朱國坡，李少麗，邵攀峰，王斌卿，李新華,2?

（1.杭州薦量獸用生物制品有限公司，浙江 杭州 310018；2.中國農業(yè)科學院家禽研究所，浙江 揚州 225125）

PCV2滅活疫苗對小鼠的免疫效果研究

朱國坡1，李少麗1，邵攀峰1，王斌卿1，李新華1,2?

（1.杭州薦量獸用生物制品有限公司，浙江 杭州 310018；2.中國農業(yè)科學院家禽研究所，浙江 揚州 225125）

本研究首先用豬圓環(huán)病毒2型種毒攻擊Balb/c小鼠，通過病毒分離，找出可使全部小鼠感染的最低病毒含量，然后用該種毒攻擊免疫后的Balb/c小鼠，評價免疫保護情況。結果顯示，可使小鼠全部感染的種毒最低病毒含量為106.5TCID50/0.1 m L，當疫苗病毒含量為105.5TCID50/0.1 m L時即可使7/10免疫小鼠得到保護，達到了疫苗的免疫效果。該研究為現(xiàn)有疫苗的生產工藝改進提供了重要的參考數(shù)據(jù)。

豬圓環(huán)病毒2型；病毒分離；疫苗

近年來，以豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）為主要病原引起的斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）、豬皮炎腎病綜合征（PDNS）、豬呼吸系統(tǒng)混合疾?。≒RDC）、豬繁殖障礙癥等綜合征候群給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經濟損失，據(jù)報道，在歐洲該類病每年就可造成約6億歐元的損失[1-3]。目前，預防該類疾病的首選是應用疫苗免疫接種。在我國，已有上市的商品化疫苗6種，其中勃林格殷格翰動物保?。绹┯邢薰镜腜CV2亞單位疫苗的安全性及有效性都得到了試驗肯定，然而該疫苗價格昂貴[4]。我國自主品牌疫苗均為全病毒滅活苗，由于病毒體外增殖能力差，抗原含量普遍不高，生產中批間質量較難統(tǒng)一，免疫效果評價困難，生產工藝需要進一步改進，疫苗質量有很大的提升空間[5-6]。本研究依據(jù)現(xiàn)有疫苗質量標準，首先用自制的PCV2滅活疫苗免疫小鼠，然后攻毒并進行病毒分離，探索合格疫苗的最低抗原含量，為疫苗生產工藝改進提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料和方法

1.1 主要材料和試劑PCV2滅活疫苗（O/W）、PCV2種毒（ZJ/C株）、PK15細胞均由杭州薦量獸用生物制品有限公司制備和保存；MEM營養(yǎng)液、胎牛血清購自Gibco公司；Balb/c雌性小鼠，SPF級，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司；PCV2單克隆抗體購自浙江同點生物科技有限公司；FITC-羊抗鼠抗體購自美國KPL公司。

1.2 PCV 22對小鼠的致病性取6～8周齡Balb/c小鼠40只隨即分成A、B、C、D共4組，每組10只。各組小鼠分別用病毒含量為105.5、106.0、106.5、107.0TCID50/0.1 mL的PCV2種毒攻擊，腹腔注射0.45 mL/只，另設10只小鼠作為不注射空白對照組。接種后21 d，撲殺所有小鼠，無菌采集所有小鼠脾臟進行病毒分離，分離到病毒即判為病毒分離陽性。

1.3 豬圓環(huán)病毒22型滅活疫苗最小免疫劑量試驗該方法參照“豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗（ZJ/C株）質量標準中“小鼠免疫攻毒法”進行[7]。取抗原 病 毒 含 量 分 別 為 105.0、 105.5、 106.15、 106.5TCID50/0.1 mL的豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗分別腹腔注射免疫6～8周齡Balb/c小鼠各10只，每只0.2 mL，同時設10只不免疫小鼠作為對照。免疫后21 d，連同對照小鼠，用100%使小鼠致病的PCV2種毒攻擊，每只小鼠腹腔注射0.45 mL。攻毒后21 d，撲殺，取脾臟進行病毒分離，分離到病毒即判為病毒分離陽性，分離不到病毒即為保護。

1.4 病毒分離

1.4.1 組織處理 取小鼠脾臟，按每0.05 g組織加入1 mL無菌的MEM無血清培養(yǎng)液后，研磨制備勻漿，反復凍融3次。組織勻漿以12 000 r/min離心10 min，收集上清，用0.22μm的一次性針頭濾器過濾除菌，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 分離培養(yǎng) PK15細胞單層用0.02%EDTA-0.05%胰酶在37℃條件下消化6～10 min，用含8%胎牛血清的MEM細胞生長液制成濃度為2×105個/mL細胞懸液，按照1.5 mL/孔將細胞懸液加入到12孔細胞培養(yǎng)板，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。取小鼠脾臟組織懸液各0.15 mL，分別接種到以上細胞板中，輕輕震蕩混勻，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收獲細胞板，反復凍融3次，12 000 r/min離心10 min，取上清液作為第1代接種物。取第1代接種物按上述方法再盲傳1代，作為第2代接種物。

