王 嵐，金建峰，蔣 明，趙羅鵬，田 星，樓瀟瀟

（臺州學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江椒江 318000）

結(jié)球白菜轉(zhuǎn)錄因子基因BrCCCH的克隆與分析

王 嵐，金建峰，蔣 明*，趙羅鵬，田 星，樓瀟瀟

（臺州學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江椒江 318000）

CCCH型鋅指蛋白是1種轉(zhuǎn)錄因子，在植物生長、發(fā)育和逆境反應(yīng)中起著重要的調(diào)控作用。本研究以結(jié)球白菜葉片為材料，利用PCR技術(shù)克隆到1個CCCH基因。結(jié)果表明，BrCCCH的基因組全長為2302bp，具6個內(nèi)含子，編碼450個氨基酸，BrCCCH編碼蛋白有5個保守的C-X8-C-X5-C-X3-H基序；序列比對結(jié)果表明，BrCCCH與13種植物CCCH基因的相似性為45%～97%，與同屬植物蕪菁的相似性最大，與禾本科的烏拉爾圖小麥的相似性最??；從進(jìn)化樹上看，不同科的植物各自聚為1組，支持率達(dá)100%。BrCCCH基因的克隆為后續(xù)開展其表達(dá)分析和基因功能鑒定奠定了基礎(chǔ)。

結(jié)球白菜；CCCH；基因克?。晦D(zhuǎn)錄因子

轉(zhuǎn)錄因子（transcriptionfactor）是1類調(diào)控因子，能與順式作用元件特異結(jié)合以控制基因的表達(dá)，在植物生長發(fā)育和對環(huán)境的響應(yīng)過程中起著重要作用［1］。轉(zhuǎn)錄因子的種類繁多，通常以基因家族形式存在，如MYB，WRKY，NAC，HLH，bZIP，ERF和鋅指蛋白（Zincfinger，ZF）等。根據(jù)結(jié)構(gòu)域中半胱氨酸（Cys）及組氨酸（His）的數(shù)量與位置，ZF可分為C2H2，C2C2，C2HC，C2C2C2C2、C2HCC2C2，C2HC5和CCCH等多個亞類［2］。其中的CCCH因蛋白質(zhì)序列中含保守的1～6個C-X4-15-C-X4-6-C-X3-H基序而得名，該結(jié)構(gòu)域富含甘氨酸和苯丙氨酸殘基［3］。CCCH能與DNA直接結(jié)合，也可與RNA相互作用，在植物生長、發(fā)育、生物及非生物脅迫過程中起著重要的調(diào)控作用。本研究以結(jié)球白菜（Brassicarapavar. pekinensis）為材料，利用PCR方法克隆1個CCCH鋅指結(jié)構(gòu)基因，并利用生物信息學(xué)手段進(jìn)行分析，為后續(xù)的基因表達(dá)和功能鑒定奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

結(jié)球白菜材料為自交系09-22，由實(shí)驗(yàn)室栽培。于3葉1心期采集葉片，置于低溫箱中保存?zhèn)溆?。同源蛋白序列下載自NCBI，分別是擬南芥（Arabidopsisthaliana）（登錄號：AEE74389.1）、蕪菁（Brassicarapa）（ADK63414.1）、山萮菜屬植物（Eutremasalsugineum）（ESQ49402.1）、薺菜（Capsellarubella）（EOA30545.1）、野草莓（Fragaria vesca）（XP_004296815.1）、桃（Prunuspersica）（EMJ24004.1）、番茄（Solanumlycopersicum）（XP_ 004229205.1）、馬鈴薯（Solanumtuberosum）（XP_ 006342757.1）、玉米（Zeamays）（DAA54000.1）、二穗短柄草（Brachypodiumdistachyon）（XP_ 003566545.1）、短花藥野生稻（Oryzabrachyantha）（XP_006644012.1）、大麥（Hordeumvulgare）（BAJ92501.1）和烏拉爾圖小麥（Triticumurartu）（EMS67785.1）。

1.2 DNA、RNA提取和cDNA合成

基因組DNA的提取采用SDS法，RNA的提取采用TRIzol法，cDNA合成利用SMARTTMPCR cDNASynthesisKit試劑盒。

1.3 基因克隆

根據(jù)NCBI已知的CCCH基因序列設(shè)計PCR引物，分別是BrC3HUP：5′-ATGGAGCGGTACGGTC-3′和BrC3HDN：5′-TTAACTTGAAGAAGTCTTAGC-3′。分別以葉片DNA和cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在20μL反應(yīng)體系中，加入2μL10×PCR緩沖液，1.5U的TaqDNAplus酶（北京鼎國），0.4μL的dNTPs（上海生工），各0.5μL上、下游引物（20μmol·L-1），40ng各模板。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性45s，51℃退火60s，72℃延伸120s，32個循環(huán)。

1.4 生物信息學(xué)分析

Scanprosite在線工具h(yuǎn)ttp：//prosite.expasy. org/scanprosite/用于保守基序的檢索；ClustalX 1.81軟件用來對齊序列；Mega3.1軟件用于構(gòu)建進(jìn)化樹，方法為鄰接法，自舉檢測次數(shù)為1000。

