曹際娟賈俊濤許龍巖趙麗青

沙門氏菌PFGE分型非計(jì)量多維尺度分析法的研究*

曹際娟1賈俊濤2許龍巖3趙麗青2

目的探討沙門氏菌脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）分型非計(jì)量多維尺度分析法（NMDS）。方法從國(guó)內(nèi)不同地區(qū)分離得到的24株沙門氏菌進(jìn)行PFGE分型，然后以非計(jì)量多維尺度法對(duì)PFGE分型進(jìn)行分析。結(jié)論將24株沙門氏菌顯示在三維空間，從視覺上直接揭示了表型特征相近的不同國(guó)家和地區(qū)沙門氏菌之間的相關(guān)性，為PFGE譜圖的分析提供了一種有用的工具。

沙門氏菌 脈沖場(chǎng)凝膠電泳分型 非計(jì)量多維尺度分析法

在食源性致病菌中，沙門氏菌（SA）的危害性極為嚴(yán)重，因此應(yīng)將其列為首選控制目標(biāo)。脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）具有分型能力強(qiáng)、分辨能力高、可重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是目前細(xì)菌分子分型方法的金標(biāo)準(zhǔn)［1］。

細(xì)菌PFGE帶型屬于高維數(shù)據(jù)，即每個(gè)菌株擁有很多不同的帶型。高維數(shù)據(jù)由于數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)復(fù)雜無(wú)法直接表示在低維空間（二維平面或三維空間），其數(shù)據(jù)特征很難被發(fā)現(xiàn)。多維尺度法（multidimensional scaling，MDS）是一種無(wú)監(jiān)督的用于高維數(shù)據(jù)降維的可視化工具。MDS可以分為計(jì)量多維尺度法（metric multidimensional scaling，MMDS）和非計(jì)量多維尺度法（nonmetric multidimensional scaling，NMDS）。本研究首先采用聚類分析法對(duì)進(jìn)出口食品中分離的沙門氏菌PFGE圖譜進(jìn)行分子分型，同時(shí)，探索采用NMDS來(lái)反映食品中不同沙門氏菌PFGE帶型之間的差異程度，為沙門氏菌的分子流行病學(xué)研究及沙門氏菌引起的食源性疾病溯源提供技術(shù)基礎(chǔ)。

材料與方法

1.材料

從國(guó)內(nèi)不同地區(qū)分離得到的24株沙門氏菌。PFGE相對(duì)分子量標(biāo)準(zhǔn)用布倫登盧普沙門氏菌H9812（Salmonella Braenderup），由廣東省疾病預(yù)防控制中心贈(zèng)送。

一次性血瓊脂平板，廣州環(huán)凱公司；限制性內(nèi)切酶Xba I、Trisbase，美國(guó)Promega公司；SLS（Sodium lauroyl Sarcosine）、SDS，美國(guó)Sigma公司；蛋白酶K，德國(guó)Merck；SeaKem Gold瓊脂糖，美國(guó)Biorad公司。Chef Mapper脈沖場(chǎng)電泳儀、Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)BIO-RAD公司。

2.脈沖場(chǎng)凝膠電泳［4］

參照美國(guó)PulseNet的沙門氏菌PFGE分子分型標(biāo)準(zhǔn)方法。將酶切后的膠塊置于10孔梳齒上，緩慢倒入1%SKG瓊脂糖。待凝固后，放入盛有2.2L 0.5× TBE緩液的電泳槽中。在14℃、脈沖時(shí)間2.16～63.8s條件下，電泳18h；電泳完畢后，用EB染色30m in，脫色90m in，最后用GelI 3ac EQ拍攝圖像。

