潘新，胡昌江，耿媛媛，趙玲，熊瑞，陳志敏

·藥理毒理·

“二神丸”中藥物炮制前后對脾腎陽虛泄瀉大鼠血清中一氧化氮和胃動(dòng)素、胃泌素的影響

潘新，胡昌江，耿媛媛，趙玲，熊瑞，陳志敏

目的：比較“二神丸”中兩味藥物炮制前后對脾腎陽虛泄瀉模型大鼠血清中一氧化氮（NO）、胃動(dòng)素（MTL）、胃泌素(GAS)含量的影響，擬闡明“二神丸”中藥物炮制增強(qiáng)療效作用機(jī)理。方法：將50只SD雄性大鼠隨機(jī)分為正常、模型、陽性藥物、生品“二神丸”、炮制品“二神丸”5組，通過復(fù)合因素造脾腎陽虛泄瀉模型，并給藥后取血清，用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定大鼠血清中一氧化氮、胃動(dòng)素、胃泌素的水平。結(jié)果：模型組血清中一氧化氮、胃動(dòng)素、胃泌素水平與正常組相比均有顯著增高（P＜0.05）；三個(gè)給藥組均能調(diào)節(jié)三者趨于正常水平，且炮制品“二神丸”組對一氧化氮、胃動(dòng)素和胃泌素的調(diào)節(jié)作用比生品“二神丸”組更明顯（P＜0.05～0.01）。結(jié)論：“二神丸”中的藥物炮制后對大鼠血清中一氧化氮、胃動(dòng)素和胃泌素的調(diào)節(jié)作用比生品“二神丸”組更為明顯，提示復(fù)方“二神丸”中藥物炮制后增強(qiáng)止瀉作用可能是通過糾正異常的一氧化氮水平和消化道激素而達(dá)到的。

二神丸；炮制；一氧化氮；胃動(dòng)素；胃泌素

“二神丸”出自宋?許叔微的《普濟(jì)本事方》，是臨床治療五更瀉的經(jīng)典古方，五更瀉的主要病機(jī)為脾腎陽虛所致的腹痛泄瀉。該方由補(bǔ)骨脂、肉豆蔻兩味藥組成，其中補(bǔ)骨脂辛苦大溫，為君藥，溫腎暖脾；肉豆蔻辛溫，為臣藥，澀腸止瀉。我們在前期研究中證明方中補(bǔ)骨脂鹽炙，肉豆蔻煨炙，可增強(qiáng)固腸止瀉作用，但其增強(qiáng)療效的機(jī)理尚不明確。故本文從致痛物質(zhì)一氧化氮（NO）及消化道激素胃動(dòng)素（MTL）、胃泌素(GAS)在脾腎陽虛泄瀉大鼠血清中的變化水平，來研究“二神丸”中藥物炮制后增強(qiáng)固腸止瀉的作用機(jī)理。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及場地

清潔級SD大鼠，雄性，體質(zhì)量200～220 g，由四川達(dá)碩動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（川）2008-24。國家中醫(yī)藥管理局中藥藥理三級科研實(shí)驗(yàn)室（NO：TCM-03-043）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

352型芬蘭（Labsystems Multiskan MS）酶標(biāo)儀，AC8型芬蘭（Thermo Labsystems）洗板機(jī)，TG16W型微量高速離心機(jī)（國產(chǎn)），GNP-9080 型隔水式恒溫培養(yǎng)箱（國產(chǎn)）；一氧化氮（NO）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20130325）；大鼠胃動(dòng)素(MTL) ELISA試劑盒，美國RB（成都光?？萍加邢薰咎峁?，批號(hào):201310-X96），大鼠胃泌素(GAS) ELISA試劑盒，美國RB（成都光?？萍加邢薰咎峁?hào):201310-X96）。

1.3 造模、治療藥物

腺嘌呤混懸液：成都貝斯特試劑有限公司，批號(hào)D110160，臨用前用蒸餾水配置成濃度為200 mg．mL-1混懸液。

番瀉葉：購于成都市藥材市場，加水煮沸約10 min后用二層紗布過濾，濾液減壓濃縮成1.0 g．mL-1的藥液。

陽性藥物：選用健脾益氣的參苓白術(shù)丸（山東方健制藥有限公司，產(chǎn)品批號(hào)20120515），用前粉碎過100目篩，用蒸餾水配置成0.2 g．mL-1的混懸液。

