袁 野，葛學(xué)忠，張 躍，劉 云

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150030；2.哈爾濱鐵路公安局警犬繁育訓(xùn)練基地，黑龍江，哈爾濱 150030）

犬的行為學(xué)研究在20 世紀(jì)90 年代得到了極大的發(fā)展，行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果強(qiáng)有力的證明了犬具備極強(qiáng)的社會(huì)化認(rèn)知和工作能力[1]。雖然這些實(shí)驗(yàn)用到的行為學(xué)方法被作為建立犬多種擴(kuò)展技能和理解犬認(rèn)知力的首選工具，但其實(shí)驗(yàn)結(jié)果還是較易受到諸如犬的動(dòng)機(jī)、服從以及訓(xùn)練水平等因素的干擾。這一系列問(wèn)題必然導(dǎo)致了以行為學(xué)方法獲得的試驗(yàn)結(jié)果其本身存在很大問(wèn)題。具體而言，就是假設(shè)犬沒(méi)有完美的完成任務(wù)，但通常其本身可能具備通過(guò)這些測(cè)試的能力，僅僅是因?yàn)槿鄙賹?duì)執(zhí)行任務(wù)本身的欲望和對(duì)任務(wù)之需求的理解力，導(dǎo)致了任務(wù)無(wú)法被完成。由此可見(jiàn)，以基于物理學(xué)原理發(fā)展而來(lái)的腦電圖（Electroencephalo graphy，EEG）技術(shù)來(lái)衡量犬的認(rèn)知過(guò)程相比于以行為學(xué)方法來(lái)對(duì)犬認(rèn)知進(jìn)行研究會(huì)是一種客觀中立而又行之有效的方法。

對(duì)動(dòng)物腦電信號(hào)的研究還停留在EEG本身[2]，而少有深入到對(duì)動(dòng)物的ERPs 及其成分的分析上。失匹配性負(fù)波（Mismatch negativity,MMN）就是一系列事件誘發(fā)電位（event-related potentials,ERPs）后成分中的一種，它是由一組相同的標(biāo)準(zhǔn)刺激（standard stimulus）中偶然出現(xiàn)的一個(gè)不同的偏差刺激（deviant stimulus）所引起的出現(xiàn)在刺激后160～220 ms 的成分。試驗(yàn)表明，提取出MMN成分的概率和偏差刺激的發(fā)生概率成負(fù)相關(guān)，例如偏差刺激次數(shù)為總刺激次數(shù)的20%時(shí)，MMN的發(fā)生概率高于50%時(shí)的概率，因此MMN 被用來(lái)觀測(cè)重復(fù)刺激序列中的突發(fā)性成分[3]。在人類,由于MMN可能反映了高階認(rèn)知情緒流程,它不僅可以在注意力得不到有效地集中時(shí)仍可得到有效誘發(fā)，還可以在睡眠、蘇醒或昏迷狀態(tài)下出現(xiàn)，故此在阿爾茨海默氏癥[4]和精神分裂癥[5]上得到了廣泛的應(yīng)用。所以它的發(fā)現(xiàn)使科學(xué)界在研究腦的自動(dòng)加工時(shí)有了客觀指標(biāo)，使腦的自動(dòng)加工、內(nèi)隱認(rèn)知、意識(shí)等較難研究的科學(xué)領(lǐng)域進(jìn)入了一個(gè)新時(shí)期[3]。由此可見(jiàn)，對(duì)犬MMN進(jìn)行提取和分析是一個(gè)對(duì)了解犬認(rèn)知行為過(guò)程的特別有用的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 12 月齡史賓格犬2 只（哈爾濱鐵路公安局警犬繁育訓(xùn)練基地）；日本光電EEG-9200K 型腦電記錄系統(tǒng)（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院）；針式電極（日本光電）；吸音棉（廣州偉達(dá)）等。

1.2 刺激方法 采用Oddball 聽(tīng)覺(jué)刺激范式，Oddball 范式是很好的適于提取到聽(tīng)覺(jué)誘發(fā)MMN 的試驗(yàn)范式，而聽(tīng)覺(jué)誘發(fā)MMN 又提供了一個(gè)不需要任何行為學(xué)反應(yīng)的信號(hào)[6]。本研究通過(guò)E-prime?軟件來(lái)實(shí)現(xiàn)聽(tīng)覺(jué)刺激過(guò)程，標(biāo)準(zhǔn)刺激和偏差刺激聲音是由同一電腦音箱發(fā)出一系列兩種不同的短純音構(gòu)成，標(biāo)準(zhǔn)刺激頻率為500 Hz，發(fā)生概率為90%，刺激強(qiáng)度為50±2 dB；偏差刺激的頻率為1 kHz，發(fā)生概率為10%，刺激強(qiáng)度為60±2 dB；單次刺激時(shí)間均為50 ms[7]。每個(gè)時(shí)間段（epoch）間隔2 s，每只犬的單次試驗(yàn)全程為400 s，共180 次標(biāo)準(zhǔn)音刺激和20 次偏差刺激。刺激模式示于圖1。

