李 毅，段蘊(yùn)鈾，韓志海，劉于紅

(北京海軍總醫(yī)院，北京100048)

李輝等［1］研究證實(shí)，海水浸泡胸部開放傷可導(dǎo)致嚴(yán)重的急性肺損傷(ALI)，最終發(fā)展為多器官功能衰竭。ALI的本質(zhì)是全身炎癥反應(yīng)在肺部的表現(xiàn)，主要特征是肺泡毛細(xì)血管損傷導(dǎo)致肺通透性增加，目前尚缺乏針對其發(fā)病機(jī)制有效的治療措施，病死率較高［2］。地塞米松是目前治療非心源性肺水腫的主要藥物，但其對于海水浸泡胸部開放傷所致ALI的作用尚缺少相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究，治療價值尚無定論。2010年10～12月，我們觀察了地塞米松早期干預(yù)對胸部開放傷海水浸泡所致ALI的治療作用，現(xiàn)分析結(jié)果并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康成年雜交犬16只，購自北京科宇動物養(yǎng)殖中心(合格證號:SCXF-京-2008，普通級)，體質(zhì)量10～15 kg，雌雄各半;隨機(jī)分為對照組和治療組各8只。地塞米松磷酸鈉(天津藥業(yè)焦作有限公司)，伊文思藍(lán)(上海恒源科技有限公司);血?dú)夥治鰞x(OMNFC型，瑞士Roche)，血清型及組織型肺泡表面活性蛋白A(SP-A)、肺泡表面活性蛋白B(SP-B)試劑盒及SP-B抗體(Rapid Bio Lab，美國)。配方海水［3］(按照國家海洋局第三海洋研究所提供的我國東南沿海海水主要成分配制，滲透壓1 250～1 350 mmol/L，pH值8.20，比重1.05～1.06，溫度22℃)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 ALI模型建立及干預(yù) 對照組和治療組均制作ALI 術(shù)前禁食12 h，肌肉注射氯胺酮(20 mg/kg)麻醉，術(shù)中應(yīng)用地西泮(安定)肌肉注射維持。右頸部、右胸部備皮。經(jīng)口腔氣管插管，貼電極膜連接導(dǎo)線用于心電監(jiān)護(hù)。分離右側(cè)頸靜脈及頸動脈置入單腔深靜脈穿刺管，用于抽取動靜脈血。用銳器于右胸第4肋間制成直徑為0.5 cm切口使胸膜腔與大氣相通，通過胸壁切口向胸腔內(nèi)注入人工海水(35 mL/kg)，5 min內(nèi)結(jié)束，然后封閉胸壁傷口。致傷30 min對照組于頸靜脈注射生理鹽水5 mL;治療組頸靜脈注射地塞米松1 mg/kg(加生理鹽水配制成5 mL)。所有犬在實(shí)驗(yàn)6 h后給以放置胸腔閉式引流、靜脈輸入5%葡萄糖，繼續(xù)觀察4 h。

1.3 觀察項(xiàng)目

1.3.1 動脈血?dú)夥治?分別于實(shí)驗(yàn)0、6、8、10 h抽取動脈血檢測兩組動脈血氧分壓(PaO2)，計算氧合指數(shù)(PaO2/FiO2，F(xiàn)iO2取21%)。

1.3.2 血漿、支氣管肺泡灌洗液(BALF)中SP-A、SP-B水平 分別于致傷0、2、4、6、8、10 h采集靜脈血，離心后取上清－20℃保存;實(shí)驗(yàn)10 h后行右下肺氣管鏡下肺泡灌洗，BALF離心后取上清－20℃保存。采用ELLS法檢測外周血和BALF中SP-A、SP-B含量。

1.3.4 血管外肺水含量指數(shù)(伊文思藍(lán)漏出指數(shù)，EVL-WI) 采用質(zhì)量法。所有犬于實(shí)驗(yàn)10 h后處死后，迅速開胸，結(jié)扎肺門;取下右上肺并剪成兩半(接扎切口防止液體流出)，各稱濕質(zhì)量;一半肺即刻剪碎;按1 mL/100 mg組織加入生理鹽水勻漿，分別測血液和勻漿中Hb含量，剩余組織勻漿迅速置于－70℃保存?zhèn)溆?另一半肺置于80℃烘箱內(nèi)干燥72 h至恒質(zhì)量，稱肺干質(zhì)量;計算公式:總肺水量指數(shù)(TLW)=(肺濕質(zhì)量－肺干質(zhì)量)/肺濕質(zhì)量;每克濕肺含殘血量=(勻漿液Hb/血液Hb)×勻漿總樣本量×1.055/勻漿肺質(zhì)量;濕肺含殘血量=肺濕質(zhì)量×每克濕肺含殘血量，EVL-WI=(肺濕質(zhì)量－肺干質(zhì)量－濕肺含殘血量)/肺濕質(zhì)量。

