管 笛，潘燦平，王 文，武會娟,*

磁微粒酶聯(lián)免疫吸附法測定玉米中的伏馬毒素B1

管 笛1,2,3，潘燦平3，王 文1,2，武會娟1,2,*

（1.北京市理化分析測試中心，北京 100089；2.北京市食品安全分析測試工程技術(shù)研究中心，北京 100089；3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，北京 100094）

將磁微粒的偶聯(lián)物替代酶標(biāo)板作為固定相，用于酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測玉米中的伏馬毒素B1（fumonisin B1，F(xiàn)B1）。在直接競爭ELISA反應(yīng)中，分別引入羊抗兔抗體-磁微粒、蛋白A-磁微粒，并比較二者替代效果。通過對檢測方法的優(yōu)化，使用羊抗兔抗體、蛋白A與磁微粒的偶聯(lián)物作為固定相的檢出限分別為0.024 μg/mL和0.030 μg/mL。羊抗兔抗體-磁微粒偶聯(lián)物替代酶標(biāo)板后具有更低的檢出限，為常規(guī)ELISA法檢測限的三分之一。玉米樣品中FB1回收率范圍在76.4%～110.6%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于11%。研究建立了一種靈敏度高、穩(wěn)定性好的FB1檢測方法。

磁微粒；酶聯(lián)免疫吸附法；伏馬毒素；玉米；蛋白A

伏馬毒素（fumonisins）是20世紀(jì)80年代末期發(fā)現(xiàn)的一類由串珠鐮刀菌（Fusarium moniliforme）產(chǎn)生的真菌毒素，目前已知有28 種衍生物，其中以伏馬毒素B1（fumonisin B1，F(xiàn)B1）最為常見[1-2]。伏馬毒素具有神經(jīng)毒性、肺毒性、致癌性，可引起馬腦白質(zhì)軟化癥和豬肺水腫綜合癥，且與人類食管癌和肝癌的發(fā)生有密切關(guān)系[3-5]。國際癌癥研究機構(gòu)已將伏馬毒素列為2B級致癌物，即人類潛在致癌物[6]。鑒于伏馬毒素的危害性，世界各國對其進行嚴(yán)格限量。歐盟規(guī)定不同飼料中伏馬毒素的推薦最高限量標(biāo)準(zhǔn)為5 mg/kg[7]；美國食品藥品監(jiān)督管理局公布的食用谷物中伏馬毒素的推薦最高限量為2 mg/kg[8]。

伏馬毒素主要存在于谷物中，以玉米居多[9]。玉米是世界主要農(nóng)作物之一，也是我國大部分地區(qū)食物和飼料的重要來源。因此，加強玉米及飼料中伏馬毒素含量的測定，獲知其污染程度，有利于保障我國人民食用安全及畜牧業(yè)穩(wěn)定。

目前檢測FB1的方法主要有高效液相色譜-熒光檢測法[10-11]、高效液相色譜-質(zhì)譜檢測法[12-17]等儀器分析法，以及基于免疫學(xué)原理的酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）[18-19]、化學(xué)發(fā)光檢測法[20-23]、膠體金免疫層析法[24-25]等。這些方法在保證食品及農(nóng)產(chǎn)品安全方面發(fā)揮了重要的作用。本研究在傳統(tǒng)ELISA法的基礎(chǔ)上，引入超順磁微粒，替代酶標(biāo)板作為固相載體，使免疫反應(yīng)從二維到三維立體反應(yīng)，以期提高檢測靈敏度，促進FB1檢測技術(shù)的發(fā)展，對控制伏馬毒素的污染具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

FB1標(biāo)準(zhǔn)溶液、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺 美國Sigma-Aldrich公司；FB1多克隆抗體、FB1-HRP偶聯(lián)物 美國Beacon公司；蛋白A-磁微粒偶聯(lián)物、2.8 μm粒徑磁微粒美國Invitrogen公司；羊抗兔抗體 北京科百奧生物科技有限責(zé)任公司；96孔可拆卸酶標(biāo)板 美國Corning公司；其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 磁微粒與羊抗兔抗體的偶聯(lián)

取2.8 μm粒徑磁微粒165 μL，用pH 9.5硼酸緩沖液洗滌2 次，棄去溶液；加入4 μL質(zhì)量濃度為25 mg/mL的羊抗兔抗體，加pH 9.5硼酸緩沖液至終體積為150 μL，旋渦輕輕混勻，再加入100 μL含3 mol/L硫酸銨的pH 9.5硼酸緩沖液，搖床210 r/min，37 ℃反應(yīng)18 h；用磁鐵吸附磁微粒，棄去反應(yīng)溶液，加入1 mL含0.5% BSA的磷酸緩沖液，搖床210 r/min，37 ℃反應(yīng)1 h；利用磁鐵吸附，棄去溶液；用含0.5% BSA的磷酸緩沖液洗滌2 次，加入330 μL 0.5% BSA、0.05%硫柳汞的磷酸緩沖液，4 ℃保存待用。

