劉英姿，董筱萍，程　迪，周鐵忠

（遼寧醫(yī)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧　錦州　121001）

原花青素A-1體內(nèi)外對(duì)豬與小鼠T淋巴細(xì)胞亞群的影響

劉英姿，董筱萍，程迪，周鐵忠?

（遼寧醫(yī)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州121001）

為研究從碎米花杜鵑葉中分離得到的化合物原花青素A-1（Proanthocyanidin A-1，簡(jiǎn)稱PAA-1）的免疫增強(qiáng)活性，初步從細(xì)胞水平上探討其免疫增強(qiáng)機(jī)制。體外試驗(yàn)采用流式細(xì)胞術(shù)，檢測(cè)PAA-1體外對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞T細(xì)胞亞群CD 4和CD 8單陽性和雙陽性T淋巴細(xì)胞亞群百分率及CD4+/CD 8+比值；體內(nèi)試驗(yàn)通過飼喂不同劑量的PAA-1后，檢測(cè)試驗(yàn)豬外周血淋巴細(xì)胞CD4和CD 8單陽性以及CD 4+/CD 8+比值。結(jié)果證明，體外試驗(yàn)中同陰性對(duì)照組相比，PAA-1能單獨(dú)或協(xié)同Con A提升具CD 4+、CD 8+及CD 4+CD 8+表型的T淋巴細(xì)胞亞群百分率，提高CD4+/CD 8+的比值；體內(nèi)試驗(yàn)中飼喂中、高劑量的PAA-1的試驗(yàn)豬外周血中具有CD 4+、CD 8+表型的T淋巴細(xì)胞的百分率及CD 4+/CD8+的比值均有顯著提高。說明PAA-1可通過增加輔助性T淋巴細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞數(shù)量、促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的成熟以及增加CD 4+/CD 8+的比值發(fā)揮增強(qiáng)細(xì)胞免疫的作用，為其進(jìn)一步開發(fā)為新型免疫增強(qiáng)劑提供試驗(yàn)依據(jù)。

原花青素A-1；T淋巴細(xì)胞亞群；小鼠；仔豬

原花青素是一種在植物界中廣泛存在的多酚類化合物。國(guó)內(nèi)外的一些研究證實(shí)，其具有抗氧化、保護(hù)心血管、抗癌、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)肝腎功能等多種藥理活性。國(guó)內(nèi)外對(duì)原花青素類化合物的研究主要集中在其強(qiáng)的抗氧化活性方面，對(duì)于其免疫調(diào)節(jié)活性卻極少報(bào)道。

課題組對(duì)從碎米花杜鵑提取物乙酸乙酯部分分離得到的化合物原花青素A-1（以下簡(jiǎn)稱PAA-1）的免疫調(diào)節(jié)活性進(jìn)行了測(cè)定，證實(shí)PAA-1體外能極顯著地刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖，具有免疫增強(qiáng)作用[1]。

為了研究PAA-1刺激淋巴細(xì)胞增殖作用的機(jī)理，本試驗(yàn)運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了PAA-1作用后的小鼠脾臟CD4和CD8單陽性和雙陽性T淋巴細(xì)胞亞群百分率和CD4+/CD8+比值以及體內(nèi)對(duì)試驗(yàn)豬外周血淋巴細(xì)胞CD4和CD8單陽性以及CD4+/CD8+比值的影響，從分子水平上分析其免疫增強(qiáng)的作用機(jī)理。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物的選擇和分組處理體外試驗(yàn)：健康Balb/c小鼠，6～8周齡，SPF級(jí)，體重20±2 g，雄性，購(gòu)于吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK(吉2003-0001)。

體內(nèi)試驗(yàn)：于凌海大業(yè)鄉(xiāng)生態(tài)豬場(chǎng)選取30～35日齡的健康斷奶三元雜交仔豬（“杜長(zhǎng)大”）40頭，隨機(jī)分為4組，每組10頭，其中3個(gè)試驗(yàn)組，1個(gè)對(duì)照組。3個(gè)試驗(yàn)組分別在日糧中不添加（對(duì)照組）、添加2 mg/kg（試驗(yàn)1組）、4 mg/kg（試驗(yàn)2組）和8 mg/kg（試驗(yàn)3組）的PAA-1，連用10 d。4組仔豬經(jīng)驅(qū)蟲后分圈飼養(yǎng)于同一全封閉豬舍，由同一飼養(yǎng)員管理，自由采食和飲水。

