚴(yán)重者可導(dǎo)致中毒休克綜合征并引起死亡。根據(jù)豬鏈球菌的莢膜多糖抗原可將其分為35個(gè)血清型，其中能引起人和動(dòng)物發(fā)病的致病性豬鏈球菌血清型主要是1型、2型、7型和9型等。（Biofilm，B F）是細(xì)菌產(chǎn)生的多聚復(fù)合物基質(zhì)將自身包繞，粘附于無(wú)活性物體或活體表面，形成的有一定結(jié)構(gòu)的細(xì)菌群體；生物被膜內(nèi)細(xì)菌容易對(duì)抗生素產(chǎn)生廣泛的耐藥性，造成感染難以治愈，反復(fù)發(fā)作[1]。國(guó)內(nèi)學(xué)者證明，豬鏈球菌在體外可以形成生物被膜[2-3]。本試驗(yàn)對(duì)13株從病料中分離出的豬鏈球菌進(jìn)行分型鑒定，并對(duì)其生物被膜能力進(jìn)行測(cè)定及形態(tài)觀察，為研究其致病性及生物被膜研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。THB培養(yǎng)基（青島高科園海博生物技術(shù)有限公司）。試劑：pH值7.4磷酸鹽緩沖溶液、結(jié)晶紫、甲醇、冰乙酸、犢牛血清、Taq DNA聚合酶（購(gòu)自TaKaRa公司）；PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。材料：卡爾加里生物膜裝置、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。檢測(cè)儀器：酶標(biāo)儀（SN239591，美國(guó)Epoch）、掃描電鏡（S-3400N，日本）、PCR儀（S1000TMThermal Cycler，美國(guó)）。

1.2 試驗(yàn)菌株培養(yǎng)及表型特征觀察 首先將豬鏈球菌菌株于無(wú)菌條件下在THB瓊脂平板上傳代II代進(jìn)行純化分離，然后從THB瓊脂平板上挑取單個(gè)菌落，接種于無(wú)菌THB液體試管中，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h后，取適量菌液稀釋進(jìn)行革蘭染色，顯微鏡下觀察。

1.3 生化試驗(yàn) 純培養(yǎng)后的細(xì)菌進(jìn)行甘露醇、山梨醇、菊糖、棉子糖和蜜二糖發(fā)酵試驗(yàn)，馬尿酸鹽試驗(yàn)，精氨酸和透明質(zhì)酸酶水解試驗(yàn)，6.2%NaCl生長(zhǎng)試驗(yàn)等。結(jié)果參照文獻(xiàn)[4]的介紹進(jìn)行判定。

1.4 豬鏈球菌的PCR鑒定及分型 豬鏈球菌鑒定引物及血清1型2型7型和9型豬鏈球菌的分型引物由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所設(shè)計(jì)，并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。用常規(guī)方法對(duì)細(xì)菌DNA進(jìn)行小量制備。常規(guī)PCR反應(yīng)，之后用1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

1.5 生物被膜的培養(yǎng)及形成能力測(cè)定 按照1.2方法培養(yǎng)細(xì)菌2代，比濁法將菌液濃度先調(diào)整為0.5麥?zhǔn)瞎軕乙海?.0×108CFU/mL），再用THB液體培養(yǎng)基稀釋，使菌液濃度為1×106CFU/mL。每孔200μL菌液加到卡爾加里裝置底部板內(nèi)，只含THB液體培養(yǎng)基的孔為陰性對(duì)照組，邊孔加生理鹽水為空白對(duì)照，37℃，45 r/min搖床上培養(yǎng)。參照Stepanovic[5]的方法測(cè)定生物被膜的形成能力。PBS清洗3次，固定，染色，測(cè)OD595值。

1.6 S.suis生物被膜的形態(tài)學(xué)觀察 首先從卡爾加里生物被膜裝置上取下形成生物被膜的樁釘，并使用滅菌PBS洗滌3次以去除游離菌，用戊二醛固定，脫水處理，用冷凍干燥儀對(duì)樣品進(jìn)行干燥4 h。樣品表面在真空條件下鍍一層厚100A的金屬膜，SEM下觀察。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0軟件對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計(jì)資料的比較采用單因素方差分析，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 S.suis菌落及染色結(jié)果 細(xì)菌在未加犢牛血清的THB培養(yǎng)基平板上菌落為微小且透明，在加入血清的THB培養(yǎng)及平板上呈中等大小、光滑圓潤(rùn)不透明。在顯微鏡下可看到細(xì)菌呈藍(lán)紫色長(zhǎng)鏈狀。

