付明哲，李長安，魏揀選，白 濤

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)院，陜西 楊凌712100）

隱性乳房炎主要由病原微生物感染奶牛乳腺所引發(fā)的一種炎癥反應(yīng)。該病臨床癥狀不明顯，但病牛產(chǎn)奶量下降，乳汁化學(xué)成分發(fā)生了變化。我國奶牛隱性乳腺炎的發(fā)病率為46.4%～85.7% ，經(jīng)濟(jì)損失較大[1]。許多奶牛場獸醫(yī)缺乏病原學(xué)檢查的條件，僅憑經(jīng)驗濫用抗生素治療乳房炎，導(dǎo)致病菌產(chǎn)生耐藥性。所以及時掌握該病致病菌的種類和耐藥性情況是防治該病的關(guān)鍵。細(xì)菌編碼自動檢測技術(shù)是快速檢測動物致病菌的一種新途徑，和傳統(tǒng)的病菌分離方法相比，具有快速、簡便和準(zhǔn)確的優(yōu)勢，耐藥性分析功能較強，但在我國獸醫(yī)臨床應(yīng)用中鮮有報道[2]。2009-2013年，筆者從陜西省部分奶牛場采集隱性乳房炎病牛的乳樣，應(yīng)用自動細(xì)菌鑒定及藥敏測試儀對隱性乳房炎病原菌進(jìn)行了分離和藥物敏感試驗，旨在為指導(dǎo)治療隱性乳房炎合理用藥提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 被檢材料 乳樣采至陜西省56 個奶牛場，無菌采集體細(xì)胞計數(shù)在80 萬以上的陽性乳的乳樣431 份，置4 ℃冰箱內(nèi)保存不超過24 h。

1.2 培養(yǎng)基及主要試劑 普通瓊脂、營養(yǎng)肉湯、麥康凱瓊脂、鮮血瓊脂平板培養(yǎng)基、細(xì)菌生化卡、藥敏試驗卡，均由杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn)；隱性乳房炎CMT 診斷液，由美國Immucell公司生產(chǎn)。

1.3 儀器設(shè)備 TDR-200B 自動細(xì)菌鑒定及藥敏測試儀（杭州天和微生物試劑有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 隱性乳房炎檢測 CMT 法診斷為隱性乳房炎奶樣，每份奶樣取10 mL，3 000 r/min 離心5 min，棄去管中的上清液，取底部沉淀物備用。

1.4.2 自動生化鑒定 無菌吸取150 μL 沉淀物分別接種于培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑單個菌落革蘭染色，鏡檢后按照儀器說明分類進(jìn)行生化鑒定。將菌落接種于生化培養(yǎng)液，制成菌懸液，用濁度計調(diào)整至0.5～1.0 麥?zhǔn)蠁挝?，菌懸液分別加在鑒定板的各孔中，每孔100 μL，蓋上板蓋，標(biāo)菌株號，置培養(yǎng)箱內(nèi)35 ℃培養(yǎng)16～24 h。取出鑒定板，置閱讀器上自動檢索數(shù)據(jù)庫，記錄鑒定結(jié)果。

1.4.3 自動藥敏試驗 篩選3 種主要的致病菌，調(diào)好藥敏培養(yǎng)液，接種于藥敏試驗平板上，每孔150 μL，35 ℃培養(yǎng)18～24 h，儀器自動判斷結(jié)果，依據(jù)微生物分析系統(tǒng)M100 S18 版的標(biāo)準(zhǔn)判定耐藥菌，細(xì)菌耐藥率：耐藥率=耐藥菌株數(shù)/分離菌株數(shù)×100%。

1.5 統(tǒng)計方法 卡方檢驗和t 檢驗。

2 結(jié)果

2.1 主要病原菌分離情況 在431 份奶樣中，有411個檢出細(xì)菌714 株，細(xì)菌檢出率為95.36%。渭南市的85 份奶樣中有82 個檢出細(xì)菌170 株，檢出率為96.47%；西安市的97 份奶樣中有91 個檢出細(xì)菌155株，檢出率為93.81%；咸陽市的109 份奶樣中有101個檢出細(xì)菌204 株，檢出率為92.66%；寶雞市的140份奶樣中有136 份檢出細(xì)菌273 株，檢出率為97.14%。隱性乳房炎乳樣中分離到病原菌共17 種，其中主要致病菌為金黃色葡萄球菌（14.96%），無乳鏈球菌（15.64%），大腸桿菌（10.97%），乳房鏈球菌（6.23%），棒狀桿菌（5.61%），沙門菌和克雷伯氏菌（均占5.24%），酵母（4.99%），櫞酸桿菌（4.74%），壞死桿菌（4.49%），其他細(xì)菌的檢出率與主要致病菌差異顯著（P＜0.05）。乳樣的細(xì)菌分離情況見表1。2.2 病原菌的混合感染情況 陜西省4 個主要養(yǎng)牛區(qū)奶牛隱性乳腺炎的主要致病菌為金黃色葡萄球菌，鏈球菌和大腸桿菌。病原菌單獨感染率為5.15%～7.35%，由2 種細(xì)菌混合感染感染率為5.15%～11.30%，由3 種細(xì)菌混合感染感染率為38.97%～49.45%，結(jié)果見表2。

