黃全勇，韓 強(qiáng)，陳儉清，趙玉林，閆清波，盛尊來，周永輝，李艷華

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150030）

豬鏈球菌（S.suis）是一種重要的人畜共患病病原體，可感染豬導(dǎo)致腦膜炎、肺炎、關(guān)節(jié)炎、敗血癥等，其致病力強(qiáng)、病死率高，是引起豬呼吸道疾病和無名高熱病的病原菌之一。近年來由于廣譜抗生素的廣泛應(yīng)用，S.suis對抗生素的敏感性下降，致使S.suis感染率呈逐年上升趨勢[1]。S.suis的耐藥包括多個(gè)方面，而其能形成生物被膜(Biofilm，BF)是導(dǎo)致其耐藥的原因之一[2]，BF是細(xì)菌產(chǎn)生的多聚復(fù)合物基質(zhì)將自身包繞，粘附于無活性物體或活體表面，形成的有一定結(jié)構(gòu)的細(xì)菌群體；它可以抵抗宿主免疫力和抗生素抑菌殺菌作用，生物被膜內(nèi)細(xì)菌容易對抗生素產(chǎn)生廣泛的耐藥性，造成感染難以治愈，反復(fù)發(fā)作[3]。國內(nèi)學(xué)者證明，豬鏈球菌在體外可以形成生物被膜[4-5]。目前國內(nèi)外

研究結(jié)果表明，14、15元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類藥物具有干預(yù)或者消除S.suis生物被膜的作用[3]，但中藥對S.suis生物被膜的干預(yù)或者消除作用鮮見報(bào)道。丁香葉具有清熱解毒、抗菌、抗炎等作用[6]，丁香葉的抗菌作用是否與其具有干預(yù)或者消除生物被膜的作用有關(guān)，值得探討。本研究通過在體外建立S.suis生物被膜模型，觀察了丁香葉水提物對S.suis生物被膜的作用，為其治療S.suis生物被膜相關(guān)感染提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 S.suis（分離株）由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供；丁香葉（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)院內(nèi)自己采摘經(jīng)鑒定為丁香葉）；阿奇霉素（國藥試劑公司）；THB培養(yǎng)基（青島高科園海博生物技術(shù)有限公司）；瓊脂；試劑：pH值7.4磷酸鹽緩沖溶液、結(jié)晶紫、甲醇、冰乙酸、犢牛血清、FeCl3。材料：卡爾加里生物膜裝置、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、0.22 μm濾膜。檢測儀器：酶標(biāo)儀（SN239591,美國Ep?och）；掃描電鏡（S-3400N，日本）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 篩選試驗(yàn)菌株 參照周永輝[9]文獻(xiàn)方法對菌株進(jìn)行分離鑒定，首先將豬鏈球菌菌株于無菌條件下在THB瓊脂平板上傳代II代進(jìn)行純化分離，然后從THB瓊脂平板上挑取單個(gè)菌落，接種于無菌THB液體試管中，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h后，比濁法將菌液濃度先調(diào)整為0.5麥?zhǔn)瞎軕乙海?.0×108CFU/mL），再用THB液體培養(yǎng)基稀釋，使菌液濃度約為1×106CFU/mL。每孔200μL菌液加到卡爾加里裝置底部板內(nèi)，只含THB液體培養(yǎng)基的孔為對照組，37℃，45 r/min搖床上培養(yǎng)。參照Stepanovic[9]的方法測定生物被膜的形成能力。篩選出形成生物被膜能力強(qiáng)的菌株。

1.2.2 丁香葉水提物的制備 量取丁香葉50.002 g，粉碎后加蒸餾水500mL，溫室浸泡過夜，煎煮1.5 h，倒出藥液，紗布過濾，再加入蒸餾水300mL煎煮1 h，倒出藥液同樣過濾，合并藥液并濃縮，濾液經(jīng)凍干機(jī)凍干。精密稱量凍干粉末1.0005 g，用4mL去離子水溶解，離心取上清液，用0.22μm濾膜過濾，保存在4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 丁香葉水提物、阿奇霉素對S.suis的最小抑菌濃度（MIC）的測定 試驗(yàn)操作及結(jié)果按照美國臨床實(shí)驗(yàn)室國家標(biāo)準(zhǔn)委員會（NCCLS）推薦的標(biāo)準(zhǔn)微量稀釋法進(jìn)行判定[10]。