1.2.2 常規(guī)ELISA方法

將羊抗兔抗體溶于pH 9.5的碳酸鹽緩沖液中至質(zhì)量濃度為40 μg/mL，加入酶標(biāo)板中，100 μL/孔，4 ℃過夜。磷酸-吐溫溶液洗板3 次后，每孔加入200 μL 1.5% BSA封閉液，37 ℃孵育2 h。磷酸-吐溫溶液洗板3 次后，每孔加入50 μL樣品/標(biāo)準(zhǔn)品溶液，50 μL FB1-HRP偶聯(lián)物，50 μL FB1抗體溶液，37 ℃反應(yīng)15 min。磷酸-吐溫溶液洗板5 次后，每孔加入100 μL顯色液，37 ℃反應(yīng)10 min后，每孔加入50 μL 2 mol/L硫酸終止反應(yīng)，450 nm波長處測定吸收度。

1.2.3 基于羊抗兔抗體-磁微粒偶聯(lián)物的ELISA方法

向96孔板每孔中加入200 μL 1.5% BSA溶液，37 ℃孵育2 h。磷酸-吐溫溶液洗板3 次后，每孔加入50 μL樣品/標(biāo)準(zhǔn)品溶液，50 μL FB1-HRP偶聯(lián)物，15 μg羊抗兔抗體-磁微粒偶聯(lián)物，50 μL FB1抗體溶液，放入搖床中，37 ℃，150 r/min，反應(yīng)15 min。將96孔板磁力板上，放置1 min，待磁微粒完全吸附在板孔底部后，吸去反應(yīng)液，并用磷酸-吐溫溶液洗板3 次，每次每孔380 μL。每孔加入100 μL顯色液，放入搖床中，37 ℃，150 r/min，反應(yīng)10 min后，每孔加入50 μL 2 mol/L硫酸終止反應(yīng)，450 nm波長處測定吸收度。

1.2.4 基于蛋白A-磁微粒偶聯(lián)物的ELISA方法

方法步驟與1.2.3節(jié)相同，將15 μg羊抗兔抗體-磁微粒偶聯(lián)物換成15 μg 蛋白A-磁微粒偶聯(lián)物。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立與數(shù)據(jù)處理

取FB1標(biāo)準(zhǔn)品溶液質(zhì)量濃度為0、0.02、0.06、0.2、0.6、1.2 μg/mL，利用以上方法分別建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。溶液吸收度通過酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定，并作圖。以抑制率為縱坐標(biāo)（抑制率=A/A0×100，式中：A為含有FB1時的吸光度；A0為質(zhì)量濃度為0時的吸光度），F(xiàn)B1質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)。測定結(jié)果用非線性四參數(shù)邏輯斯蒂擬合。方法的檢出限定義為90%抑制率時所對應(yīng)FB1質(zhì)量濃度。檢測的線性范圍定義為抑制率在20%～80%之間所對應(yīng)的FB1質(zhì)量濃度。

1.2.6 玉米樣品中FB1回收率的測定

以不同質(zhì)量濃度FB1添加于空白玉米粉樣品中，稱取20 g樣品，并量取100 mL 70%甲醇溶液至一具塞三角瓶中。劇烈振蕩3 min，靜置3 min，待樣品沉淀。用玻璃纖維濾紙過濾萃取液，并收集，取50 μL上樣定量檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 磁微粒用量的優(yōu)化

磁微粒的用量對實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性與穩(wěn)定性具有很大的影響。由于磁微粒本身沒有透光性，為棕色顆粒，加入量不當(dāng)會造成本底吸光度過大，且因磁微粒的分布不均，造成不同程度的遮光現(xiàn)象，引起吸光度不穩(wěn)定。因此本研究首先對加入不同量的磁微粒的本底吸光度進行研究，結(jié)果見表1。

表1 磁微粒的本底吸光度Table 1 Background absorbanceof magnetic particles

由表1可知，隨著加入磁微粒量的增加，透光性有一定減弱，吸光度隨之升高。羊抗兔抗體-磁微粒偶聯(lián)物的本底吸光度由0.040 6增加到0.190 8；蛋白A-磁微粒偶聯(lián)物本底吸光度由0.046 5增加到0.211 1。同時磁微粒加入的增多，本底值相對標(biāo)準(zhǔn)偏差也升高，當(dāng)加入22.5 μg磁微粒時，2 種磁微粒偶聯(lián)物的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均大于20%。

表2 磁微粒使用量對顯色結(jié)果的影響Table 2 Effect of the amount of magnetic particles used on color reaction