1.4.3 檢測 將用含8%胎牛血清MEM營養(yǎng)液制備的2×105個/mL的PK15細胞懸液加入到96孔細胞板中，每孔100μL，然后取上述第2代接種物10μL同步接種于96孔板中，每個樣品2孔，同時設PCV2陽性對照和細胞空白對照各2孔。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h，棄細胞培養(yǎng)液，每孔加入100μL冷丙酮固定液，-20℃固定30 min，棄固定液，自然晾干備用。

1.4.4 結果判定 參照Tischer等[8]、崔尚金等[9]方法進行間接免疫熒光IFA鑒定，一抗為PCV2單克隆抗體，二抗為FITC-羊抗鼠熒光抗體。在倒置熒光顯微鏡下觀察結果。陽性對照孔應出現(xiàn)綠色熒光，陰性對照孔應無綠色熒光，樣品孔有綠色熒光細胞的判為陽性，無綠色熒光細胞的判為陰性。

2 結果和分析

2.1 PCV 22對小鼠的致病性通過病毒分離可以看到，小鼠樣品病毒分離陽性的在熒光顯微鏡下可見到翠綠色熒光，并且無干擾背景，而空白對照組未見熒光（見圖1）。其中，種毒病毒含量為105.5TCID50/0.1 mL時病毒分離陽性數(shù)為6/10，種毒病毒含量為106.0TCID50/0.1 mL時病毒分離陽性數(shù)為9/10，種毒病毒含量為106.5和107.0TCID50/ 0.1 mL時病毒分離陽性數(shù)均為10/10，空白對照組病毒分離陽性數(shù)為0/10（見圖2）。據(jù)此結果選擇10/10使小鼠致病最低病毒含量種毒的C組作為小鼠免疫攻毒用種毒，即106.5TCID50/0.1 mL。

圖1 攻毒小鼠病毒分離間接免疫熒光檢測（×200）Fig.1 The viral isolation result of injected m ice by IFA(× 200)

圖2 PCV2對Ba lb/c小鼠的致病性Fig.2 The pathogenicity of PCV2 on Balb/c m ice

2

2.2 豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗最小免疫劑量試驗當疫苗中抗原病毒含量為105.0TCID50/0.1 mL時可使小鼠5/10保護，當疫苗中抗原病毒含量為105.5TCID50/0.1 mL時可使小鼠7/10保護，當疫苗中抗原病毒含量為106.15TCID50/0.1 mL以上時可使小鼠10/ 10保護，見表1。

表1 豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗對小鼠的最小免疫劑量試驗Table1 The m inimum immune dose of PCV2 inactivated vaccine on m ice

3 討論

評價動物疫苗免疫效果的最直接方法是對試驗動物的免疫攻毒。由于豬圓環(huán)病毒病的發(fā)病率高達50%，陰性豬難以篩選[1]，再者豬體試驗費用高，因此選用替代動物來評價免疫效果是十分必要的。由于小鼠和豬的親緣關系較近,遺傳學背景清楚,具有價廉、試驗周期短、易于飼養(yǎng)和操作等優(yōu)點,許多疾病可以此為動物模型進行相關研究。國外，Kiupel等[10]、Quintana等[11]證實PCV2可以感染Balb/c小鼠，為后續(xù)研究提供了重要依據(jù)。我國現(xiàn)有PCV2疫苗的ZJ/C株和SH株的效果評價也已選用Balb/c小鼠作為替代動物，其中SH株采用ELISA測抗體法，ZJ/C株采用分離病毒的方法。

