徐 洋，余旭平，沈錦玉，姚嘉赟，郝貴杰，潘曉藝，尹文林

（1.浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310020；2.浙江省淡水水產(chǎn)研究所，浙江湖州 313001）

羅非魚無乳鏈球菌溶血素的產(chǎn)生條件及特性

徐 洋1，2，余旭平1*，沈錦玉2，姚嘉赟2，郝貴杰2，潘曉藝2，尹文林2

（1.浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310020；2.浙江省淡水水產(chǎn)研究所，浙江湖州 313001）

不同的培養(yǎng)條件影響羅非魚無乳鏈球菌分離株L4產(chǎn)生β-溶血素的溶血價。最佳培養(yǎng)條件為將種子液按1∶20的比例接種于THB肉湯培養(yǎng)基中，28℃靜置培養(yǎng)120h。該溶血素對熱非常敏感，在-20℃保存較穩(wěn)定，在4，28，37℃保存均易失活。人O型血紅細胞對該溶血素最敏感，其次為小鼠和羅非魚的紅細胞，再次為黃顙魚、鯽魚、人的A、B、AB型血紅細胞，草魚紅細胞對其最不敏感。

羅非魚；無乳鏈球菌；溶血素；培養(yǎng)條件；特性

近幾年來，中國幾大羅非魚主養(yǎng)區(qū)相繼暴發(fā)羅非魚鏈球菌?。?-7］，該病的傳播途徑多，且傳染能力極強，對漁業(yè)生產(chǎn)造成巨大危害。作者從2009年海南某地患暴發(fā)性鏈球菌病的羅非魚體分離鑒定一株羅非魚無乳鏈球菌分離株L4［8］，該菌在綿羊血平板上產(chǎn)生β溶血現(xiàn)象，因此認定該菌能夠產(chǎn)生β-溶血素。本試驗就羅非魚無乳鏈球菌溶血素產(chǎn)生的相關(guān)條件及其特性開展研究，旨在為今后開展羅非魚無乳鏈球菌致病機理的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

羅非魚無乳鏈球菌分離株L4系作者從2009年海南某地患暴發(fā)性鏈球菌病的羅非魚體分離獲得。

Todd-Hewitt肉湯培養(yǎng)基（THB）和萘啶酮酸購自青島海博生物技術(shù)有限公司；多粘菌素E購自湖北建國醫(yī)藥有限公司；淀粉、葡萄糖、Tween-80、SDS購自湖州華生化工物資有限公司；牛血清白蛋白（BSA）、小牛血清、瓊脂購自上海普林斯頓生物科技發(fā)展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 溶血素的產(chǎn)生條件試驗

于THB瓊脂培養(yǎng)基上復(fù)蘇羅非魚無乳鏈球菌分離株L4，挑取單菌落接種于THB，28℃靜置培養(yǎng)12h制成種子液。

培養(yǎng)溫度試驗。將上述種子液按1∶20的比例接種于THB中分別置于4，28，37，40℃靜置培養(yǎng)120h，取樣測溶血價。

培養(yǎng)基和培養(yǎng)時間試驗。將種子液按1∶20的比例分別接種到THB、含6%小牛血清的THB和含25mg·mL-1BSA、3%Tween-80的THB中，28℃靜置培養(yǎng)，分別于12，24，36，48，60，72，84，96，108，120，132，144h取樣測溶血價。

培養(yǎng)環(huán)境試驗。將種子液按1∶20接種THB，在28℃情況下，分別置于轉(zhuǎn)速110r·min-1搖床和靜置在細菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)120h，取樣測溶血價。

1.2.2 溶血價的測定

將所取樣品經(jīng)6000r·min-1離心15min，上清液用PBS倍比稀釋，再加入等體積1%的人O型血紅細胞懸液，37℃靜置1h，3000r·min-1離心10min，記錄溶血情況，同時用PBS和1%的SDS分別加入等體積的1%的人O型血細胞懸液作陰性和陽性對照，以50%紅細胞溶解的最高稀釋度為溶血價［9-10］。

1.2.3 溶血素的特性試驗

溶血譜試驗。選取羅非魚、黃顙魚、鯽魚、草魚、小鼠和人的紅細胞制備1%的血紅細胞懸液，進行溶血價的測定。

活性保存試驗。將種子液按最佳培養(yǎng)條件培養(yǎng)后，12000r·min-1離心5min，取上清液。將上清液分別保存于-20，4，28，37℃，分別于24，48，72h測定溶血價。