由表2可知，對于2 種磁微粒偶聯(lián)物來說，隨著磁微粒用量的增大，其在450 nm波長處吸收度隨之增大。但是磁微粒用量在7.5 μg時，顯色結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差較大。引起相對標(biāo)準(zhǔn)偏差變大的原因是磁微粒使用量較少，即在單位磁微粒上結(jié)合的免疫復(fù)合物較多，而在洗滌步驟中若有少量損失，由于標(biāo)記酶的級聯(lián)放大作用，會對顯色結(jié)果產(chǎn)生較大影響，造成吸光度的不穩(wěn)定。

因此，綜合考慮本底吸光度和顯色結(jié)果的影響，本研究選取15 μg作為羊抗兔抗體-磁微粒偶聯(lián)物與蛋白A-磁微粒偶聯(lián)物的最佳使用量。

2.2 洗板方式的選擇

樣品中游離的FB1（或標(biāo)準(zhǔn)品FB1）、FB1-HRP偶聯(lián)物、抗體、蛋白A-磁微粒偶聯(lián)物（羊抗兔抗體-磁微粒偶聯(lián)物）在微孔板中進行競爭反應(yīng)。與抗體-FB1/抗體-FB1-HRP偶聯(lián)物結(jié)合在磁微粒上，為避免發(fā)生非特異性反應(yīng)和降低背景值，通過磁鐵吸附聚集，未結(jié)合物需經(jīng)棄液、洗滌過程。若洗滌方式不當(dāng)，有可能造成非結(jié)合物會洗滌不徹底，吸光度偏高，也可能造成磁微粒復(fù)合物損失，使結(jié)果不穩(wěn)定。

本研究比較了洗板機洗滌和手動洗滌兩種方式。洗板機洗滌方式為在96孔板下方加上一個相應(yīng)的96孔磁力吸附板，經(jīng)過吸液-加液-吸液的過程重復(fù)3 次。手動洗滌方式為：首先利用磁鐵將磁微粒吸到微孔板底部一側(cè)，再將微孔板放到相應(yīng)的96孔磁力吸附板上，利用排槍在微孔磁微粒的另一側(cè)將廢液吸去，并加洗液至滿孔，再將洗液吸去，重復(fù)3 次。為將液體充分吸凈，在吸液過程中將微孔板抬起一定角度，有磁微粒的一側(cè)高，保證液體均流向吸液一側(cè)。通過測定標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為0、0.06、0.2、0.6、1.2 μg/mL時的顯色結(jié)果，每個質(zhì)量濃度重復(fù)3 次，比較兩種洗板方式的洗板效果。結(jié)果見圖1。由圖1可知，利用洗板機洗板的方式，顯色結(jié)果梯度不好，而且結(jié)果穩(wěn)定性差，5 個質(zhì)量濃度顯色值相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在12.57%～46.12%之間。結(jié)果不穩(wěn)定的原因在于洗板機洗板時，磁微粒被磁鐵吸附在底部均勻分開，而洗板機吸液吸力較大，且在板孔的中心部位吸取，這樣會造成一定程度的磁微粒損失。手動洗板的方式結(jié)果呈現(xiàn)較好的梯度，且5 個質(zhì)量濃度顯色值相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.37%～9.00%之間，結(jié)果穩(wěn)定性好。結(jié)果穩(wěn)定的原因在于洗板時，將磁微粒吸至一側(cè)，而吸液、加液在板孔另一側(cè)完成，整個過程磁微粒損失較小。

在洗板過程中，洗滌次數(shù)對結(jié)果也會產(chǎn)生一定的影響。洗板次數(shù)不夠，F(xiàn)B1-HRP有殘留，影響顯色結(jié)果，洗板次數(shù)過多，不僅會造成磁微粒的損失，而且會增加額外操作時間。本研究采用上述提到的手動洗滌方式，對FB1標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為0、1.2 μg/mL的孔分別洗2、3、4、5 次，每次重復(fù)結(jié)果3 次，結(jié)果見表3?？芍?，隨著洗板次數(shù)的增多，顯色結(jié)果基本穩(wěn)定，在第3次之后，干擾物已經(jīng)基本洗凈，考慮到洗板次數(shù)越多會延長檢測時間，選取洗板3 次為最佳。

圖1 不同洗滌方式的比較Fig.1 Comparison of different washing methods

表3 洗滌次數(shù)對顯色結(jié)果影響Table 3 Effect of washing number on color reaction

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的比較

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的比較Fig.2 Comparison of standard curves

