施婷婷，王建新，李希,3

·炮制制劑·

延胡索總生物堿提取工藝的實(shí)驗(yàn)研究

施婷婷1，王建新2，李希1,3

目的：篩選延胡索總生物堿的最佳提取工藝。方法：按正交試驗(yàn)表提取，利用生物堿易溶于酸水難溶于堿水的特點(diǎn)對(duì)提取物純化，采用紫外分光光度法測(cè)定總生物堿含量，以延胡索總生物堿含量及干膏率為檢測(cè)指標(biāo)，確定最佳提取工藝。結(jié)果：最佳提取工藝為：8倍量60%乙醇，提取3次，2h/次。結(jié)論：該工藝提取率高，穩(wěn)定性好，為延胡索總生物堿的進(jìn)一步藥理作用研究提供參考。

延胡索；生物堿；干膏率；正交試驗(yàn)

延胡索為罌粟科植物Corydalis yanhusuo W.T.Wang的干燥根莖[1]，味辛、苦，性溫，入心、肝、脾經(jīng)。其主要化學(xué)成分為生物堿，既能入血分而活血化瘀，又能走氣分而行氣止痛，為血中之氣藥，止痛之佳品?，F(xiàn)代研究表明延胡索總生物堿不僅具有止痛的作用，還具有抗胃潰瘍、鎮(zhèn)靜、催眠、降壓、抗心肌缺血和心律失常以及抗腫瘤等[2]廣泛的藥理作用；本實(shí)驗(yàn)利用生物堿易溶于酸水難溶于堿水的特點(diǎn)對(duì)提取物純化，以總生物堿的含量及干膏率為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法，優(yōu)選最佳提取工藝，為延胡索總生物堿的進(jìn)一步藥理作用研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

752型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海菁華科技儀器有限公司）；DJ-04型粉碎機(jī)（上海淀久中藥機(jī)械制造有限公司）；京制0000249號(hào)電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；DRT-TW型調(diào)溫電熱套（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；DZF系列真空干燥箱（上海華聯(lián)醫(yī)療器械有限公司）；KUDOS SK5200LH超聲儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋（上海華聯(lián)醫(yī)療器械有限公司）；延胡索藥材（批號(hào)：131028）購(gòu)自上海德華國(guó)藥制品有限公司，經(jīng)鑒定與2010版藥典一部正品相符；延胡索乙素對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110726-201213）；95%乙醇（上海振興化工一廠）；純化水（自制）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 總生物堿含量測(cè)定方法

2.1.1 溶液的制備

對(duì)照品溶液的制備 精密稱取延胡索乙素對(duì)照品適量，加無(wú)水乙醇制成每1mL含延胡索乙素80 μg的對(duì)照品溶液，搖勻，即得。

供試品溶液的制備 將5 g藥材提取物濃縮定容至50 mL，精密吸取提取液5 mL置于蒸發(fā)皿中，水浴蒸盡乙醇，5 mL水轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，HCL酸化至pH=2，氯仿（10 mL,10mL）萃取2次，取水層加氨水堿化調(diào)pH至10-11，氯仿萃取3次（10 mL,10 mL, 10 mL）,合并氯仿萃取液，用水5 mL洗一次，水浴蒸干揮盡氯仿，無(wú)水乙醇定容至25 mL，過(guò)濾取續(xù)濾液1 mL無(wú)水乙醇定容至10 mL，搖勻，即得。

2.1.2 波長(zhǎng)選擇 取延胡索乙素對(duì)照品及延胡索提取物干膏適量，無(wú)水乙醇溶解，以無(wú)水乙醇為空白參比溶液，在200-400 nm范圍內(nèi)波長(zhǎng)掃描，結(jié)果表明二者均在282 nm處有最大吸收峰，故本實(shí)驗(yàn)選282 nm為最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取上述對(duì)照品溶液1 mL，2 mL，3 mL，4 mL，5 mL，置于10 mL容量瓶中，無(wú)水乙醇定容，282 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度；以延胡索乙素的濃度(X)為橫坐標(biāo)，吸光度(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=13.874X+0.0045(r2=0.9999，n=5)。結(jié)果表明：延胡索乙素在8 μg﹒mL-1～40 μg﹒mL-1范圍內(nèi)吸光度與濃度的線性關(guān)系良好。