1.2.4 1/2MIC對S.suis生物被膜的干預(yù)作用 將濁度為0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木合♂尩?.0×106CFU/mL，向卡爾加里生物被膜裝置每孔中加菌液和丁香葉水提物共200μL（濃度1/2MIC），另設(shè)空白對照孔（只加培養(yǎng)基）、陰性對照孔（未加藥的生物被膜生長對照）和陽性對照孔（濃度1/2MIC的阿奇霉素），每個(gè)樣品5個(gè)重復(fù)。37℃，50 r/min搖床上孵育72 h，PBS清洗2次，固定，染色，測OD595值。

1.2.5 1/2MIC對S.suis生物被膜的消除作用 將濁度為0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木合♂尩?.0×106CFU/mL，取200μL接種于96孔板中，37℃，50 r/min搖床上孵育72 h，PBS清洗2次，向卡爾加里生物膜裝置每孔中加THB培養(yǎng)基和藥液共200μL（1/2MIC），繼續(xù)于37℃，50 r/min搖床上孵育72 h，PBS清洗3次，固定，染色，測OD595值。另設(shè)空白對照孔（只加培養(yǎng)基）、陰性對照孔（未加藥的生物被膜生長對照）和陽性對照孔（1/2MIC的阿奇霉素）。

1.2.6 丁香葉水提物對S.suis生物被膜作用的形態(tài)學(xué)觀察 首先從卡爾加里生物被膜裝置上取下形成生物被膜的樁釘，并使用滅菌PBS（pH值7.2）輕輕洗滌三次以去除游離菌，用pH值7.2戊二醛固定，并置于4℃冰箱中固定1 h。依次用pH值7.2 PBS沖洗兩次，每次均為0.17 h，再用50%、70%、90%進(jìn)行脫水各一次，每次0.17 h，然后用100%乙醇脫水二次，每次0.17 h，最后100%乙醇與叔丁醇1∶1，純叔丁醇各脫水一次后，每次0.25 h，用冷凍干燥儀對樣品進(jìn)行干燥4 h。樣品表面在真空條件下鍍一層厚100A的金屬膜，SEM下觀察。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0軟件對相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計(jì)資料的比較采用單因素方差分析，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 丁香葉水提物對S.suis的最低抑菌濃度（MIC）試驗(yàn)結(jié)果 通過微量稀釋法分別測定了阿奇霉素和丁香葉水提物對S.suis的最低抑菌濃度（MIC），MIC值為0.0078μg/mL和1562.5μg/mL。結(jié)果表明，豬鏈球菌對阿奇霉素比丁香葉水提物敏感，但兩者均能抑制豬鏈球菌的生長。

2.2 1/2MIC丁香葉水提物對S.suis生物被膜的干預(yù)作用 用1/2MIC丁香葉水提物、1/2MIC阿奇霉素（陽性對照）分別和豬鏈球菌菌液共同培養(yǎng)72 h后染色，測OD595值，試驗(yàn)結(jié)果見圖1，丁香葉水提物組OD595值（0.238±0.008）明顯低于陰性對照組OD595值（0.525±0.014）但高于陽性對照組OD595值（0.205±0.004）差異極顯著（P＜0.01）。表明在1/2MIC時(shí)，丁香葉水提物對豬鏈球菌生物被膜形成抑制作用。