3.脈沖場(chǎng)凝膠電泳圖譜的非計(jì)量多維尺度分析

設(shè)X為高維數(shù)據(jù)矩陣，即原始空間中的點(diǎn)的集合，

式（1）中，x為觀察對(duì)象向量，n為X中觀察對(duì)象的個(gè)數(shù)。

D＝｛dij｝為X中第i個(gè)和第j個(gè)觀察對(duì)象的距離構(gòu)成的矩陣，1≤j＜i≤n。

計(jì)量MDS的目標(biāo)是尋找二維或三維構(gòu)造空間中的n個(gè)點(diǎn)組成的點(diǎn)集Y＝｛y1，y2，…，yn｝，Y為n×k（k＝2或3）維構(gòu)造矩陣，使其距離矩陣H＝｛hij｝與D中對(duì)應(yīng)元素相對(duì)大小保持一致，即將D的對(duì)角線下方元素按升序排列di1j1≤di2j2≤…≤dimjm，m＝n（n-1）/2，H的對(duì)角線下方元素也滿足hi1j1≤hi2j2≤…≤himjm，m＝n（n-1）/2。

采用Kruskal算法求解Y［5］：

式（2）中Stress為脅強(qiáng)系數(shù)，表示構(gòu)造矩陣與原始矩陣的距離偏差占原距離矩陣的比重。

在k固定的情況下，按照最小二乘單調(diào)回歸求得脅強(qiáng)系數(shù)的最小值，此時(shí)對(duì)應(yīng)的Y就為k維最佳擬合構(gòu)造矩陣，從而實(shí)現(xiàn)了X的降維。

將24株沙門氏菌進(jìn)行PFGE分析，獲得菌株兩兩之間的Dice相似性矩陣S（S＝｛sij｝）。按如下方法將相似性矩陣轉(zhuǎn)換為距離矩陣D（D＝｛dij｝）：

式（3）中，i和j為菌株在矩陣X中的序號(hào)。

在MATLAB R2009b（Version 7.9.0.529）中完成NMDS分析的所有步驟。

首先計(jì)算k＝2時(shí)的脅強(qiáng)系數(shù)，如果其小于0.20，則根據(jù)Y繪制二維平面圖；否則k＝3，再次計(jì)算脅強(qiáng)系數(shù)，如果其小于0.20，則根據(jù)Y繪制三維圖，如果脅強(qiáng)系數(shù)仍大于0.20，則表示X的數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)無(wú)法用計(jì)量MDS實(shí)現(xiàn)降維。

用Shepard圖來(lái)顯示NMDS的擬合效果。

結(jié)果與分析

1.脈沖場(chǎng)凝膠電泳結(jié)果

制備染色體全基因組DNA，用限制性內(nèi)切酶Xba I酶切，經(jīng)PFGE分離，產(chǎn)生10～16條DNA片段，所有菌株的基因組DNA顯示出良好的分型能力（圖1，圖2），分子質(zhì)量大小在（20～1100）kb之間。

圖1 沙門氏菌PFGE電泳圖（M：沙門氏菌H9812；1-12：SA1-SA12）

圖2 沙門氏菌PFGE電泳圖（M：沙門氏菌H9812；1-12：SA13-SA24）

3.非計(jì)量多維尺度分析

（1）沙門氏菌PFGE分型NMDS圖

k＝2時(shí)，脅強(qiáng)系數(shù)為0.22，大于0.20，因此在二維構(gòu)造空間中無(wú)法找到合適的點(diǎn)；

k＝3時(shí)，脅強(qiáng)系數(shù)為0.14，小于0.20，因此在三維構(gòu)造空間中可以找到合適的點(diǎn)，可以表示原始空間中的點(diǎn)。用MATLAB繪制NMDS三維圖（圖3）。

圖5顯現(xiàn)了24株沙門氏菌相似程度的遠(yuǎn)近，距離近的兩個(gè)點(diǎn)的相似性高，距離遠(yuǎn)的兩個(gè)點(diǎn)的相似性低。

圖3 沙門氏菌PFGE圖譜NMDS三維圖

圖3結(jié)合圖4可以準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)各點(diǎn)之間的相似程度：

從整體上看，24株沙門氏菌可以分成3群：SA2、SA5、SA11、SA19、SA21、SA22、SA23和SA29；SA1、SA8、SA12、SA18和SA20；SA4、SA6、SA10、SA13、SA14、SA15、SA16、SA17和SA24。SA3和SA7位于前兩群的交界處，分類不明顯。

