王 好，王秋舉，劉艷輝，張雅斌，呂文亮，周井祥

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.吉林省水產(chǎn)科學(xué)研究院，吉林 長(zhǎng)春 130033）

我國(guó)作為亞洲主要的鯉魚(yú)養(yǎng)殖國(guó)家，其產(chǎn)量占全球的70%。因此改進(jìn)鯉魚(yú)的養(yǎng)殖方法增加產(chǎn)量是解決全球糧食問(wèn)題的一個(gè)重要途徑[1-2]。但是20 世紀(jì)90 年代早期暴發(fā)的一種高度傳染和急性致死的疾病給全球的鯉魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。這種疾病的快速傳播可能與國(guó)際間的魚(yú)類(lèi)貿(mào)易有關(guān)[4]。根據(jù)病毒的形態(tài)學(xué)特征這種疾病最初被命名為錦鯉皰疹病毒[5]。由于這種病毒主要損害鯉魚(yú)的鰓和腎，因此又將這種病毒命名為鯉魚(yú)間質(zhì)性腎炎和鰓壞死性病毒[5]。最近，基于該病毒的基因組與其他鯉科皰疹病毒的同源性建議將該病毒命名為鯉科皰疹病毒3 型（CyHV-3）[6]。

自從該病于20 世紀(jì)90 年代在美國(guó)、歐洲以及以色列暴發(fā)以來(lái)[4，7-9]，CyHV-3 已經(jīng)成為鯉魚(yú)主要的疾病之一[3，10-12]。2002-2003 年期間，CyHV-3 造成日本[13]，印度尼西亞[10]和臺(tái)灣[12]等亞洲許多國(guó)家和地區(qū)養(yǎng)殖鯉魚(yú)的大量死亡。該病的發(fā)生與溫度有密切的關(guān)系，該病主要發(fā)生在水溫18 ℃～28 ℃的春秋季，當(dāng)水溫上升到30 ℃時(shí)很少發(fā)病，這可能是因?yàn)樵谶@個(gè)溫度時(shí)病毒的增值和基因轉(zhuǎn)錄停止[14]。

由于KHV的高感染率和死亡率造成的巨大經(jīng)濟(jì)損失，但目前為止還沒(méi)有有效地藥物來(lái)治療本病。所以疫苗免疫就顯得尤為重要。本試驗(yàn)選擇錦鯉皰疹病毒糖蛋白基因ORF126 作為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行原核表達(dá)和相應(yīng)的免疫原性的研究為錦鯉皰疹病毒的預(yù)防探索一條新的途徑。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 錦鯉皰疹病毒吉林株（KHV-CJ）系由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離保存[15]；錦鯉尾鰭細(xì)胞系由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)保存；ELISA試驗(yàn)兔抗魚(yú)二抗為實(shí)驗(yàn)室自制；500-600 g健康鯉魚(yú)，購(gòu)自未發(fā)生KHV的長(zhǎng)春某漁場(chǎng)，抽檢部分魚(yú)，經(jīng)PCR檢測(cè)KHV陰性。新生牛血清、M199 培養(yǎng)基，購(gòu)自GIBCO公司；ExTaqDNA聚合酶、限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI 和HindⅢ、DNAMarker，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；DNA膠回收試劑盒，購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；鎳離子金屬鰲合親和層析介質(zhì)（Ni-NTA），購(gòu)自上海銳谷生物科技有限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 載體與菌株 pMD18-T 購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，E.coli.DH5α購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。pET-32a 為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成 從GenBank（登錄號(hào):AP008984.1）上下載KHVORF126 的全基因序列，用軟件Primer Primer 5.0 設(shè)計(jì)1 對(duì)引物，上游引物（F1）為：5′-GAATTCATGATGAGGATCCTTCTGCTA-3′，下游引物（F2）為：5′-AAGCTTCTAAGCCGTGATCAGGTC-3′，分別在引物上、下游的5′端加入EcoRI 和HindⅢ酶切位點(diǎn)（劃線部分）；引物設(shè)計(jì)完成后送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4 錦鯉皰疹病毒中國(guó)吉林株（KHV-CJ）ORF126基因的擴(kuò)增 將本實(shí)驗(yàn)室保存的錦鯉皰疹病毒中國(guó)吉林株接種在鯉魚(yú)尾鰭單層細(xì)胞上，每日觀察細(xì)胞的病變情況，當(dāng)病變達(dá)到70%～80%時(shí)收集病毒，按照常規(guī)方法提取病毒的DNA，應(yīng)用25 μL 反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min。35個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，最后，反應(yīng)體系于72 ℃中延伸10 min，結(jié)束反應(yīng)后4 ℃保存。