2 結(jié)果與分析

2.1 BrCCCH基因的序列特征

分別以結(jié)球白菜葉片DNA和cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆到相應(yīng)的序列。結(jié)果表明，BrCCCH的基因組DNA全長為2302bp，具6個內(nèi)含子，長度依次為71，76，86，95，541和80bp，其中第5內(nèi)含子最長；BrCCCH的編碼區(qū)長度為1353bp，由7個外顯子拼接而成，這些外顯子的長度為72～333bp，第7外顯子最長，第3外顯子最短（圖1）。

圖1 結(jié)球白菜BrCCCH基因的結(jié)構(gòu)（方塊表示外顯子，細(xì)線表示內(nèi)含子）

2.2 BrCCCH編碼蛋白的特征

BrCCCH基因編碼450個氨基酸，經(jīng)http：// prosite.expasy.org/scanprosite/檢索發(fā)現(xiàn)，該蛋白具5個CCCH基序，依次為RSNEPDCIYYLRtGVCG YGSRCRFNHPRD、RMGQPVCQHFMRtGTCKYGGSC KYHHPRQ、RPGEKECSYYMRtGQCKFGLTCRFNHP VP、RPDQPECQYFMRtGDCKFGASCRYHHPLD和RPGTAQCTHFAQhGICKFGPACKFDHSMA（圖2），分別位于48-76，96-124，142-170，293-321和339-367殘基位置（圖3），這5個CCCH基序可用通式C-X8-C-X5-C-X3-H表示。

圖2 結(jié)球白菜BrCCCH基因的編碼區(qū)全長序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列

圖3 結(jié)球白菜BrCCCH編碼蛋白的保守基序及位置

2.3 BrCCCH與同源序列的比對和進(jìn)化分析

利用ClustalX1.81軟件對齊不同植物的CCCH編碼蛋白序列，比對結(jié)果表明，BrCCCH與其余13種植物的相似性為45%～97%，其中與蕪菁的相似性最高，與山萮菜屬植物E.salsugineum次之，與禾本科植物CCCH的相似性最低（圖4）。從進(jìn)化樹上看，BrCCCH與同科的擬南芥、山萮菜、蕪菁和薺菜聚為1組，支持率達(dá)100%；薔薇科的野草莓和桃聚為1組，茄科的番茄與馬鈴薯聚為一組，而禾本科的玉米、二穗短柄草、短花藥野生稻、大麥和烏拉爾圖小麥另成1組，支持率均達(dá)到100%（圖5）。

圖4 BrCCCH與其他植物CCCH序列的比對

3 小結(jié)和討論

CCCH轉(zhuǎn)錄因子廣泛分布于動物、植物和微生物中，以基因家族的形式存在［4-5］。近年來，已分別從陸地棉（Gossypiumhirsutum）、水稻、黃瓜（Cucumissativus）和小麥（Triticumaestivum）等作物中克隆到CCCH基因，它們在作物不同的發(fā)育階段和不同的逆境條件下表達(dá)［6-10］。陸地棉GhZFP1基因全長1377bp，編碼區(qū)全長1020bp，編碼339個氨基酸，具C-X8-C-X5-C-X3-H和C-X5-C-X4-C-X3-H保守基序；水稻OsTZF1基因編碼區(qū)全長1209bp，編碼402個氨基酸，有2個C-X5-H-X4-C-X3-H和1個C-X7-C-X5-C-X3-H保守基序，及1個C-X5-C-X4-C-X3-H保守基序；黃瓜CsSEF1基因的編碼區(qū)全長924bp，編碼307個氨基酸；小麥TaZnFP基因的編碼區(qū)全長為1533bp，編碼510個氨基酸，具C-X5-C-X4-C-X3-H和C-X9-C-X4-CX3-H這2個保守基序。

本研究從結(jié)球甘藍(lán)中克隆到1個CCCH基因，該基因的編碼區(qū)全長為1353bp，較陸地棉GhZFP1和黃瓜CsSEF1的編碼區(qū)長，但短于水稻的OsTZF1和小麥的TaZNFP基因。BrCCCH的保守基序數(shù)量較多，但均為同種類型，即C-X8-C-X5-C-X3-H，與13種植物CCCH的相似性為45%～97%，進(jìn)化分析結(jié)果表明，不同科的植物各自聚為1組，支持率達(dá)100%。結(jié)球白菜BrCCCH基因的克隆，為后續(xù)開展其表達(dá)分析和功能鑒定奠定了基礎(chǔ)。

圖5 用鄰接法構(gòu)建的CCCH系統(tǒng)發(fā)生樹

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（責(zé)任編輯：高 峻）

Q78文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：0528-9017（2014）07-1040-04

文獻(xiàn)著錄格式：王嵐，金建峰，蔣明，等.結(jié)球白菜轉(zhuǎn)錄子基因BrCCCH的克隆與分析［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014（7）：1040-1043.

2014-03-14

浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（LY13C150003）；浙江省本科院校中青年學(xué)科帶頭人學(xué)術(shù)攀登項(xiàng)目（pd2013420）；臺州學(xué)院校立學(xué)生科研項(xiàng)目（No.13XS24）

王 嵐（1992-），女，浙江天臺人，本科生，從事植物分子生物學(xué)研究工作。

蔣 明。E-mail：jiangming1973@139.com。