進(jìn)一步觀察NMDS圖的局部。SA2、SA9和SA11非常接近，表明這3株菌相似性非常高。SA2和SA11都是德爾卑沙門氏菌，分別從歐洲進(jìn)口凍豬肚和從廣州出口凍雞中分離到的。SA9是從廣州同一家禽廠出口凍雞中分離出的烏普薩拉沙門氏菌。SA13-17是此次分離的5株傷寒沙門氏菌，這5株菌都位于第三群中，從圖3和圖4可以看出這5株菌之間相似的關(guān)系。它們大體上空間位置排列依次為：SA14、SA13、SA16、SA15和SA17。SA13和SA14相似性高，SA15、SA16和SA17相似性高，而排序兩端的菌之間相似性低。SA14、SA15和SA17是從廣東的出口食品中分離的，NMDS圖顯示這3株菌并不完全相關(guān)。SA13和SA16是從歐洲進(jìn)口的肉制品中分離到的，NMDS圖顯示這兩株菌也不相關(guān)。SA2、SA4和SA11是此次分離的3株德爾卑沙門氏菌，從圖3可以看出SA4與另外兩株菌的距離很遠(yuǎn)，SA4與另兩株菌相似性差別較大。

按24株沙門氏菌不同來(lái)源分析，SA20分離自美國(guó)食品，它位于最外圍；SA8和SA21分離自澳大利亞食品，它們?cè)贜MDS圖中較為接近；SA12、SA19和SA23分離自烏拉圭食品，它們?cè)贜MDS圖中也較為接近；其余的18株沙門氏分離自廣東出口食品和歐洲進(jìn)口食品，這兩個(gè)來(lái)源的菌相互交錯(cuò)分布無(wú)法分開。

（2）擬合分析結(jié)果

NMDS的擬合效果Shepard圖見圖5。

Shepard圖是構(gòu)造空間中各點(diǎn)之間距離對(duì)原始空間中各點(diǎn)之間距離的散點(diǎn)圖，可以幫助確定NMDS分析的擬合效果。在NMDS分析中，Shepard圖也顯示了原始空間中各點(diǎn)之間的距離對(duì)其單調(diào)轉(zhuǎn)換的散點(diǎn)圖。圖5中圓圈的分布延1：1線向下彎曲，說明構(gòu)造空間中各點(diǎn)之間距離對(duì)原始空間中各點(diǎn)之間距離偏離較大，這也是NMDS比MMDS更靈活的體現(xiàn)，MMDS試圖尋找構(gòu)造空間中的點(diǎn)，使各點(diǎn)之間的距離盡可能地接近原始空間中各點(diǎn)之間的距離；而NMDS試圖探尋原始空間中各點(diǎn)之間距離的單調(diào)轉(zhuǎn)換，使構(gòu)造空間體現(xiàn)這種單調(diào)轉(zhuǎn)換的順序關(guān)系（相對(duì)距離）。

圖4 沙門氏菌PFGE圖譜NMDS三維圖的3個(gè)方向視圖

圖5 沙門氏菌PFGE圖譜NMDS擬合效果Shepard圖

討 論

非計(jì)量多維尺度分析法和傳統(tǒng)UPGMA聚類分析法是兩種常用的PFGE圖譜分析方法，在實(shí)際應(yīng)用過程中兩者在不同方面各有優(yōu)劣［2-3］。聚類分析法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是以聚類樹狀圖來(lái)呈現(xiàn)的。在樹狀圖中，相似性高的菌株在高相似性（“樹枝”方向）處聚為一類，相似性低的菌株在低相似性（“樹根”方向）處被歸為一類。因此，可通過樹狀圖直接判斷哪些菌株歸屬于同一類群。NMDS三維圖雖然可以清晰的表示各點(diǎn)之間的遠(yuǎn)近關(guān)系，但無(wú)法直接產(chǎn)生類似于聚類分析法中的類群信息。為了解決這一問題，可以通過K-均值聚類將NMDS三維圖中的點(diǎn)進(jìn)行聚類。本研究對(duì)此次分析的數(shù)據(jù)按3-5類別分別進(jìn)行K-均值聚類后發(fā)現(xiàn)，其聚類結(jié)果與傳統(tǒng)PFGE分析采用的UPGMA聚類結(jié)果十分接近（數(shù)據(jù)未列出）［4］。