圖1 對豬鏈球菌生物被膜干預(yù)的作用（n=5，±SD）

2.3 1/2MIC丁香葉水提物對S.suis生物被膜的消除作用 豬鏈球菌生物被膜在72 h成熟后，用1/2MIC濃度的丁香葉水提物、阿奇霉素（陽性對照）對其生物被膜消除，試驗(yàn)結(jié)果見圖2，丁香葉水提物組OD595值（0.270±0.006）明顯低于陰性對照組OD595值（0.531±0.016）但高于陽性對照組OD595值（0.222±0.042）差異極顯著（P＜0.01）。表明在1/2MIC時(shí)，丁香葉水提物對豬鏈球菌成熟生物被膜有消除作用。

圖2 對豬鏈球菌生物被膜的消除作用 （n=5，±SD）

2.4 1/2 MIC丁香葉水提物對S.suis生物被膜作用的形態(tài)學(xué)觀察 通過掃描電鏡觀察了丁香葉水提物在干預(yù)和消除生物被膜后的形態(tài)學(xué)，結(jié)果見圖3。陰性對照組細(xì)菌鑲嵌于生物被膜中，細(xì)菌周圍有厚厚的黏液層，而丁香葉組及陽性對照細(xì)菌清晰可見，菌數(shù)減少，未見有黏液組成，表明丁香葉水提物有抑制生物被膜形成和對成熟生物被膜有消除的作用。

3 討論

丁香葉具有抗菌消炎、清肝利膽之功效，主要應(yīng)用于治療急性痢疾、乙型肝炎、黃疸型肝炎、結(jié)膜炎等疾病?，F(xiàn)代藥理研究證明，丁香葉具有清熱解毒、抗菌、抗炎、抗病毒、抗氧化、祛痰鎮(zhèn)咳等功效[6]。但丁香葉對細(xì)菌生物被膜作用方面的研究尚無報(bào)道。

圖3 藥物對S.suis生物被膜作用的形態(tài)學(xué)觀察

細(xì)菌生物被膜是由于單一或多種類細(xì)菌為了適應(yīng)周圍環(huán)境，吸附于異物或組織表面，繁殖并分泌大量多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂蛋白等多糖蛋白復(fù)合物，使得細(xì)菌相互粘連、聚集、形成具有三維立體結(jié)構(gòu)的膜樣結(jié)構(gòu)，是細(xì)菌微菌落聚集體。生物被膜的形成包括初始粘附階段、表面微菌落的形成、分化成熟3個(gè)過程。生物被膜一旦形成，膜內(nèi)細(xì)菌比浮游細(xì)菌耐藥性增加100～1 000倍以上。生物被膜阻止和抑制巨噬細(xì)胞、白細(xì)胞、抗體及抗生素侵入生物被膜中殺滅細(xì)菌，導(dǎo)致感染反復(fù)發(fā)生，難以控制[10]。

此前有報(bào)道，阿奇霉素對豬鏈球菌生物被膜的形成具有較好的抑制作用[11]。故本試驗(yàn)采用阿奇霉素做為陽性對照，證實(shí)試驗(yàn)方法正確可行。本試驗(yàn)采用1/2MIC濃度對豬鏈球菌生物被膜進(jìn)行干預(yù)與消除，結(jié)果顯示，丁香葉水提物在1/2 MIC濃度對豬鏈球菌生物被膜有明顯的干預(yù)與消除作用，掃描電鏡下觀察也表明丁香葉水提物在亞MIC濃度對豬鏈球菌生物被膜有明顯的干預(yù)與消除作用。以上研究表明，丁香葉可以抑制豬鏈球菌的粘附，抑制豬鏈球菌生物被膜的形成和對成熟的生物被膜有消除作用。有關(guān)藥理作用的研究表明，丁香葉生物活性較高，抗菌譜廣，作用效果持久。由于它克服了抗生素毒副作用較大、易使微生物產(chǎn)生耐藥性的弊端又具有抗菌和抗病毒的持久性，資源豐富，使用安全，所以在臨床應(yīng)用的前景樂觀；尤其是通過本試驗(yàn)研究也證實(shí)，丁香葉等中藥在臨床治療豬鏈球菌生物被膜相關(guān)感染性疾病方面，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

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