圖1 刺激模式圖

1.3 試驗(yàn)方法 所有的腦電記錄均在擺放有吸音棉的5 m×4 m 的腦電實(shí)驗(yàn)室中完成，為了使犬只適應(yīng)這種環(huán)境，本研究令每只犬在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)1 h 的環(huán)境適應(yīng)探索行為，以使其達(dá)到最大限度的放松。而后對(duì)犬只進(jìn)行麻醉，將記錄電極放置于Cz 點(diǎn)、參考電極置于Cz 點(diǎn)向前2 cm 的位置、接地電極置于乳突上皮[8]。無(wú)菌操作針電極，插入犬頭部下方的皮膚，在此過(guò)程中沒(méi)有犬只因針電極的插入或拔出出現(xiàn)疼痛或痛苦的跡象。設(shè)置腦電記錄設(shè)備采樣率1 000 Hz，自帶濾波器全部關(guān)閉，環(huán)境溫度24 度，兩只犬均記錄到了完整的EEG信息。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)刺激與偏差刺激誘發(fā)聽(tīng)覺(jué)ER P 總平均

獲得原始數(shù)據(jù)后應(yīng)用MATLAB 對(duì)標(biāo)準(zhǔn)刺激和偏差刺激時(shí)間段進(jìn)行數(shù)據(jù)分段（epoch）、并參照美國(guó)加州大學(xué)圣地亞哥分校斯瓦茨計(jì)算神經(jīng)科學(xué)中心（SCCN UCSD）的方法[9]對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行濾波和偽跡去除，而后單獨(dú)提取分段數(shù)據(jù)應(yīng)用MATLAB對(duì)其進(jìn)行迭加平均，進(jìn)而獲得了兩犬只的總平均（grand average）ERP，結(jié)果見(jiàn)圖2。最后,應(yīng)用配對(duì)t檢驗(yàn)法對(duì)各時(shí)間窗（P50:30～70 ms；N100:80～120 ms；MMN:180～220 ms）內(nèi)的兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析[10-12]。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 P50 成分 在P50 成分時(shí)間窗口內(nèi)由偏差刺激誘發(fā)產(chǎn)生的P50的局部峰振幅為2.478 μV，發(fā)生于52 ms。由標(biāo)準(zhǔn)刺激誘發(fā)產(chǎn)生的P50 的局部峰振幅為2.745 μV，發(fā)生于54 ms，p=0.8428、t=-0.1996、df:40，兩組波形內(nèi)在成分沒(méi)有明顯差異。

2.2 N100 成分 在N100 成分時(shí)間窗口內(nèi)由偏差刺激誘發(fā)產(chǎn)生的N100 的局部峰振幅為-3.974 μV，發(fā)生于87 ms。由標(biāo)準(zhǔn)刺激誘發(fā)產(chǎn)生的N100 的局部峰振幅為-2.493 μV，發(fā)生于82 ms，p =0.9839、t =-0.0203、df :40，時(shí)間窗口內(nèi)兩組波形內(nèi)在成分沒(méi)有明顯差異。

2.3 MMN成分 在MMN成分時(shí)間窗口內(nèi)由偏差刺激誘發(fā)產(chǎn)生的MMN的局部峰振幅為-9.785 μV，發(fā)生于209 ms。由標(biāo)準(zhǔn)刺激誘發(fā)產(chǎn)生的MMN 的局部峰振幅為-0.5529 μV，發(fā)生于169 ms，p=4.3499e-32、t=-35.9809、df:40,時(shí)間窗口內(nèi)兩組波形內(nèi)在成分差異顯著。

2.4 結(jié)論 偏差刺激和標(biāo)準(zhǔn)刺激所誘發(fā)的P50、N100 的波形在各自的分析時(shí)間窗口內(nèi)并無(wú)顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而MMN 波形則存在著顯著差異。這是偏差刺激誘發(fā)犬聽(tīng)覺(jué)MMN 的證據(jù)。

表1 標(biāo)準(zhǔn)刺激、偏差刺激誘發(fā)P50、N100、M M N的潛伏期、局部峰振幅和統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)

3 討論

30 ms 到70 ms 和80 ms 到120 ms 這兩個(gè)時(shí)間窗口內(nèi)由標(biāo)準(zhǔn)刺激和偏差刺激分別誘發(fā)所產(chǎn)生的波形并無(wú)顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這表明了標(biāo)準(zhǔn)刺激和偏差刺激所誘發(fā)的P50 和N100 在內(nèi)在成分上并無(wú)顯著差異,意味著刺激的物理性質(zhì)（強(qiáng)度、頻率）與MMN 的出現(xiàn)與否是無(wú)關(guān)的。

