劉偉偉，高永翔，趙靜，唐宋琪，李雪萍

·藥理毒理·

地耳草總黃酮對(duì)5/6腎切除大鼠CRF模型腎纖維化相關(guān)因子影響研究

劉偉偉，高永翔，趙靜，唐宋琪，李雪萍

目的：研究地耳草總黃酮（MSN）對(duì)大鼠CRF模型腎纖維化中結(jié)締組織生長(zhǎng)因子CTGF、白細(xì)胞介素IL-6和纖維粘連蛋白FN表達(dá)的影響，探討其抗纖維化作用機(jī)理。方法：采用ELISA法檢測(cè)5/6腎切除大鼠CRF模型血清中CTGF和IL-6的含量，采用免疫組化法檢測(cè)FN的含量。結(jié)果：MSN低、中、高各劑量組CTGF、IL-6和FN含量遠(yuǎn)低于模型組，具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論：MSN能有效降低5/6腎切除大鼠CRF模型纖維化因子CTGF、IL-6及FN含量，干預(yù)CRF模型殘余腎組織纖維化，延緩慢性腎衰。

MSN；CRF模型；腎纖維化；影響因子

慢性腎功能衰竭（Chronic Renal Failure, CRF）作為當(dāng)前臨床醫(yī)學(xué)主要難題之一，主要的病理特征為腎組織纖維化[1]。其發(fā)生受到多種因素的調(diào)節(jié)，其中結(jié)締組織生長(zhǎng)因子CTGF[2]為近年來新發(fā)現(xiàn)的致纖維化生長(zhǎng)因子，被視為TGF-β1的下游反應(yīng)元件，能夠促進(jìn)系膜細(xì)胞分泌ECM，抑制細(xì)胞外基質(zhì)降解雙重途徑，誘導(dǎo)腎小管間質(zhì)纖維化，干預(yù)CTGF的產(chǎn)生，能夠顯著抑制腎臟組織纖維化的發(fā)生，目前已成為防治腎臟纖維化的熱點(diǎn)[2]；白細(xì)胞介素IL-6[3]作重要的炎癥因子，能促進(jìn)系膜細(xì)胞增殖，且誘導(dǎo)產(chǎn)生腎臟局部炎癥，進(jìn)而促進(jìn)腎組織纖維化的發(fā)生；纖維粘連蛋白FN[4]是腎臟纖維化的效應(yīng)因子，是反應(yīng)腎臟纖維化的直觀指標(biāo)。地耳草總黃酮（MSN）是從傳統(tǒng)的治療慢性腎功能衰竭中藥中提取的有效成分，臨床治療慢性腎衰得到了廣泛證明。但是MSN對(duì)CRF治療的作用機(jī)理尚未完全清楚。本文以5/6腎切除大鼠CRF模型為研究對(duì)象，以CTGF、IL-6和FN為指標(biāo)，利用ELISA及免疫組化等實(shí)驗(yàn)手段，采取不同劑量實(shí)驗(yàn)分組對(duì)照法，探討MSN對(duì)CRF模型抗腎纖維化的具體作用機(jī)理。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠，SPF級(jí)，108只，200～220 g，雄性，質(zhì)量合格證號(hào)：No.0006045，許可證號(hào)：SCXK（川）2008-11，由成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供。

普通級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)（四川省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（川）2008-11，溫度：19～26℃，相對(duì)濕度：40 %～70 %，光照條件：12 h/12 h晝夜交替，通風(fēng)情況：10～15次/小時(shí)）；自由飲水；輻照鼠用滅菌飼料，營(yíng)養(yǎng)成分符合GB 14924.3-2010。

1.2 實(shí)驗(yàn)主要儀器

酶標(biāo)儀，Thermo Mulliskan Ascant 公司；流式細(xì)胞儀，Beckman-Coulter Quanta SC流式細(xì)胞分析系統(tǒng)；超低溫冰箱，日本SANYO, MDF-382E；離心機(jī)，德國(guó)HERASE；純水機(jī)，MilliPore；移液器，Eeppendorf。

1.3. 實(shí)驗(yàn)材料及試劑

手術(shù)刀，手術(shù)剪，縫合針，縫合線，持針鉗，鑷子，止血鉗，無菌紗布，無菌棉球，無菌明膠海綿，無菌手套，動(dòng)物手術(shù)臺(tái)，電子天平；10%水合氯醛，乙醚，75%酒精，碘伏消毒液，甲硝唑氯化納注射液，無菌生理鹽水。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模方法及結(jié)果

