武果桃，姜俊兵，牛國慶，任 杰，孟冬霞，趙 娟，牛 琛

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山西 太原030032；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西 太谷 030800；3.太原市小店區(qū)畜禽繁育工作站，山西 太原030032；4.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

隨著全球氣候溫室效應(yīng)的不斷加劇及畜牧高度集約化生產(chǎn)的發(fā)展，熱應(yīng)激對肉雞的危害日益嚴(yán)重。肉雞生長快、體型大、皮厚、皮下及腹部脂肪多，對熱應(yīng)激的抵抗力差。熱應(yīng)激是造成肉雞猝死癥的主要原因之一，嚴(yán)重制約肉雞養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，給肉雞生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。

熱休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）是在高溫和其他應(yīng)激條件下動物體內(nèi)合成的一系列具有內(nèi)源性保護作用的蛋白質(zhì)，又名熱應(yīng)激蛋白。HSP70 是HSPs 家族中最重要的一員，在結(jié)構(gòu)上具有高度保守性。應(yīng)激狀態(tài)下HSP70 在細(xì)胞內(nèi)迅速合成，抵抗應(yīng)激造成的組織細(xì)胞損傷，提高機體的熱耐受能力而起到保護機體的作用[1]，這種熱耐受能力主要與HSP70 有關(guān)[2-3]，而且與HSP70 的表達水平呈正相關(guān)［4-5］，一些抗熱應(yīng)激中藥可通過提高HSPs 的表達來改善機體抗應(yīng)激的能力［5-6］。HSPs 在應(yīng)激條件下參與細(xì)胞的抗損傷、修復(fù)和熱耐受過程，保護細(xì)胞生命活動，國內(nèi)關(guān)于環(huán)境和HSPs 基因表達的研究很少[7]。本試驗結(jié)合國內(nèi)外熱應(yīng)激對雞損傷的研究進展，人工制造熱應(yīng)激病理模型，通過復(fù)方中藥對熱應(yīng)激肉仔雞HSP70 mRNA 表達的研究，從分子水平提高對熱應(yīng)激的防治效果，為中藥調(diào)控?zé)釕?yīng)激蛋白機理及熱應(yīng)激的綜合防制提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與試驗藥物 健康18 日齡AA 肉仔雞120 只，購自山西省太原市小店區(qū)明生養(yǎng)殖場；試驗用中藥，購自太原市雙鶴藥業(yè)有限公司。藥方由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所中獸醫(yī)藥研究室篩選研制，以刺五加、黃芪、元胡、黨參、五味子、山楂、甘草等藥物按一定比例組方。經(jīng)水提濃縮、過濾成浸膏，然后加入糊精等載體混合、烘干、粉碎制成每克成藥含0.5 g 原生藥的中藥沖劑，再輔以一定維生素C 和維生素E 即得。于陰涼干燥處保存待用。

1.2 主要試劑 總RNA 提取試劑TRIZol（Invitrogen公司）；普通PCR試劑（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）；SYBR Premix（TaKaRa）；DM 2 000（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司），瓊脂糖（Agarose），Tris（Sigma 公司）；其余異丙醇，氯仿，乙醇等均為新近購買的實驗室常規(guī)國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 試驗設(shè)計 將120 只18 日齡健康A(chǔ)A 肉仔雞隨機分為4 組，即復(fù)方中藥組、維生素組、純中藥組和高溫對照組，每組30 只雞，每組設(shè)2 個重復(fù)，人工制造慢性熱應(yīng)激病理模型，進行中藥防治肉雞熱應(yīng)激試驗。試驗共進行18 d，預(yù)試期3 d、正式試驗期15 d。預(yù)試期間按常規(guī)進行飼養(yǎng)管理和防疫，正式試驗期各組基礎(chǔ)日糧完全相同，自由飲水，復(fù)方中藥組在飲水中按每天每只雞0.2 g 劑量添加自制中藥沖劑，維生素組按標(biāo)準(zhǔn)添加維生素，純中藥組只添加自制中藥沖劑，每日給藥一次，高溫對照組不添加任何藥物。熱應(yīng)激環(huán)境溫度、濕度的調(diào)節(jié)見表1。溫濕度調(diào)節(jié)由溫濕度控制器控制。