180 ms 到220 ms 這個(gè)時(shí)間窗口內(nèi)的統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果則顯示，在此時(shí)間窗內(nèi)由標(biāo)準(zhǔn)刺激和偏差刺激所誘發(fā)的波形是具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的，這說(shuō)明在偏差刺激和標(biāo)準(zhǔn)刺激后180 ms 到220 ms 這一時(shí)間窗內(nèi)的成分具有顯著的不同。也就是說(shuō)本研究記錄到了在刺激發(fā)生后180 ms 到220 ms 的時(shí)間窗口內(nèi)偏差刺激具有標(biāo)準(zhǔn)刺激所不具備的ERP 成分，這些成分以電位變化的形式體現(xiàn)了大腦在成序列的偏差刺激和標(biāo)準(zhǔn)刺激下對(duì)聲音刺激這一單一變量不同的識(shí)別加工模式和過(guò)程，其在EEG上的體現(xiàn)就是只存在于偏差刺激后209 ms、局部最大峰值為-9.785 μV 的負(fù)波。由此可見(jiàn)，是偏差刺激的出現(xiàn)導(dǎo)致了在其發(fā)生180 ms 后的ERP 成分產(chǎn)生了變化，上述現(xiàn)象與現(xiàn)有試驗(yàn)記錄到的人類和其他動(dòng)物的聽(tīng)覺(jué)誘發(fā)MMN 試驗(yàn)結(jié)果是相類似的[13-14]。假如這個(gè)成分產(chǎn)生于人類，則意味著被測(cè)試人感知到了這兩組聲音的不同，在此試驗(yàn)中則意味著被測(cè)試的犬感知到了這兩組聲音的不同。

所有證據(jù)都表明了，本研究所獲得的在偏差刺激后采集到的局部最大峰值為-9.785 μV 的負(fù)波是由于犬機(jī)體對(duì)突然變換的刺激進(jìn)行認(rèn)知加工而產(chǎn)生的一組誘發(fā)腦電信號(hào)。這是一個(gè)重要的發(fā)現(xiàn)，雖然本研究還需要對(duì)其進(jìn)一步研究以了解這些結(jié)果是否可靠，具體而言就是要對(duì)一個(gè)大樣本的犬進(jìn)行試驗(yàn)，這個(gè)樣本需要對(duì)包括不同品種、大小和頭部的形狀的犬進(jìn)行更細(xì)致的評(píng)價(jià)研究。除此之外，需要進(jìn)一步研究的還有三點(diǎn)。第一，本研究的方法只使用了一個(gè)記錄電極，這與人類誘發(fā)聽(tīng)覺(jué)MMN 的記錄方式是不同的。故此，本研究需要更多的研究，以了解犬的誘發(fā)聽(tīng)覺(jué)MMN 究竟同人類的聽(tīng)覺(jué)誘發(fā)MMN 有多大程度的異同。第二，聽(tīng)覺(jué)誘發(fā)MMN 的研究也已經(jīng)在涉及人類言語(yǔ)認(rèn)知領(lǐng)域引起了相當(dāng)高的重視，這些涉及語(yǔ)言元素的電生理反應(yīng)的研究可以用來(lái)對(duì)犬的認(rèn)知進(jìn)行探討，以評(píng)估他們?nèi)绾翁幚磉@些相關(guān)刺激。第三，MMN 成分通常由聽(tīng)覺(jué)刺激誘發(fā)產(chǎn)生，但也在視覺(jué)和嗅覺(jué)刺激中被檢測(cè)出，假使本研究將對(duì)犬聽(tīng)覺(jué)誘發(fā)MMN 的這種研究應(yīng)用于嗅覺(jué)，將對(duì)更好地理解狗的嗅覺(jué)能力是特別有利的，因?yàn)槿男嵊X(jué)并不是很好理解，但軍隊(duì)、警察和政府機(jī)構(gòu)卻又高度依賴于犬的嗅覺(jué)[15]。具體而言，因?yàn)槿男嵊X(jué)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)人類，訓(xùn)導(dǎo)員是無(wú)法依靠自己的嗅覺(jué)來(lái)確定犬是否已經(jīng)檢測(cè)到目標(biāo)氣味，研究犬的聽(tīng)覺(jué)誘發(fā)MMN 將使本研究能夠了解狗的氣味辨別能力的程度，并讓訓(xùn)犬員能夠了解受訓(xùn)犬只是缺少基于氣味的條件發(fā)射行為或其他因素，如動(dòng)機(jī)、訓(xùn)練水平等。

總的來(lái)說(shuō)，本研究以經(jīng)典的Oddball 范式記錄到了偏差刺激使犬產(chǎn)生聽(tīng)覺(jué)MMN 的現(xiàn)象，并發(fā)展了一個(gè)適用于獸醫(yī)研究的微創(chuàng)ERPs 提取方法，這種方法將提供給犬認(rèn)知行為研究人員一種對(duì)犬的認(rèn)知能力評(píng)估、加強(qiáng)行為研究的有效方法，使本研究對(duì)人類最親密的伴侶動(dòng)物認(rèn)知能力的相關(guān)知識(shí)和理解能力得到迅速的加強(qiáng)。

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