表1 致病菌自動分離結(jié)果

2.3 藥敏試驗 結(jié)果見表3。金黃色葡萄球菌對氨芐青霉素、環(huán)丙沙星、慶大霉素、復(fù)方新諾明、青霉素、諾氟沙星耐藥率為66.67%～91.67%。無乳鏈球菌對氨芐青霉素、環(huán)丙沙星、青霉素、慶大霉素、復(fù)方新諾明、紅霉素、鏈霉素耐藥率為63.78%～75.60%。氨芐西林、復(fù)方新諾明、四環(huán)素、阿奇霉素、紅霉素、林可霉素、諾氟沙星、青霉素、鏈霉素對大腸桿菌敏耐藥率為48.86%～100%。

表2 主要病原菌感染情況

3 討論

傳統(tǒng)的微生物檢測一般通過培養(yǎng)特性、菌落形態(tài)、染色特性、生化試驗及動物致病性試驗來確定病原菌，存在生化特性不穩(wěn)定，操作繁瑣，費時費力等缺點[3]。而TDR-200B 自動細(xì)菌鑒定及藥敏測試儀通過檢測細(xì)菌在培養(yǎng)基中不同代謝特征和生長情況，結(jié)合編碼自動檢測技術(shù)及回歸統(tǒng)計，快速提供致病菌的生化鑒定和藥敏試驗結(jié)果[4]。在24 h 內(nèi)將菌株準(zhǔn)確鑒定到屬水平和菌種水平[5]。這種方法為細(xì)菌鑒定自動化、快速化及簡便化發(fā)展提供了條件[6]。陜西省奶牛場的隱性乳房炎主要病原菌共17種，分別為金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、大腸桿菌、乳房鏈球菌、棒狀桿菌、沙門菌、克雷伯氏菌、酵母、櫞酸桿菌和壞死桿菌。國內(nèi)一些學(xué)者用傳統(tǒng)細(xì)菌分離方法研究表明，隱性乳房炎的細(xì)菌檢出率一般在80%以上[7]，本次細(xì)菌自動分離檢出率為92.66%～97.14%。說明應(yīng)用該儀器是一種微量、快速、敏感的鑒定致病菌方法。未檢出細(xì)菌的乳樣多因含有抗生素，部分是由支原體等其他病原引起的。

表3 主要致病菌的耐藥率

渭南、西安、咸陽和寶雞市隱性乳房炎感染的病原菌種類大體相似，但細(xì)菌感染的種類隨著抗生素的廣泛應(yīng)用和衛(wèi)生消毒措施的加強而發(fā)生動態(tài)變化，部分奶牛場隱性乳房炎已由鏈球菌、葡萄球菌轉(zhuǎn)為支原體感染為主，有的牛場隱性奶牛乳房炎的細(xì)菌感染以葡萄球菌為主變化為大腸桿菌感染為主。發(fā)生2種或2種以上病原混合感染率為63.51～69.52%，表明隱性乳房炎混合感染占大多數(shù)。鏈球菌是隱性乳房炎感染中最主要的致病菌，以無乳鏈球菌，停乳鏈球菌，糞鏈球菌為主。這與國內(nèi)有關(guān)報道基本類似[8]。無乳鏈球菌是導(dǎo)致乳腺慢性感染的專性寄生菌，與其他細(xì)菌共同感染可發(fā)生臨床型乳腺炎[9]。金黃色葡萄球菌易引起乳房的肉芽腫與纖維變性，其致病力的強弱與毒力因子多樣性密切相關(guān)[10]。鏈球菌和金黃色葡萄球菌主要通過擠乳工、擠乳機傳播。

從目前的檢測結(jié)果來看，單獨環(huán)境性病原菌占到細(xì)菌總數(shù)的60%左右，檢出率最高為大腸桿菌，這些病原菌的檢出率有逐年增高的趨勢。奶牛在應(yīng)激因素的刺激下，引起機體抵抗力降低，這些細(xì)菌借助圈舍、糞便、墊草、污水、擠奶器及飼養(yǎng)員在奶牛群中傳播和流行。因此，控制環(huán)境性病原菌的感染是防治隱性乳腺炎的關(guān)鍵措施，例如加強環(huán)境衛(wèi)生和消毒措施，改善擠奶技術(shù)和設(shè)備，注意乳頭消毒減少環(huán)境性病原菌的感染；定期添加補氣健脾、活血化瘀的中草藥添加劑，保證精料中維生素和微量元素的含量，以增強奶?？共∧芰?，每年檢測和治療隱性乳腺炎減少傳染源[11]。

由于奶牛乳腺特殊的生理結(jié)構(gòu)和藥動學(xué)機制，全身或乳房局部給藥都很難使乳汁內(nèi)抗生素達(dá)到有效濃度[12]。為了取得療效，獸醫(yī)通常選用高劑量的廣譜抗生素或?qū)追N抗生素聯(lián)合在一起給藥，盡管降低了感染率，但細(xì)菌對常用抗菌藥產(chǎn)生了不同程度的耐藥性[13]。因此，規(guī)?；B(yǎng)殖場應(yīng)根據(jù)細(xì)菌分離鑒定及藥物敏感試驗結(jié)果合理選用抗菌藥物，嚴(yán)格遵守抗生素的使用用量、休藥期及藥物最高殘留量的規(guī)定，以延緩耐藥菌產(chǎn)生；盡量使用最廉價和最窄譜的抗生素，或者輪換應(yīng)用抗生素，才能有效的控制隱性乳房炎的流行和傳播。

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