1.3.4 肺微血管通透性 用藥結(jié)束后經(jīng)股靜脈注射1%伊文思藍(lán)20 mg/kg，20 min后抽血檢測血中Evans Blue含量。開胸取右肺上葉后經(jīng)肺動脈插入的針頭，以等滲鹽水灌洗肺微血管至肺靜脈無血性液體流出為止，然后置于80℃烤箱72 h至恒質(zhì)量，取少量干肺稱重，按3 mL/100 mg干肺加入甲酰胺，37℃孵育48 h，使藍(lán)染的標(biāo)本退色。1 500 r/min離心5 min分離上清，上清及抗凝血分別置721分光光度計620 nm波長處比色，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得肺組織和血中伊文思藍(lán)含量。用伊文思藍(lán)漏出指數(shù)(ELI)表示肺微血管通透性。ELI=肺組織伊文思藍(lán)含量/(肺干重×血液伊文思藍(lán)含量)。

1.3.5 肺組織SP-B蛋白表達(dá) 采用免疫組化法。組織切片脫蠟，依次經(jīng)3%過氧化氫溶液封閉，胃蛋白酶抗原修復(fù)，山羊血清封閉，逐步加入SP-B抗體及二抗，最后經(jīng)DAB溶液顯色。胞質(zhì)有棕黃色顆粒沉著為陽性細(xì)胞。每組隨機(jī)抽取染色清晰的切片3張，每張切片于光鏡下(×200)隨機(jī)選取5個視野，固定窗口面積，利用圖像分析系統(tǒng)軟件測定SP-B蛋白表達(dá)的灰度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)以s表示，兩組組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析或t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動脈血?dú)?致傷后出現(xiàn)急性呼吸窘迫表現(xiàn)，PaO2顯著降低，致傷6 h后兩組 PaO2/FiO2均 ＜300，符合ALI診斷標(biāo)準(zhǔn)。治療組在實(shí)驗(yàn)第8、10 h PaO2明顯高于對照組(P均＜0.01)。見表1。

2.2 血清及BALF中SP-A、SP-B含量 治療組及對照組BALF中SP-A含量分別為24.076±6.845、16.201±7.687，P＜0.05;SP-B含量分別為31.785 ±8.576、19.472±6.865，P＜0.01。兩組不同時點(diǎn)血清SP-A、SP-B含量比較見表2。

表1 兩組動脈血PaO2及PaO2/FiO2變化(s)

表1 兩組動脈血PaO2及PaO2/FiO2變化(s)

注:兩組同一時間點(diǎn)比較，☆P＜0.01

組別 n PaO2(mmHg) PaO2/FiO2對照組8 0 h 90.4±5.6 430.5±26.8 6 h 57.4±6.2 273.4±29.6 8 h 65.4±5.1☆ 311.6±24.5☆10 h 63.5±6.9☆ 301.1±33.7☆治療組 8 0 h 88.9±3.6 423.4±17.2 6 h 55.7±2.7 265.3±13.6 8 h 74.5±4.8☆ 354.6±23.0☆10 h 76.8±8.2☆ 359.8±33.3☆

表2 兩組各時間點(diǎn)血清SP-A、SP-B含量(灰度值，s)

表2 兩組各時間點(diǎn)血清SP-A、SP-B含量(灰度值，s)

注:與對照組比較，☆P＜0.05;★P＜0.01

組別 n SP-A SP-B對照組8 0 h 20.883±3.755 20.863±5.025 2 h 22.872±4.112 22.020±3.734 4 h 29.981±3.538 24.488±3.550 6 h 35.905±9.622 33.761±8.054☆8 h 40.535±7.994☆ 36.021±7.980☆10 h 43.483±8.069★ 36.686±4.614★治療組 8 0 h 21.308±3.312 18.423±5.241 2 h 23.321±2.719 21.443±4.150 4 h 26.809±1.992 22.634±4.784 6 h 30.102±3.089 26.386±2.198☆8 h 32.168±2.926☆ 28.186±3.913☆10 h 33.677±4.643★ 27.146±4.640★

2.3 EVL-WI及ELI治療組及對照組EVL-WI分別為0.502±0.074和0.601±0.814，P＜0.05;ELI分別為0.212±0.059、0.399±0.081，P＜0.01。

2.4 肺組織SP-B蛋白表達(dá) 與治療組比較，對照組肺內(nèi)陽性Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞數(shù)量明顯減少，棕黃色染色變淺，SP-B蛋白表達(dá)減弱。對照組及治療組SP-B蛋白表達(dá)分別為13 264.964±2 386.421，37 525.401±2 814.235，P＜0.05。