表1 熱應(yīng)激模型建立的溫度、濕度控制

1.4 組織處理 試驗結(jié)束后每組隨機選3 只雞(共12 只) 迅速宰殺，取出肝臟并用生理鹽水沖洗干凈，裝于冰凍管后立即放人液氮罐中冷凍。

1.5 組織總RNA 的提取 將采好的肝臟組織約0.5 g 從液氮中取出，放入已經(jīng)灼燒好的研缽中，用液氮將組織研成粉末；將組織粉末放到有1 mL TRIZol 的1.5 mL 離心管中，劇烈混勻，靜置5 min；加入200 μL 氯仿混勻，靜置3 min，12 000 r/min（4 ℃）離心15 min；吸取400 μL 上清液加入等體積的異丙醇，室溫靜置10 min，12 000 r/min（4 ℃）離心10 min；取出，倒掉異丙醇，再加入1 mL 75%預(yù)冷的乙醇進行漂洗，7 500 r/min（4 ℃）離心5 min；倒掉乙醇，自然晾干，加入20 μL 的ddH2O（滅菌蒸餾水），充分混勻后，進行電泳檢測。

1.6 組織總RNA 質(zhì)量鑒定 取1μL 分裝的RNA溶液，用核酸蛋白測定儀測定其濃度及A260、A260/280、A260/230 的值。然后用常規(guī)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，檢測所提取RNA 的質(zhì)量。

1.7 引物設(shè)計 根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）公布的雞HSP70 基因序列和GAPDH 序列，應(yīng)用Premier3.0 軟件設(shè)計引物，引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。為了檢測各RNA 樣品完整性和反轉(zhuǎn)錄效率之間的差別，將待測樣品中的管家基因β-actin 設(shè)為內(nèi)參照。引物序列如下：

HSP70mRNA sense：5′-GCGTAACACCACCATT CCC-3′ 19

HSP70mRNA antisense：5′-CGTCCTTTGTCATA GCCCTCT-3′ 21

GAPDH sense：5′-TGAAAGTCGGAGTCAACGG AT-3′ 21

GAPDH tisense：5′-ACGCTCCTGGAAGATAGT GAT-3′ 21

1.8 Real-Time RT-PCR 反應(yīng)體系建立 cDNA 鏈的合成：10 μL 反應(yīng)體系中含5×Prime ScriptTMBuffer 2 μL，total RNA 不多于5 00 ng，DEPC 水加至10 μL。上述成分混勻后置于PCR 儀器中，反應(yīng)條件為37 ℃15 min；85 ℃5 s。RT 產(chǎn)物保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.9 Real-time RT-PCR 擴增條件建立 （1）反應(yīng)體系：每個RNA 樣品分別使用目的基因和內(nèi)參基因引物基因進行熒光定量PCR 反應(yīng)。25 μL 反應(yīng)體系如下：12.5μL SYBR?Premix，0.5 μL PCR Forward Primer（5 μmol/L），0.5 μL PCR Reverse Primer（5 μmol/L），1 μL cDNA 溶液，最后用ddH2O（滅菌蒸餾水）補充至25 μL；（2）反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性1 min 后，95 ℃10 s，61 ℃30 s，72 ℃30 s，72 ℃1 min；30 個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，由熔解曲線判定PCR 反應(yīng)的特異性，根據(jù)擴增動力學(xué)曲線的CT 值計算定量結(jié)果。內(nèi)參基因β-actin 與目的基因在同一條件下不同管內(nèi)擴增，每個樣本設(shè)3 次重復(fù)，最后取平均值。