1.2PAA-PAA-11的提取方法干燥的碎米花杜鵑Rhododendron spici ferum葉10 kg經(jīng)粉碎后，用70%丙酮水泡樣3次，減壓回收，水相依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，減壓蒸餾（40℃）回收乙酸乙酯萃取部分（600 g）。乙酸乙酯部分用90%甲醇水經(jīng)MCI脫除色素，得浸膏500 g。取500 g浸膏，80∶100目硅膠2 000 g上樣，以氯仿∶丙酮（1∶0，9∶1，8∶2，7∶3，6∶4）梯度洗脫，在氯仿：丙酮7：3段反復(fù)運(yùn)用各種色譜技術(shù)（硅膠柱色譜，凝膠柱色譜，ods反相硅膠）分離出化合物PAA-1,純度98%以上，其化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 PAA-1的結(jié)構(gòu)Fig.1　The chem ical structure of proanthocyanidinA-1

1.3主要試驗(yàn)試劑與儀器胰蛋白酶：Gibco產(chǎn)品，CD4/L3T4-PE、CD8/Lyt-2-FITC熒光標(biāo)記抗體：Southern Biotech產(chǎn)品；FITC-標(biāo)記抗豬CD4單抗、PE標(biāo)記抗豬CD8單抗購(gòu)自BD公司；溶血素購(gòu)自Beckman Coul ter公司。2.5%小牛血清-PBS：將2.5 mL小牛血清溶于97.5 mL PBS，混勻用于細(xì)胞的洗滌，現(xiàn)用現(xiàn)配；1%甲醛-PBS：將1 mL甲醛溶于99 mL PBS，混勻用于重懸細(xì)胞；調(diào)機(jī)器用樣品包括每種染料的單陽性細(xì)胞和無染料的陰性細(xì)胞，上述試劑由遼寧醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心配制。流式細(xì)胞儀：美國(guó)BD公司LSRII數(shù)字化分析型流式細(xì)胞儀。

1.4小鼠脾淋巴細(xì)胞的準(zhǔn)備及分組試驗(yàn)共分為4組，分別為陰性對(duì)照組、單藥組、Con A對(duì)照組和組合PAA-1組。制備小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液，加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1 mL，陰性對(duì)照組，每孔再分別加入1 mL RPMI-1640完全培養(yǎng)液；單藥組，再加入含有100 mg/L PAA-1的RPMI-1640完全培養(yǎng)液1 mL，使PAA-1終濃度分別為50mg/L；Con A對(duì)照組，每孔再加入1ml含10 mg/L Con A的RPMI-1640完全培養(yǎng)液；組合PAA-1組加入含100 mg/L PAA-1和10 mg/L Con A的RPMI-1640完全培養(yǎng)液1 mL，使PAA-1和Con A的終濃度分別為50 mg/L和5 mg/L，每組均設(shè)2個(gè)復(fù)孔，每孔溶液終體積為2 mL。

1.5小鼠脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)與處理上述細(xì)胞放入細(xì)胞培養(yǎng)板標(biāo)記好后，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h；收集懸浮及貼壁細(xì)胞于離心管中，用低溫冷凍離心機(jī)4℃ 1 500×g離心5 min，傾棄上清，殘余上清用濾紙吸凈；加入2 mL PBS，用移液槍輕輕吹勻，于4℃ 1 500×g離心5 min，傾棄上清，殘余上清用濾紙吸凈，重復(fù)操作2次；加入1 mL 70%冰乙醇（-20℃預(yù)冷）對(duì)樣品進(jìn)行固定，輕輕吹勻，保存于-20℃待用。