熱敏感試驗。將種子液按最佳培養(yǎng)條件培養(yǎng)后，12000r·min-1離心5min，取上清液。將上清液分別在37℃孵育1h，在56℃孵育30min，在100℃孵育1min，測定溶血價。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)產(chǎn)生溶血素的條件

2.1.1 溫度

圖1表明，溫度對溶血素的溶血價有較大影響，28℃時溶血價最高，達64。

圖1 溫度對溶血素產(chǎn)量的影響

2.1.2 培養(yǎng)基和時間

表1表明，不同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)時間對溶血素的溶血價有顯著影響，在24h內(nèi)3種培養(yǎng)基中均未測到溶血素，溶血素溶血價最高的是在THB中培養(yǎng)120h；在含6%小牛血清的THB中，溶血素從60h開始出現(xiàn)溶血價為4，到132h到達頂峰溶血價為16；在含25mg·mL-1BSA和3%Tween-80的THB中，溶血素從48h開始出現(xiàn)溶血價為4，到120h達到最高峰溶血價為32。

表1 培養(yǎng)基和培養(yǎng)時間對溶血素溶血價的影響

2.1.3 環(huán)境

置于28℃110r·min-1搖床培養(yǎng)48h，測得溶血價僅為16；而在28℃細菌培養(yǎng)箱內(nèi)靜置48h，測得溶血價為64。

2.2 溶血素的特性

2.2.1 溶血譜

溶血素能溶解多種動物的紅細胞，其中人O型血紅細胞對其最敏感，溶血價可達64；其次為小鼠和羅非魚的紅細胞，溶血價為32；再次為黃顙魚、鯽魚、人的A、B、AB型血紅細胞，溶血價為16；而草魚紅細胞對其最不敏感，溶血價僅為8。

2.2.2 保存活性

表2表明，溶血素在-20℃保存較穩(wěn)定，在4，28，37℃保存均易失活，24h內(nèi)丟失絕大部分活性，但隨后活性丟失速度顯著變慢。

2.2.3 熱敏感性

溶血素對熱非常敏感。37℃處理1h，溶血價從64下降至16；56℃處理30min，溶血價從64下降至4；100℃處理1min，溶血價從64下降至0。

表2 保存溫度和時間對溶血素活性的影響

3 小結(jié)和討論

羅非魚無乳鏈球菌病已成為困擾羅非魚養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的瓶頸，如何有效地防治此病，成為亟待解決的問題。開展毒力因子研究，明確致病機理將有助于解決這一問題。

目前對魚源無乳鏈球菌毒力因子的研究主要集中在莢膜多糖、CAMP因子等［11-15］，未見溶血素研究的相關(guān)報道。因此魚源無乳鏈球菌是否存在該外毒素有待進一步驗證。作者的研究結(jié)果表明魚源無乳鏈球菌能產(chǎn)生β-溶血素，同時作者就溶血素的最佳產(chǎn)生條件及特性開展了相關(guān)研究，明確了該外毒素的最佳產(chǎn)生條件，為今后成功復(fù)制該毒素提供保障。

該溶血素的溶血譜檢測結(jié)果顯示，人O型血紅細胞對其最敏感，其次為小鼠和羅非魚的紅細胞，再次為黃顙魚、鯽魚、人的A、B、AB型血紅細胞，草魚紅細胞對其最不敏感。說明人O型血紅細胞與人的A、B、AB型血紅細胞存在顯著的差異，敏感性相差4倍；且人O型血紅細胞的敏感性高于小鼠和羅非魚的紅細胞。通過人工感染試驗已明確該分離株對小鼠和羅非魚均具有較強致病力［8］，該分離株可能為人畜共患病原［16-17］。至于人血紅細胞不同型之間的敏感性差異有待研究。

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（責(zé)任編輯：張才德）

S91文獻標志碼：A文章編號：0528-9017（2014）07-1096-03

文獻著錄格式：徐洋，余旭平，沈錦玉，等.羅非魚無乳鏈球菌溶血素的產(chǎn)生條件及特性［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014（7）：1096-1098.

2014-05-15

湖州市科技攻關(guān)計劃項目（2010GG02）

徐 洋（1985-），女，浙江永康人，助理研究員，從事魚類病害防治工作。E-mail：fionxu@foxmail.com。

余旭平。E-mail：xpyu@zju.edu.cn。