2.2 生化試驗(yàn) 13株菌株在菊糖、棉子糖和蜜二糖試驗(yàn)中呈陽(yáng)性，甘露醇和山梨醇中為陰性，馬尿酸鹽中為陽(yáng)性，精氨酸中為陽(yáng)性，透明質(zhì)酸酶試驗(yàn)為陰性，在6.2%NaCl中不生長(zhǎng)，以上生化結(jié)果符合豬鏈球菌生化指標(biāo)。

圖1 豬鏈球菌顯微鏡下形態(tài) （1 000×）

2.3 豬鏈球菌PCR鑒定及分型結(jié)果 13株菌擴(kuò)增均得到689 bp的gdh目的基因（圖2A）。其中1型引物擴(kuò)增出約441 bp的片段，1號(hào)菌為1型豬鏈球菌（圖2B）；其中2型引物擴(kuò)增出約675 bp的片段，11號(hào)、12號(hào)菌為2型豬鏈球菌（圖2C）；其中7型引物擴(kuò)增出約335 bp的片段，2號(hào)、10號(hào)菌為7型豬鏈球菌（圖2D）；其中9型引物擴(kuò)增出約388 bp的片段，3、5、6、7號(hào)菌為9型豬鏈球菌（圖2E）。

圖2（A-E）豬鏈球菌PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.4 生物被膜的培養(yǎng)及形成能力測(cè)定結(jié)果 參照Stepanovic[5]的標(biāo)準(zhǔn)，13株豬鏈球菌均可形成生物被膜，1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)、7號(hào)、9號(hào)、10號(hào)、12號(hào)、13號(hào)菌OD595數(shù)值介于陰性對(duì)照組OD595（0.203±0.016）值的1倍到2倍之間，差異顯著（P＜0.05），形成生物被膜能力較弱[5]；5號(hào)、6號(hào)、8號(hào)、11號(hào)菌OD595數(shù)值大于2倍陰性對(duì)照組OD595數(shù)值，但小于4倍陰性對(duì)照組OD595數(shù)值（0.203±0.016），差異顯著（P＜0.01），形成生物被膜能力中等[5]。

圖3 豬鏈球菌形成生物被膜測(cè)定結(jié)果（n=16，±SD）

2.5 S.suis生物被膜的形態(tài)學(xué)觀察 通過(guò)掃描電鏡觀察了生物被膜的形態(tài)學(xué)，結(jié)果見(jiàn)圖4。細(xì)菌鑲嵌于生物被膜中，細(xì)菌周圍有厚厚的黏液層。這些外觀形態(tài)表明細(xì)菌形成了生物被膜，且形成生物被膜可從外觀觀察到有的形成生物被膜致密，有的則稀疏。

圖4 S.suis生物被膜作用的形態(tài)學(xué)觀察 （5μm）

3 討論

豬鏈球菌病作為集約化豬群的主要傳染病之一,受到越來(lái)越多養(yǎng)豬業(yè)者的重視[6]。豬鏈球菌按照莢膜抗原的差異可分為35個(gè)血清型（1～34，1/2）[7]。其中1型、2型、7型、9型是主要流行的致病血清型。

據(jù)報(bào)道豬鏈球菌的gdh基因具有保守性[8-9]，因此此次設(shè)計(jì)引物特異性的鑒定出豬鏈球菌，本試驗(yàn)對(duì)分離到的13株豬鏈球菌進(jìn)行了致病性血清型鑒定，并成功鑒定出了1型1株，2型2株，7型2株，9型4株，為后續(xù)研究其毒力因子及其他特性做基礎(chǔ)。對(duì)13株豬鏈球菌進(jìn)行生物被膜培養(yǎng)，結(jié)果13株全部能形成生物被膜，根據(jù)豬鏈球菌生物被膜的形成能力判定標(biāo)準(zhǔn)[10]：臨界值（OD c）約為陰性對(duì)照。當(dāng)OD≤OD c時(shí)，判定細(xì)菌無(wú)生物被膜形成能力；當(dāng)OD c＜OD≤2×OD c時(shí)，判定細(xì)菌生物被膜形成能力較弱；當(dāng)2×OD c＜OD≤4×OD c時(shí)，判定細(xì)菌生物被膜形成能力中等；當(dāng)4×OD c＜OD值時(shí)，判定細(xì)菌生物被膜形成能力強(qiáng)。根據(jù)判定標(biāo)準(zhǔn)形成生物被膜能力1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)、7號(hào)、9號(hào)、10號(hào)、12號(hào)、13號(hào)菌較弱，5號(hào)、6號(hào)、8號(hào)、11號(hào)菌中等，這些結(jié)果可能與菌體自身毒力基因及QS系統(tǒng)的調(diào)節(jié)有關(guān)[11]。生物被膜危害巨大，可造成細(xì)菌強(qiáng)力耐藥性并且造成交叉感染，難于治理，所以亟待對(duì)其更深一步研究，找出對(duì)策對(duì)其進(jìn)行清除治理。

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