2.1.4 精密度 取3.2 μg﹒mL-1延胡索乙素對(duì)照品溶液，在同一條件下連續(xù)測(cè)定7次，RSD%=1.28%（n=7），結(jié)果表明方法精密度良好。

2.1.5 重復(fù)性 精密稱取延胡索藥材粗粉6份，每份5 g，正交試驗(yàn)5組條件（8倍60%乙醇提取2次，每次2 h），平行制備6組提取液，濃縮定容至50 mL，282 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，RSD%=1.27%（n=6），結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。

2.1.6 穩(wěn)定性 取延胡索提取物干膏適量，5 mL水轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，按“2.1.1”項(xiàng)下供試品方法處理，282 nm波長(zhǎng)處24 h內(nèi)（0 h，2 h，4 h，8 h，12 h，24 h）測(cè)定吸光度，RSD%=2.05%（n=6），表明藥物在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.7 加樣回收 精密稱取6份已知含量樣品干膏10.7 mg，其中含有1.2 mg生物堿（總生物堿以延胡索乙素計(jì)），分別加入對(duì)照品0.816 mg，按照供試品方法處理后，在282 nm處測(cè)定吸光度，平均加樣回收率102.497%，RSD%=2.64%（n=6），結(jié)果表明回收率良好。

2.1.8 總生物堿含量測(cè)定 分別取“3.1”項(xiàng)下得到的9組供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下供試品方法處理，282 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

2.2 干膏率的測(cè)定

精密吸取各組提取液10 mL，分別置于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，置真空干燥箱（60℃）干燥至恒重，置于干燥器中放置30 min，取出，稱重，計(jì)算干膏率。

3 正交試驗(yàn)

3.1 總生物堿乙醇提取工藝研究

取延胡索藥材粗粉9份，以乙醇為提取溶劑，在文獻(xiàn)資料[3～5]及與預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上選擇不同提取時(shí)間、提取次數(shù)、不同濃度的乙醇、溶劑倍數(shù)（表1），按正交試驗(yàn)表進(jìn)行提取，得9份樣品溶液，備用。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

3.2 正交試驗(yàn)及結(jié)果

以延胡索總生物堿、干膏率為指標(biāo)，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，采用中醫(yī)藥統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，結(jié)果見(jiàn)表2、表3 。

表2 正交試驗(yàn)總生物堿直觀分析結(jié)果

表3 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

3.3 結(jié)果分析

正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果顯示，因素A（提取次數(shù)）為主要影響因素，影響因素的主次順序A＞C＞D＞B，綜合表2、表3，確定提取條件的優(yōu)化組合為：A3B2C3D1，即8倍60%乙醇，提取3次，每次2 h。

3.4 提取工藝驗(yàn)證

由于優(yōu)選結(jié)果在正交試驗(yàn)表中未出現(xiàn)，為檢驗(yàn)其可行性，故進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)；稱取延胡索藥材粗粉50g，共3份，選用上述優(yōu)化提取工藝進(jìn)行提取，按“2.1”、“2.2”方法進(jìn)行測(cè)定；三份驗(yàn)證工藝結(jié)果總生物堿含量分別為12.004 mg﹒g-1、11.610 mg﹒g-1、12.283 mg﹒g-1，平均總生物堿含量為11.966 mg﹒g-1，干膏率分別為12.317%、12.611%、13.01%，平均干膏率為12.646%，表明優(yōu)化結(jié)果合理，穩(wěn)定可行。