1.6流式細(xì)胞術(shù)測(cè)小鼠T淋巴細(xì)胞亞群取一組按1.5中方法處理好的小鼠脾淋巴細(xì)胞，于4℃1 500×g離心5 min，傾棄上清，殘余上清用濾紙吸凈；用PBS洗2次，棄上清，再加PBS重懸細(xì)胞；分別加入熒光標(biāo)記抗體，CD4/L3T4-PE（劑量為0.2μg/106個(gè)細(xì)胞），CD8/Lyt-2-FITC（劑量為1μg/106個(gè)細(xì)胞），4℃避光反應(yīng)30 min；PBS洗1次，以便去除未標(biāo)記上的熒光抗體；然后加500μL PBS重懸細(xì)胞，200目尼龍膜過濾，上流式細(xì)胞儀，設(shè)定575 nm和530 nm氬激光強(qiáng)度對(duì)小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞膜表面標(biāo)志CD4及CD8表達(dá)量的變化進(jìn)行測(cè)定，用Becton–Dickinson數(shù)據(jù)分析軟件分析細(xì)胞亞群結(jié)果，每個(gè)樣品以10 000個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)，結(jié)果以CD4+CD8―%、CD4―CD8+%、CD4+CD8+%表示PAA-1對(duì)小鼠脾中T淋巴細(xì)胞各亞群百分率的影響。

1.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)試驗(yàn)豬外周血T淋巴細(xì)胞亞群飼喂PAA-1 10 d后，前腔靜脈抽取試驗(yàn)豬的全血2 mL，肝素抗凝。取配好的肝素抗凝血100μL，加入相應(yīng)熒光染料染色4℃，15 min，避光；BECKMAN溶血素裂解紅細(xì)胞（200μL/管）30℃，30 min；2.5%小牛血清-PBS洗滌1～2次，800～1 000 r/min，離心10 min；1%甲醛-PBS重懸，上機(jī)檢測(cè)[2]。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所得數(shù)據(jù)用平均值士標(biāo)準(zhǔn)差（x-±SD）表示，采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行方差分析和Duncan’S多重比較。用P＜0.05或P＜0.01對(duì)試驗(yàn)組與對(duì)照組樣本均數(shù)間具顯著性差異進(jìn)行標(biāo)識(shí)，所有試驗(yàn)結(jié)果均重復(fù)操作3次。

2　結(jié)果與分析

表1　PAA-1體外對(duì)T淋巴細(xì)胞亞群的影響Table1　Effects of PAA-1 on CD4 and CD8 expression of T lymphocytes in vitro

2.1PAA-PAA-11體外對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞亞群的影響見表1。

如表1所示，與陰性對(duì)照組相比，經(jīng)濃度為50 mg/L PAA-1刺激后，小鼠脾中具CD4+與CD8+表型的T淋巴細(xì)胞亞群百分率極顯著增加（P＜0.01）；CD4+CD8+表型的T淋巴細(xì)胞亞群百分率在該濃度顯著增加（P＜0.05）；CD4+/CD8+比值也有所提高。PAA-1協(xié)同Con A（PAA-1 50 mg/L+Con A 5 mg/L）作用后與對(duì)照組相比，CD4+表型的顯著升高(P＜0.05)；CD4+/CD8+比值雖較Con A對(duì)照組低，但仍比對(duì)照組高。

PAA-1單獨(dú)作用對(duì)CD4+、CD8+及CD4+CD8+表型的T淋巴細(xì)胞亞群百分率均略高于PAA-1與Con A協(xié)同作用，這表明PAA-1單獨(dú)作用對(duì)T淋巴細(xì)胞表達(dá)CD4+/CD8+的影響好于與有絲分裂原共同作用，說明PAA-1本身就具有很好的免疫調(diào)節(jié)活性。

2.2飼喂PAA-PAA-11對(duì)試驗(yàn)豬外周血T淋巴細(xì)胞亞群的影響見表2。

表2　PAA-1體內(nèi)對(duì)豬外周血T淋巴細(xì)胞亞群的影響Tab le2　Effects of PAA-1 on CD4 and CD8 expression of T lym phocytes in vivo

表2可見，在飼料中添加不同劑量的PAA-1 10 d后，對(duì)試驗(yàn)豬進(jìn)行淋巴細(xì)胞亞類檢測(cè)，結(jié)果表明，具有CD4＋、CD8＋表型的T淋巴細(xì)胞亞群百分率在所有的試驗(yàn)組均高于對(duì)照組。其中試驗(yàn)1組CD4＋亞群顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；而試驗(yàn)2、3組極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），試驗(yàn)2,3組之間差異不顯著。試驗(yàn)1、2組CD8＋亞群多于對(duì)照組，但差異不顯著（P＞0.05）；試驗(yàn)3組顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。CD4+/CD8+比值的變化：試驗(yàn)2、3組顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），試驗(yàn)1組與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）。