生品“二神丸”和炮制品“二神丸”藥液：“二神丸”中補(bǔ)骨脂和肉豆蔻的量按《中藥大辭典（方劑分冊）》中的2:1比例配比，即生補(bǔ)骨脂：生肉豆蔻（100 g: 50 g）；炮炙后同等劑量，粉碎成粗粉，醇水雙提后濃縮配制成濃度0.35 g．mL-1藥液。補(bǔ)骨脂和肉豆蔻的來源和炮制方法如下：補(bǔ)骨脂和肉豆蔻均購于成都市藥材市場，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室盧先明教授鑒定，分別為豆科植物補(bǔ)骨脂Psoralea corylifolia L.的干燥成熟果實(shí)和肉豆蔻科植物肉豆蔻Myristica fragrans Houtt.的干燥種仁。

補(bǔ)骨脂鹽炙品[1]：取補(bǔ)骨脂藥材，加入藥材量一半的食鹽水（濃度為0.02 g．mL-1），室溫悶潤24 h，于150℃炒制10 min后置托盤中于30℃鼓風(fēng)烘箱中烘干。

肉豆蔻煨炙品[2]：取肉豆蔻生品與麥麩（100 g:40 g）同置鍋內(nèi)，文火加熱，溫度控制在130～150℃，翻炒20 min，至麥麩呈焦黃色，肉豆蔻呈棕褐色。

2 方法[3～5]

將50只SD雄性大鼠隨機(jī)分為正常、模型、陽性藥物、生品“二神丸”、炮制品“二神丸”等5組，除正常組外，其余各組大鼠按以下方法造模：①腺嘌呤200 mg．kg-1劑量灌胃4周致腎陽虛；②單日、雙日交替喂飼甘藍(lán)（10 g/只）和精煉豬油（2 mL/只）致飲食失節(jié)，附以每日下午游泳致勞倦過度達(dá)到傷脾氣目的；第3周開始，在之前造?；A(chǔ)上再通過給予灌服冰番瀉葉（1 mL/100 g體重）2周達(dá)到傷脾陽的目的。從造模第4周開始，陽性組按參苓白術(shù)丸2.0 g．kg-1劑量，生“二神丸”、炮制“二神丸”組均按3.5 g．kg-1劑量(給藥劑量換算依據(jù)附正文后)，連續(xù)灌胃給藥2周。

實(shí)驗(yàn)6周后，于大鼠眼眶后靜脈叢取血2 mL，靜置30 min后，3000 r．min-1離心10 min，取上層血清，4℃保存待測。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按一氧化氮（NO）測試盒說明書和胃動(dòng)素（MTL）、胃泌素(GAS)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒說明書操作，分別在酶標(biāo)儀550 nm和450 nm波長下讀測量各孔的吸光度（OD值），計(jì)算結(jié)果見表1。

表 1 對脾腎陽虛泄瀉模型大鼠NO、MTL、GAS的影響（, n=10）

表 1 對脾腎陽虛泄瀉模型大鼠NO、MTL、GAS的影響（, n=10）

注：與正常組比較，▲P＜0.05，▲▲ P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05, ** P＜0.01；與生品“二神丸”組比較，#P＜0.05，##表示P＜0.01

組別 劑量(g．kg-1) NO(μmol．L-1) MTL(ng．L-1) GAS(ng．L-1)正常組 - 7.93±6.49 189.30±29.29 131.78±15.11模型組 - 12.83±1.82▲▲243.06±28.14▲▲261.14±24.44▲▲陽性藥物組 2.0 8.52±1.20**196.37±30.73**188.89±31.39**生品“二神丸”組 3.5 11.70±3.94**217.52±25.75**210.92±28.37**炮制品“二神丸”組 3.5 9.94±2.85**#206.91±31.12**#179.02±33.21**##

由表1可知，模型組血清中一氧化氮、胃動(dòng)素、胃泌素水平與正常組相比均有顯著增高（P＜0.05）；給藥后，陽性藥物組、生品“二神丸”組和炮制品“二神丸”組均能調(diào)節(jié)三者含量，使趨于正常水平，且炮制品“二神丸”組對NO、胃動(dòng)素和胃泌素的調(diào)節(jié)作用比生品“二神丸”組更明顯（P＜0.05～0.01）。