1.5 錦鯉皰疹病毒中國(guó)吉林株（KHV-CJ）ORF126 基因的克隆與鑒定 將目的片段純化回收后在4 ℃下與pMD18-T 載體過(guò)夜連接后；將連接產(chǎn)物全量轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，用含1 μg/mL 氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基篩選單菌落，提取質(zhì)粒后用PCR鑒定（PCR 程序如上）和EcoRI 和HindⅢ進(jìn)行雙酶切鑒定，命名為pMD18-T-ORF126，陽(yáng)性質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.6 錦鯉皰疹病毒中國(guó)吉林株（KHV-CJ）ORF126 基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建 將pMD18-T-ORF126 和pET-32a 分別用EcoRI 和HindⅢ雙酶切，純化回收目的片段后，16 ℃過(guò)夜連接，連接體系為：目的片段：10 μL，pET-32a 大片段：1 μL，10 倍T4 Buffer：1 μL，T4 DNA連接酶：1 μL，ddH2O：1 μL，總體系為15 μL。

1.7 錦鯉皰疹病毒中國(guó)吉林株（KHV-CJ）ORF126基因原核表達(dá)載體的鑒定 將連接產(chǎn)物總量轉(zhuǎn)化化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，用含1 μg/mL 氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基篩選單菌落，提取質(zhì)粒后分別用PCR（PCR 程序如上）和用EcoRI 及HindⅢ雙酶切進(jìn)行鑒定，陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pET32a-ORF126。

1.8 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá) 將鑒定正確的陽(yáng)性質(zhì)粒pET32a-ORF126 轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21 中，用含1 μg/mL 氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基篩選單菌落，挑取單個(gè)菌落接種于含1 μg/mL 氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后，按1%接種于新鮮的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37 ℃震蕩培養(yǎng)至OD600為0.6 時(shí)，加入IPTG 至終濃度為1 mmol/L 誘導(dǎo)表達(dá)2～4 h。SDS-PAGE 電泳后考馬斯亮藍(lán)染色觀察。

1.9 表達(dá)蛋白的純化及蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定 將表達(dá)后的菌液反復(fù)凍融3 次用Ni-Denature-GuHCl 裂解表達(dá)菌，經(jīng)超聲破碎后利用Ni-NTA-瓊脂糖凝膠層析柱進(jìn)行純化。

用分光光度計(jì)測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度，分別在OD280nm 和OD260nm 的光密度下測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度。

1.10 抗體水平檢測(cè) 將純化后的蛋白1∶1 加不完全佐劑，按10 μg/mL，20 μg/mL 和40 μg/mL 的濃度分別免疫3 組魚(yú)，同時(shí)設(shè)置空白和生理鹽水兩組作為對(duì)照組，每組10 條魚(yú)。分別在免疫后4，7，10，14，18，24 d 和28 d 采血收集血清，用間接ELISA檢測(cè)抗體的水平。

2 結(jié)果

2.1 錦鯉皰疹病毒吉林株（KHV-CJ）ORF126 基因的擴(kuò)增 PCR 擴(kuò)增出一條與目的基因大小一致的片段（圖1）。

圖1 錦鯉皰疹病毒中國(guó)吉林株（KHV-CJ）ORF126基因PCR擴(kuò)增

2.2 錦鯉皰疹病毒吉林株（KHV-CJ）重組質(zhì)粒pMD18T-ORF126 鑒定 PCR擴(kuò)增出1 條與目的基因大小一致的片段。pMD18-T-ORF126 用內(nèi)切酶EcoRI 和HindⅢ雙酶切后獲得1 條大小約為822 bp 的片段，說(shuō)明ORF126 基因已成功克隆到載體中。