3　討論

3.1CD4和CD8是T淋巴細(xì)胞膜上最關(guān)鍵的分化抗原。CD4主要表達(dá)于輔助性T細(xì)胞，具有調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)活性、輔助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體、分泌細(xì)胞因子；CD8主要分布在細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和抑制性T淋巴細(xì)胞表面，有免疫抑制和細(xì)胞毒性的作用[3]。 CD4+/CD8+的比值是一重要的評(píng)估機(jī)體免疫狀態(tài)的依據(jù)[4]。體內(nèi)外試驗(yàn)均證實(shí)，PAA-1能提高CD4+/ CD8+的比值，具有免疫增強(qiáng)作用。

3.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，體外實(shí)驗(yàn)中同陰性對(duì)照組相比，PAA-1單獨(dú)作用能極顯著提升具CD4+、CD8+及CD4+CD8+表型的T淋巴細(xì)胞亞群百分率（P＜0.01）；PAA-1協(xié)同Con A作用，也能使CD4+與CD4+CD8+表型的T淋巴細(xì)胞亞群百分率顯著升高（P＜0.05），而且對(duì)CD4+/CD8+的比值均有提升作用；體內(nèi)試驗(yàn)中飼喂中、高劑量PAA-1的試驗(yàn)豬外周血中具有CD4+、CD8+表型的T淋巴細(xì)胞的百分率均顯著或極顯著提高了（P＜0.05），CD4+/ CD8+的比值也有顯著提高（P＜0.05）。說明PAA-1通過增加具輔助性功能的T淋巴細(xì)胞數(shù)量以及細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞數(shù)量，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的成熟以及增加CD4+/CD8+的比值來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

[1]劉英姿，羅有梁，周鐵忠.碎米花杜鵑原花青素A-1對(duì)小鼠免疫細(xì)胞的影響[J].中藥藥理與臨床，2012，28（2）∶45-48.

[2]張紅英，王學(xué)兵，崔保安，等.山藥多糖對(duì)PRRSV滅活苗免疫豬抗體和T淋巴細(xì)胞亞群的影響[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2010，25（2）：236-238.

[3]劉廷，鞠玉琳，李楊，等.中藥復(fù)方連黃對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞亞群CD4+、CD8+的影響[J].四川動(dòng)物，2009，28（1）：115-117.

[4]屈雪琪，趙建增，梁智選，等.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同試驗(yàn)條件對(duì)豬T淋巴細(xì)胞亞群的影響[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2011，38（4）∶101-104.

（編輯：韓斌）

Effecton T cellsubset from pigletand Balb/cm ice ofproanthocyanidin A-1

Liu Yingzi,Dong Xiaoping,Cheng Di,Zhou Tiezhong*
（Liaoning Medical University，LiaoningJinzhou121001）

Proanthocyanidin A-1(PAA-1)was isolated f rom Rhododendron spiciferum in ethylacetate.To prel iminary study the mechanism of immuno-enhancing activity of PAA-1 in cel l level,ratio of two main lymphocyte T subsets(CD4+cel ls and CD8+cel ls)were detected by f low cytometer. The lymphocyte T came f rom mice in vit ro and peripheral blood lymphocyte,thepiglets were fed with PAA-1.The resul ts showed that PAA-1 can elevate the CD4+,CD8+and CD4+CD8+cel l populations alone or with Con A and elevate the ratio of CD4+/CD8+in vit ro,and enhance CD4+,CD8+cel l populations and the ratio of CD4+/CD8+in high dose groups.PAA-1 play a role in immune regulation by increasing the number of T helpers,T cytotoxic/suppressors and promote lymphocyte T maturation.

Proanthocyanidin A-1;T cel l subset;Balb/c mice;Piglet

R285.5

：B

：1672-9692(2014)10-0001-04

2014-09-01

劉英姿（1976-），女，博士，副教授，主要從事中藥免疫研究。

周鐵忠（1964-），男，博士，教授，研究方向?yàn)閯?dòng)物及人獸共患疫病防治。

遼寧省自然科學(xué)基金項(xiàng)目：《表兒茶素免疫活性及其對(duì)免疫抑制小鼠影響的研究》項(xiàng)目編號(hào)：2013022047；遼寧醫(yī)學(xué)院博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目Y2012B010