1.10 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取2 μL cDNA 樣為模板，按2 倍濃度梯度稀釋，進行熒光定量PCR 反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)果用IQ-5（美國biorad）自帶軟件自動進行數(shù)據(jù)分析并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以確定目的基因和內(nèi)參基因擴增效率。

1.11 PCR 產(chǎn)物鑒定 根據(jù)產(chǎn)物片段大小，采用1%瓊脂糖凝膠電泳。5 μL 樣品與1 μL 溴酚藍混合后點樣，同時點DNA Marker 5 μL；電壓120 V 電泳20 min 后，紫外燈下觀察，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。運用DNA Marker 測算目的基因產(chǎn)物片段的大小。

2 結(jié)果

2.1 組織總RNA 的提取，提取效果如圖1。

圖1 總R NA 提取效果

提取的肝臟樣品總RNA，經(jīng)濃度和純度檢測，各樣品的OD260/OD280比值均在1.8～2.0 之間，說明RNA 的純度很好。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)，5 s、18 s 和28 s 帶均很清晰完整，說明提取和純化效果較好，RNA 未發(fā)生降解?？捎糜诤罄m(xù)試驗。

2.2 RT-PCR 擴增結(jié)果 HSP70 mRNA 和GAPDH的擴增片段長度分別為228 bp 和111 bp。反應(yīng)體系加入相應(yīng)引物后，PCR 擴增產(chǎn)物與引物設(shè)計應(yīng)擴增的片段相符，經(jīng)擴增效率分析顯示，內(nèi)參基因和HSP70 基因擴增效率均為95.5%；其相關(guān)系數(shù)R2 分別為0.999 和0.991；標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率均為-3.435，可以應(yīng)用Comparative Delta-delta Ct 法進行分析。

2.3 內(nèi)參基因和HSP70 基因擴增動力學(xué)曲線分析及熔解曲線 見圖2、圖3。

圖2 內(nèi)參基因和H S P70基因擴增動力學(xué)曲線

圖3 內(nèi)參基因和H S P70基因熔解曲線

內(nèi)參基因及HSP70 基因擴增動力學(xué)曲線符合標(biāo)準(zhǔn)的“S”型熒光增長曲線，并且平行性較好，基線平整拐點清晰，無明顯上揚趨勢。

2.4 擴增產(chǎn)物凝膠電泳分析 見圖4。

圖4 內(nèi)參基因及H S P70擴增產(chǎn)物凝膠電泳

經(jīng)熔解曲線和擴增產(chǎn)物凝膠電泳分析顯示，內(nèi)參基因和HSP70 基因擴增產(chǎn)物Tm 值均一；分別只有一個單獨的峰。說明在實時定量過程中，熒光強度均來自于特異擴增產(chǎn)物，無引物二具體的產(chǎn)生，無非特異擴增。

2.5 熱應(yīng)激雞肝臟組織中HSP70 實時定量PCR結(jié)果 見圖5。

圖5 H S P70實時定量PC R 結(jié)果

3 討論

HSP70 基因沒有內(nèi)含子，這一特異性保證了它們一旦啟動轉(zhuǎn)錄就可產(chǎn)生出成熟的mRNA 以適應(yīng)HSP70 大量快速表達的需要，防止應(yīng)激對其mRNA 前體的影響。Craig 等（1991）報道，高溫可增強熱應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因子的活性，加強HSP70 mRNA合成，從而增加HSP70 質(zhì)量濃度。

研究表明，女貞子、五味子和四君子湯都能顯著提高熱應(yīng)激蛋雞肝臟HSP70 基因的表達，這幾種藥物的抗熱應(yīng)激作用與其調(diào)控HSP70 基因表達有關(guān)[8]。本試驗中復(fù)方中藥沖劑組及純中藥沖劑組肉雞肝臟HSP70 基因表達量顯著提高，分別比高溫對照組、維生素組高2.98 倍、3.28 倍和4.66 倍、5.13 倍，說明本試驗中藥制劑可顯著提高熱應(yīng)激肉雞肝臟HSP70 mRNA 的表達，增強抗熱應(yīng)激能力。

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