4 討論

現(xiàn)代研究認(rèn)為一氧化氮（即血管內(nèi)皮舒張因子），在作為一種反應(yīng)性極強(qiáng)的自由基，兼有第二信使和神經(jīng)遞質(zhì)作用，是與疼痛有關(guān)的一種非經(jīng)典的新型遞質(zhì)和信息傳遞分子，具有致痛和疼痛增敏的作用。許多研究證明健脾類藥物可以改善脾陽虛模型大鼠血漿中NO的水平[6～7]。還有研究認(rèn)為一氧化氮的水平在腎陽虛證發(fā)病機(jī)制中具有重要意義[8]。胃動(dòng)素與胃泌素是調(diào)節(jié)消化道功能的重要激素，胃動(dòng)素具有促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)的生理功能；胃泌素具有促進(jìn)胃酸、胃蛋白酶分泌，促進(jìn)消化道粘膜生長，促進(jìn)胃腸道平滑肌收縮，松弛幽門括約肌等多種生理功能[9～11]。兩者在血漿中的水平與腹痛腹瀉有重要聯(lián)系。

脾腎陽虛泄瀉模型大鼠血清中一氧化氮、胃動(dòng)素和胃泌素的含量明顯高于正常組，體現(xiàn)了大鼠經(jīng)造模后出現(xiàn)了胃腸運(yùn)動(dòng)機(jī)能興奮的情況，故表現(xiàn)為腹瀉。經(jīng)給藥后，伴隨著異常的血清一氧化氮、胃動(dòng)素、胃泌素水平的恢復(fù)，大鼠的腹瀉情況也明顯有改善。復(fù)方“二神丸”中的藥物補(bǔ)骨脂和肉豆蔻經(jīng)過炮制后組方的“二神丸”組對大鼠血清中一氧化氮、胃動(dòng)素和胃泌素的調(diào)節(jié)作用比生品“二神丸”組更為明顯，提示復(fù)方“二神丸”中藥物炮制后增強(qiáng)止瀉作用可能是通過糾正異常的一氧化氮水平和消化道激素而達(dá)到的。

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（責(zé)任編輯：陳思敏）

The infuence of “Ershen Wan” on NO, MTL and GAS in serum of the Spleen-Kidney Yang defciency rats before and after processing

PAN Xin, HU Chang-jiang, GENG Yuan-yuan, ZHAO Ling, XIONG Rui, CHEN Zhi-min//((Pharmacy College, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; The Ministry of Education Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicine; State Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources Co-founded by Sichuan Province and MOST, Chengdu 611137, China)

Objective:To compare the influence of two medicines before and after processing in “Ershen Wan” on the content of NO, motilin (MTL), gastrin (GAS) in serum of Spleen-Kidney Yang defciency rats, and provide experimental basis for mechanism of enhancing curative effect after processing.Method:50 SD male rats were randomly divided into 5 groups: normal, model, positive drug, “Ershen Wan”, and “Ershen Wan” processed. Spleen-kidney yang deficiency diarrhea rats model were established with composite factors. The plasma from arteria cruralis was collected after treatment, and the contents of NO, MTL, and Gas were detected using ELISA method.Result:NO、MTL、Gas in model group were signifcantly increased compared with normal group (P＜0.05). The positive, " Ershen Wan" and " Ershen Wan" processed groups can all signifcantly regulate the contents of NO, MTL, and Gas to normal level. Compared with " Ershen Wan " group, the impact on NO, MTL, and Gas was more significant in " Ershen Wan " processed group (P＜0.05～0.01).Conclusion:The component medicine in “Ershen Wan”after processing can strength antidiarrheal effects which suggest that the mechanism may be related to the mediation by retrieving abnormal levels of NO and gastrointestinal hormone.

Ershen Wan；processed products；NO；MTL； GAS

R 285.5

A

1674-926X(2014)05-009-03

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81274085）

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都 611137

潘新，在讀博士研究生，主要從事中藥學(xué)研究Tel:18607196428 Email:px520520@126.com

胡昌江，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥炮制學(xué)的教學(xué)和研究Tel:13980980796 Email:hhccjj@hotmail.com

2013-12-26