4 討論

在建立延胡索總生物堿含量測(cè)定方法時(shí)，考慮到單以總生物堿的含量為考察指標(biāo)結(jié)果不夠全面，為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性，本實(shí)驗(yàn)以浸膏率為另一個(gè)考察指標(biāo)。在延胡索總生物堿含量測(cè)定方法的選擇過(guò)程中，本實(shí)驗(yàn)對(duì)酸堿滴定法[6]進(jìn)行詳細(xì)考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差較大，重現(xiàn)性差，分析結(jié)果可能是由色素干擾，讀數(shù)誤差等造成；HPLC法對(duì)中藥材有效成分含量測(cè)定誤差小，準(zhǔn)確度高，但存在耗時(shí)耗力，對(duì)色譜柱損害性大等缺點(diǎn)，綜合考慮下采用紫外分光光度法進(jìn)行總生物堿測(cè)定，簡(jiǎn)單，快捷。

在用紫外分光光度法測(cè)定總生物堿含量時(shí)，為防止色素成分干擾試驗(yàn)結(jié)果，故對(duì)總生物堿進(jìn)行初步純化后測(cè)定；在對(duì)文獻(xiàn)[7]中采用的中性氧化鋁柱考察時(shí)發(fā)現(xiàn)，純化速度慢，時(shí)間較長(zhǎng)；本實(shí)驗(yàn)利用生物堿成分易溶于酸水難溶于堿水的特點(diǎn)對(duì)提取物進(jìn)行純化，使延胡索總生物堿成分得以大量富集后進(jìn)行紫外含量測(cè)定，速度快，結(jié)果較好。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典2010年版一部[S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:94.

[2] 石俊敏,韓偉立,葉文才,等.延胡索的化學(xué)成分研究[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā),2011,23(4):647.

[3] 盧耀文,楊中林.延胡索乙素提取工藝優(yōu)選研究[J].中成藥,2008,30(8):1247.

[4] 喬立俊.延胡索有效成分提取工藝研究[J].中藥制劑工程與技術(shù),2009,10(6):23.

[5] 侯曉琳,石光,王新聞,等.延胡索總生物堿的提取純化實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育,2013,11(12):154.

[6] 黃紅英,張建華,董鈺明.延胡索與不同藥物配伍中總生物堿含量的測(cè)定[J].四川中醫(yī),2007,25(12):46.

[7] 呂子明,劉丹,劉文娟,等.正交試驗(yàn)優(yōu)選延胡索總生物堿的提取工藝[J].中國(guó)保健營(yíng)養(yǎng),2012,2:103.

（責(zé)任編輯：李蕓霞）

Study on total alkaloids extraction process of Rhizoma corydalis

SHI Ting-ting1, WANG Jian-xin2, LI Xi3//(1.Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu 610072;2.School of Pharmacy, Fudan University, Shanghai 201203;3. Sichuan Province Chinese Academy of Sciences institute of Medicine ,Chengdu 610031,Sichuan)

Objective:To choose the best extraction technology of Rhizoma corydalis.Method:According to the orthogonal test table and the characteristics of the alkaloids easy to soluble in acid to extract and purify the total alkaloids. In order to determine the best extraction conditions, the spectrophotometry was chosen to measure the total alkaloid content of the Rhizoma corydalis. And the total alkaloids content and extraction rate were selected as examine factors.Result:The best extraction conditions was as following: eight times 60% ethanol, 3 times, 2 h each time.Conclusion:The extraction effciency is high and stability, which can provide a reference for the further pharmacological effects research of Rhizoma corydalis total alkaloids.

Rhizoma corydalis; total alkaloids; dry extract yield; orthogonal test

R 932

A

1674-926X(2014)03-005-03

1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 610072；2.復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院，上海 201203；3.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院中醫(yī)研究所，四川 成都 610031

施婷婷，女（1989-），在讀碩士研究生，主要從事中藥新制劑、新劑型及中藥新技術(shù)方向研究Tel:15221151751 Email:874283948@qq.com

2014-03-03