2.3 重組質(zhì)粒pET32a-ORF126 鑒定

2.3.1 PCR 鑒定 用提取的重組質(zhì)粒pET-ORF126作為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果獲得了長(zhǎng)為822 bp 的片段，與目的基因大小一致。

2.3.2 酶切鑒定 對(duì)重組質(zhì)粒pET-ORF126 用EcoRI 和HindⅢ雙酶切后得到與ORF126 大小一致的一條822 bp 的片段和一條大于822 bp 的片段。

2.4 重組蛋白的表達(dá) ORF126 表達(dá)蛋白的理論大小為29.9 kDa，pET-32a 自帶20 kDa 左右的融合蛋白，重組蛋白的總分子量為49.9 kDa；誘導(dǎo)表達(dá)后的重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE 分析，如圖2，誘導(dǎo)的樣品在51 kDa 左右有1 條蛋白帶，與理論結(jié)果相符。

2.5 純化蛋白的濃度 鎳柱純化的蛋白經(jīng)分光光度計(jì)測(cè)定重組質(zhì)粒pET32a-ORF126 表達(dá)蛋白的濃度為0.416 mg/mL。

圖2 pET32a-ORF126的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)

2.6 抗體水平 用間接ELISA檢測(cè)不同天數(shù)的抗體水平見(jiàn)表1。

表1 鯉魚(yú)血清ELISA抗體水平檢測(cè) （OD450）

用不同劑量蛋白免疫后均可檢測(cè)到KHV的抗體。表1 數(shù)據(jù)經(jīng)t檢驗(yàn)，用pET32a-ORF126 表達(dá)的蛋白10 μg/尾、20 μg/尾和40 μg/尾的蛋白免疫后的抗體水平差異不顯著（P＞0.05）。

圖3 不同劑量表達(dá)蛋白免疫鯉魚(yú)血清ELISA抗體水平檢測(cè)結(jié)果

3 討論

錦鯉皰疹病毒病已經(jīng)給我國(guó)的鯉魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，還沒(méi)有藥物能夠治療本病，免疫接種是預(yù)防本病發(fā)生和傳播的有效途徑。因此，必須研究更安全有效地疫苗。

本試驗(yàn)經(jīng)克隆獲得了長(zhǎng)為822 bp 的ORF126基因的全基因序列,將錦鯉皰疹病毒（KHV）囊膜蛋白基因ORF126 將其克隆至pET32a 中，構(gòu)建了重組載體并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21 中，經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)，SDS-PAGE 結(jié)果顯示，插入的外源基因在大腸桿菌中表達(dá)出約為49.9 kDa 融合蛋白。用純化的蛋白免疫魚(yú)后用間接ELISA檢測(cè)抗體水平；ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，用10 μg/尾、20 μg/尾和40 μg/尾的蛋白免疫后均可檢測(cè)到KHV的抗體，用pET32a-ORF136 表達(dá)的蛋白20 μg/尾和40 μg/尾的蛋白免疫后的抗體水平比10 μg/尾劑量蛋白免疫后的抗體水平高且差異不顯著（P＞0.05），且維持的時(shí)間也較長(zhǎng)；而用pET32a-ORF126 表達(dá)的蛋白10 μg/尾、20 μg/尾和40 μg/尾的蛋白免疫后的抗體水平差異不顯著（P＞0.05）。

為研制預(yù)防錦鯉皰疹病毒的疫苗以及可能應(yīng)用于檢測(cè)本病的待選目標(biāo)蛋白，本研究選擇錦鯉皰疹病毒（KHV）ORF126 基因作為研究對(duì)象并用ELISA檢測(cè)免疫表達(dá)的蛋白后不同時(shí)間的抗體水平確定其免疫效果，為疫苗的研究探索一條新路。

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