取檢疫合格SPF級(jí)SD大鼠108只，隨機(jī)分為6組，每組18只。分別為模型對(duì)照組、MSN高、中、低劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組、正常對(duì)照組（假手術(shù)組）。對(duì)模型對(duì)照組、MSN高、中、低劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組行左腎2/3切除術(shù)，用明膠海棉壓迫切面止血，1周后摘除右腎[5]；正常對(duì)照組作平行假手術(shù)對(duì)照。另隨機(jī)從造模組取2只大鼠解剖取殘余腎臟組織，做病理切片HE染色，殘余腎臟形態(tài)學(xué)改變說明腎小體內(nèi)細(xì)胞增生，系膜基質(zhì)增生，腎小管擴(kuò)張，間質(zhì)纖維組織增生，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，出現(xiàn)慢性腎衰纖維化早期病理改變，腎衰模型建立成功[6～10]。術(shù)后21 d及51 d分別抽血做尿素氮，血肌酐、尿酸等生化指標(biāo)檢測(cè)，均證實(shí)腎功能降低，出現(xiàn)慢性腎衰趨勢(shì)。

2.2 檢測(cè)方法

ELISA方法檢測(cè)血清CTGF及IL-6含量，免疫組化法檢測(cè)FN表達(dá)量，SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

MSN對(duì)模型大鼠CRF模型腎纖維化相關(guān)因子影響結(jié)果見表1。具體因子影響見圖1-圖3。

表1 MSN對(duì)模型大鼠血清促纖維化因子含量的影響（）

表1 MSN對(duì)模型大鼠血清促纖維化因子含量的影響（）

注：與模型對(duì)照組比較，* P＜0.05

 組別 N CTGF IL-6(ng﹒mL-1) FN(μg﹒L-1)模型對(duì)照組MSN高劑量組MSN中劑量組MSN低劑量組陽(yáng)性對(duì)照組假手術(shù)組12 13 14 13 10 14 8.39±0.14 8.07±0.16* 8.08±0.12* 8.25±0.11* 8.20±0.10* 8.16±0.11* 11.12±1.09 6.78±0.64* 6.88±0.69* 6.62±0.57* 6.50±0.41* 5.57±0.57* 0.3173±0.0049 0.2896±0.0036* 0.2913±0.0051* 0.2902±0.0024* 0.2885±0.0038* 0.2847±0.0025*

圖1 MSN對(duì)模型大鼠血清促纖維化因子CTGF含量的影響

圖2 MSN對(duì)模型大鼠血清炎癥因子IL-6含量的影響

圖3 MSN對(duì)模型大鼠腎臟免疫組化FN含量的影響

由表1和圖1可知，MSN高、中劑量組CTGF含量明顯低于模型對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.05），提示MSN藥物能夠顯著降低CTGF含量，從而抑制腎臟間質(zhì)纖維化的產(chǎn)生，且作用強(qiáng)于金水寶。由表1和圖2可知，MSN各劑量組IL-6的含量顯著低于模型對(duì)照組，高于假手術(shù)組（P＜0.05）；MSN各組與陽(yáng)性對(duì)照組無明顯差異（P＞0.05），可見MSN能夠顯著降低IL-6的含量。由表1和圖3可知，MSN各劑量組FN的含量均顯著低于模型對(duì)照組(P＜0.05)，與假手術(shù)組無明顯差異（P＞0.05）。說明慢性腎衰時(shí)，F(xiàn)N含量上升，MSN能抑制變性上皮內(nèi)該蛋白的表達(dá)，降低FN含量，從而抑制腎臟纖維化。

4 結(jié)論

研究表明，MSN能夠抑制促纖維化因子CTGF的含量和致炎因子IL-6的產(chǎn)生，進(jìn)而抑制腎小球、腎小管局部炎癥，抑制系膜細(xì)胞增殖，防治腎組織纖維化的產(chǎn)生，此外，MSN還可以直接抑制纖維化效應(yīng)因子FN的產(chǎn)生，從而顯著抑制或延緩腎臟纖維化。

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（責(zé)任編輯：陳思敏）

Research on infuence of correlation genes on kidney fbrosis of 5/6 nephrectomized rats CRF model by MSN

LIU Weiwei, GAO Yong-xiang, ZHAO Jing, TANG Song-qi, LI Xue-ping//(College of Basic Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610075, Sichuan)

Objective:To study the MSN anti-fbrosis effect through the infuence on CTGF, IL-6 and FN of chronic renal failure rats.Method:The model of chronic renal failure was established in 5/6 nephrectomized rats．Expressions including the CTGF and the IL-6 were examined by ELISA method. FN expressions were examined by immunohistochemical method.Result:Signifcant difference of CTGF, IL-6 and FN contents could be found between disease model and normal rats.Conclusion:MSN can delay chronic renal failure by reducing CTGF, IL-6 and FN content．It can interfere renal interstitial fbrosis to delay the chronic renal failure．

MSN；CRF Model；kidney fbrosis；infuence genes

R 285.5

A

1674-926X(2014)03-009-02

成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610075

劉偉偉，中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)專業(yè)博士研究生Email: sherly_liu@163.com Tel:13880691373

高永翔，教授，主要從事中藥的免疫安全性與有效性研究

2014-02-20