聚類分析法僅能將相近的菌株放在一簇，卻并不能體現(xiàn)菌株兩兩之間的異同。相比于聚類分析法，NMDS方法能更進(jìn)一步地顯示菌株之間的相似性關(guān)系，即能夠發(fā)現(xiàn)任意兩株菌之間的相似性關(guān)系。例如：從圖3可以看出5株傷寒沙門氏菌的空間位置排列依次為：SA14、SA13、SA16、SA15和SA17，這5株菌兩兩菌株之間的相似性關(guān)系一目了然。

NMDS是一種高維數(shù)據(jù)降維技術(shù)，對(duì)原始數(shù)據(jù)會(huì)有信息損失，這是任何降維方法不可避免的問題。例如：SA2、SA9和SA11這3個(gè)點(diǎn)相似性100%，在高維空間中是重合的，但在NMDS圖上3點(diǎn)卻是分開的。這是因?yàn)镹MDS雖然在低維空間顯示了高維空間的數(shù)據(jù)，卻在局部改變了原始的數(shù)據(jù)信息。因此，NMDS更適合做“全局”分析，在“局部”點(diǎn)的分析上應(yīng)該結(jié)合聚類分析法等不改變?cè)紨?shù)據(jù)信息的方法綜合進(jìn)行。

本研究分離的24株沙門氏菌分布在3個(gè)群、15種血清型中，雖然PFGE分型結(jié)果顯示型別較分散，無(wú)明顯規(guī)律，但通過本研究初步了解了進(jìn)出口食品中沙門氏菌的分子型別，為今后建立沙門氏菌分子分型數(shù)據(jù)庫(kù)、分析進(jìn)出口食品中沙門氏菌的分子流行趨勢(shì)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)［5］。同時(shí)，本研究建立了進(jìn)出口食品中沙門氏菌PFGE譜圖的NMDS分析方法，對(duì)進(jìn)出口食品中分離的24株沙門氏菌的高維帶型信息進(jìn)行降維，成功將24株沙門氏菌顯示在三維空間，從視覺上直接揭示了表型特征相近的不同國(guó)家和地區(qū)沙門氏菌之間的相關(guān)性，為PFGE譜圖的分析提供了一種有用的工具，進(jìn)一步促進(jìn)PFGE方法在食品中病原菌污染源的追蹤和溯源、進(jìn)出口食品把關(guān)以及食源性疾病的控制等方面的應(yīng)用。

1.李燕俊，趙熙，楊寶蘭，等.腸炎沙門氏菌脈沖場(chǎng)凝膠電泳分型研究.衛(wèi)生研究，2005，34（3）：338-340.

2.王麗麗，徐建國(guó).脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)（PFGE）在分子分型中的應(yīng)用現(xiàn)狀.疾病監(jiān)測(cè)，2006（21）5：276-279.

3.陳太基.封幼玲.脈沖場(chǎng)凝膠電泳用于李斯特菌分型及分子流行病學(xué)研究.中國(guó)人獸共患病雜志，2000，16（1）：90-93.

4.許龍巖，袁慕云，劉靜宇，等.進(jìn)出口食品中沙門氏菌PFGE分型及耐藥研究.檢驗(yàn)檢疫學(xué)刊，2010，20（2）：14-17.

5.Kruskal JB.Multidimensional scaling：a numerical method.Psychometrika，1964，29（2）：115-129.

（責(zé)任編輯：郭海強(qiáng)）

遼寧省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)20102080）

1.遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局（116033）

2.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局

3.廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局