3 討論

對于淹溺后早期使用糖皮質(zhì)激素的益處已有所報道［4］。丁新民等［5，6］的研究也表明糖皮質(zhì)激素在海水淹溺致急性肺損傷中可以明顯改善淹溺兔的缺氧及肺水腫狀態(tài)，并抑制兔肺組織的炎癥反應(yīng)。但地塞米松對胸部開放傷后海水浸泡致ALI的作用尚未見報道。與一般ALI的不同，胸部開放傷后海水浸泡致ALI除了會出現(xiàn)嚴(yán)重的低氧血癥外，還會引起電解質(zhì)紊亂、高滲性脫水、酸中毒等多種病理生理改變，引發(fā)全身炎癥反應(yīng)，最后出現(xiàn)多器官功能衰竭［7，8］。地塞米松作為一種簡單、有效的抗炎藥物，研究其在胸部開放傷后海水浸泡致ALI中的作用具有重要意義。

PS系統(tǒng)存在于正常肺泡表面，由肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞產(chǎn)生。正常情況下，PS由較多脂質(zhì)及少量蛋白質(zhì)構(gòu)成。PS中的蛋白質(zhì)成分又稱為表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白(SP)，包括A、B、C、D四種成分，主要以大聚集體的形式存在。在正常的肺呼吸過程中，作為存在于肺泡液氣界面的一種媒介，PS可降低肺泡的表面張力，維持大小肺泡的相對穩(wěn)定，防止小肺泡萎陷及大肺泡的過度膨脹;對于維持肺內(nèi)正常的通氣血流比值和正常肺換氣起著非常重要的作用;而SP-A、SP-B對于PS有重要的調(diào)控作用。SP-A通過分子間糖和植物血凝素結(jié)合位點(diǎn)的相互作用而聚合磷脂，對管狀髓磷脂和多板層體的形成具有重要作用;SP-A尚有拮抗血漿蛋白對PS滅活的作用及參與肺內(nèi)局部免疫和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用。Greene等［9］在發(fā)生ARDS高危患者BALF中發(fā)現(xiàn)SP-A明顯下降，SP-A異常低下者均發(fā)展成為ARDS;相反其濃度高于1.2 mg/mL者均未發(fā)展成ARDS。SP-B則直接參與肺表面張力的降低，促進(jìn)磷脂在氣液界面的吸附和擴(kuò)張，是SP發(fā)揮作用的關(guān)鍵［10，11］。本研究治療組肺泡內(nèi)SP-A、SP-B含量明顯高于對照組，而血清內(nèi) SP-A、SP-B含量明顯減少，治療組PaO2和PaO2/FiO2也明顯高于對照組，說明SP-A、SP-B對于維持肺泡通氣，提高PaO2和PaO2/FiO2有著重要作用。

肺水腫時，血漿蛋白(如白蛋白、纖維蛋白原、纖維蛋白單體、血紅蛋白等)及細(xì)胞脂質(zhì)(如膽固醇、流體膜磷脂、溶血磷脂、甘油脂等)滲出進(jìn)入肺泡腔，能與PS在氣液界面競爭，干擾PS單分子層的形成而抑制其表面活性，這是成人呼吸窘迫綜合征發(fā)病機(jī)理中的重要因素之一，也是目前使用外源性PS替代治療所急待解決的關(guān)鍵問題之一［12］。糖皮質(zhì)激素能有效的減輕肺毛細(xì)血管的滲漏，一方面提高肺泡內(nèi)SP的濃度;另一方面可阻止血漿蛋白向肺泡內(nèi)滲漏，避免SP功能的喪失。上述兩方面作用可有效保存SP的數(shù)量和功能，增加肺復(fù)張后有效的肺泡通氣面積，從而改善犬的缺氧狀況。本研究顯示在海水浸泡致急性肺損傷的6 h內(nèi)，對照組和治療組PaO2/FiO2均低于300，經(jīng)救治后均有明顯改善，但治療組改善效果明顯優(yōu)于對照組;對EVL-WI和ELI的檢測結(jié)果顯示，地塞米松可明顯減輕犬肺水腫及毛細(xì)血管漏出。

總之，早期應(yīng)用地塞米松治療胸部開放傷后海水浸泡致ALI可改善缺氧和減輕肺水腫，改善缺氧的機(jī)制部分與地塞米松維持了肺泡內(nèi)SP的數(shù)量和功能等因素相關(guān)。

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