本研究將蛋白A-磁微粒和羊抗兔抗體-磁微粒作為承載體，取代酶標(biāo)板引入ELISA中，并分別建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，與常規(guī)ELISA進行比較，結(jié)果見圖2。在FB1質(zhì)量濃度0～1.2 μg/mL范圍內(nèi)，承載體為酶標(biāo)板，蛋白A-磁微粒、羊抗兔抗體-磁微粒的標(biāo)準(zhǔn)曲線表現(xiàn)出較好的擬合度，R2值均大于0.999。但是3 種方法的檢出限有所不同。常規(guī)ELISA方法，即以酶標(biāo)板作為承載體的檢出限為0.076 μg/mL，蛋白A-磁微粒作為承載體的檢出限為0.030 μg/mL，羊抗兔抗體-磁微粒作為承載體的檢出限為0.024 μg/mL。由結(jié)果可知，磁微粒的引入，較常規(guī)ELISA法可以降低檢出限，提升檢測靈敏度，具體到本研究檢出限僅為常規(guī)酶聯(lián)免疫吸附法的三分之一。與常規(guī)酶標(biāo)板作為承載體相比，磁微粒具有更大的比表面積，能提供更多結(jié)合位點，在溶液中較為均一分散，表面結(jié)合的抗體反應(yīng)位點在溶液中充分暴露，降低了抗體與抗原結(jié)合的空間位阻。酶標(biāo)板包被法中，抗原通過分子布朗運動和擴散運動到微孔板的速度較慢，而磁微粒可均勻分布在溶液中，更易于接近抗原，在液相中呈三維立體反應(yīng)，從而加快與抗原的結(jié)合速度。綜上，相較常規(guī)酶標(biāo)板，在相同時間內(nèi)，磁微粒的引入可使免疫反應(yīng)更徹底，從而獲得更高的靈敏度。

2.4 玉米樣品中FB1添加回收率的測定

向空白玉米樣品中添加一定量的FB1標(biāo)準(zhǔn)品，使終質(zhì)量濃度為0.1、0.5 μg/mL和0.8 μg/mL。經(jīng)過提取回收，利用酶標(biāo)板、蛋白A-磁微粒、羊抗兔抗體-磁微粒作為承載體的方法分別測定并比較。

表4 玉米樣品中FB1添加回收率測定Table 4 Recoveries of FB1in spiked corn samples

由表4可知，羊抗兔抗體-磁微粒偶聯(lián)物的回收率范圍在76.4%～92.0%之間，蛋白A-磁微粒偶聯(lián)物的回收率范圍在88.6%～110.6%之間，常規(guī)ELISA回收率范圍在93.0%～112.1%之間。通過3 種不同質(zhì)量濃度FB1玉米樣品的應(yīng)用研究，得到了很好的回收率，進一步證明磁微粒作為承載體能夠用于玉米中FB1的ELISA檢測。

3 結(jié) 論

本研究利用蛋白A-磁微粒、羊抗兔抗體-磁微粒替代酶標(biāo)板作為固定相，用于ELISA檢測玉米樣品中的FB1。由于磁微粒能夠提供更大的比表面積，更好的流動性，能夠避免空間位阻，使抗原抗體在液相中呈三維立體反應(yīng)，因此相較常規(guī)的酶標(biāo)板，可使反應(yīng)靈敏度得到提升。為了驗證在玉米樣品檢測中的適用性，本研究對添加回收率進行測定，結(jié)果在76.4%～110.6%之間。綜上所述，本研究成功建立了一種檢測玉米中FB1的基于磁微粒的ELISA方法。

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Development of a Magnetic Particle-Based Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Determining Fumonisin B1in Corn

GUAN Di1,2,3, PAN Can-ping3, WANG Wen1,2, WU Hui-juan1,2,*
(1. Beijing Centre for Physical and Chemical Analysis, Beijing 100089, China; 2. Beijing Engineering Research Center of Food Safety Analysis, Beijing 100089, China; 3. College of Science, China Agricultural University, Beijing 100094, China)

Magnetic particles (MPs) were used as the support to replace enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) plates for the determination of fumonisin B1(FB1) in corn. Goat anti-rabbit antibody and protein A-MP conjugates were utilized in a direct competitive ELISA format. Under optimized conditions, the limits of detection (LOD) for goat anti-rabbit antibody and protein A-MPs were 0.024 and 0.030 μg/mL, respectively. The goat anti-rabbit antibody MP conjugates exhibited a lower LOD which was only one third of that of conventional ELISA. The recoveries from spiked corn varied from 76.4% to 110.6%, with relative standard deviation (RSD) less than 11%. Overall, a sensitive and stable method for FB1has been developed in this paper.

magnetic particles; enzyme-linked immunosorbent assay; fumonisins; corn; protein A

TS207.4

A

1002-6630（2014）08-0208-04

10.7506/spkx1002-6630-201408041

2013-08-13

北京市市級財政項目（PXM2013_178305_000002）

管笛（1983—），男，助理研究員，博士，研究方向為食品安全與檢測技術(shù)。E-mail：guandi@yeah.net

*通信作者：武會娟（1972—），女，副研究員，博士，研究方向為食品安全與檢測技術(shù)。E-mail：sunnywhj@126.com