ELISA抗體檢測法由于方便、快捷省時、成本低廉被許多學者所采用。董信田等[12]通過ELISA方法檢測小鼠抗體，證實PCV2油佐劑和鋁膠佐劑滅活疫苗免疫小鼠后均能產生較好的免疫應答，并且油佐劑滅活疫苗免疫效果好于鋁膠佐劑滅活疫苗。王建龍等[13]用制備的PCV2 DNA疫苗免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)免疫后第14天小鼠血清ELISA抗體水平達到峰值，加強免疫后抗體水平無顯著變化。而病毒分離方法結果判定更為直接，并且也最為準確可靠。因此，本研究中也采用免疫攻毒后分離病毒的方法，通過間接免疫熒光法（IFA）檢測，熒光顯微鏡判定結果，不僅特異而且易于判定。通過致病性試驗發(fā)現(xiàn)可使小鼠10/10感染的最低病毒含量為106.5TCID50/0.1 mL。用該種毒攻擊PCV2滅活疫苗免疫后的小鼠，通過病毒分離發(fā)現(xiàn)，當疫苗抗原病毒含量為105.0TCID50/0.1 mL時，可使小鼠5/10保護，而當疫苗抗原病毒含量為105.5TCID50/0.1 mL時，即可使小鼠7/10保護，達到疫苗質量標準的要求，說明所制備的疫苗具有較好的免疫效果，為疫苗生產工藝的改進提供了重要的數(shù)據(jù)參考。

[1]郎洪武，陳曉春，吳華偉，等.豬圓環(huán)病毒病及其生物制品學的研究進展[J].中國獸醫(yī)科學，2012，42（5）：545-550.

[2]SEGALES J.Update on post weaning mul ti-systemic wasting syndrome and porcine dermatitis and nephropathy syndrome diagnostics[J]. J Swine Heal th Prod,2002,10(6)∶277-281.

[3]GRAU-ROMA L,CRISCI E,SIBILA M,et al.A proposal on porcine circovirus type 2(PCV2)genotype def inition and their relation with postweaning mul tisystemic wasting syndrome occurrence[J].Vet Microbiol, 2008, 128(1/2)∶23-35.

[4]郎洪武.豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的家蠶表達及亞單位疫苗在小鼠和仔豬的免疫效力試驗[D].北京：中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院，2013.

[5] 李郁，魏建忠，蘇金存，等[P].中國專利：201010138882.X，2010-04-02.

[6]鄧秋紅，鄭潔，劉延亭，等.國內商品化豬圓環(huán)病毒疫苗的現(xiàn)狀及展望[J].中國獸藥雜志，2014，48（2）：67-69.

[7]農業(yè)部公告第1893號.

[8]Tischer I,Peters D,Rasch R,et al.Repl ication of porcine circovirus∶induction by glucosa mine and cel l dependence[J].Arch Virol, 1987,96∶39-57

[9]崔尚金，金滟平，李曦，等.豬圓環(huán)病毒間接免疫熒光方法的建立[J].中國預防獸醫(yī)學報，2007，29（1）：63-66.

[10]KIUPEL M,STEVENSON G W,CHOI J,et al.Viral repl ication and lesions in BALB/c mice experimental ly inoculated with porcine circovirus isolated f rom a pig with postweaning mul tisystemic wasting disease[J].Vet Pathol, 2001,38(1)∶74-82.

[11]QUINTANA J,BALASCH M,SEGALES J M,et al. Experimental inoculation of porcine circoviruses type 1(PCV1)and type2(PCV2)in rabbits and mice[J].Vet Res,2002,33(3)∶229-237.

[12]董信田，李玉峰，姜平，等.豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗的制備與免疫效力研究[J].畜牧獸醫(yī)學報，2008，39（5）：639-644.

[13]王建龍，趙路易，張洪利，等.豬圓環(huán)病毒2型DNA疫苗對小鼠的買內衣效果[J].西北農林科技大學學報（自然科學版），2008，36（4）：53-57.

（編輯：張婷婷）

Immuno-efficacy of inactivated PCV2 vaccine inm ice

Zhu Guopo1,Li Shaol i1,Shao Panfeng1,Wang Binqing1,Li Xinhua1,2*
(1.Hangzhou Jianl iang Veterinary Biological Preparations Co.Ltd.,Zhej iang Hangzhou 310018; 2.Poult ry Institute,Chinese Academy of Agricul tural Sciences,Zhejiang Yangzhou 225125)

To evaluate the immune ef f icacy of porcine cirovirus type 2 vaccine,the viral isolation method was used to get the minimum content of PCV2 which can infect al l the Balb/c mice. Then,mice which had been immunized by inactivated vaccine were injected with this virus,and analyzed the protective ef fect.Resul ts showed that the minimum content of porcine circovirus type 2 can infect al l the Balb/c mice is 106.5TCID50/0.1 mL.The vaccine can protect the seven tenths of the mice with a viral content of 105.5TCID50/0.1 mL,and reach to the immune ef fect.The research could provide an impor tant reference data for improving the production process of existing vaccine.

Porcine circovirus type 2;Viral isolation;Vaccine

S858.28

：B

：1672-9692(2014)10-0033-04

2014-08-05

朱國坡（1980-），男，碩士，獸醫(yī)師，主要從事動物疫苗研發(fā)方面工作。