葉 敏，張 磊，王倩倩，劉慶慶，劉 雄,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2. 重慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶 401331）

辣椒總堿與花椒麻味素不同質(zhì)量比對高脂模型大鼠腸道健康的影響

葉 敏1，張 磊2，王倩倩1，劉慶慶1，劉 雄1,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2. 重慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶 401331）

目的：研究辣椒總堿和花椒麻味素不同質(zhì)量比對大鼠腸道健康的影響。方法：將56 只Sprague-Dawley（SD）雌性大鼠按體質(zhì)量隨機分為空白對照組、高脂對照組、高脂并灌胃3 mg/kg花椒麻味素（HF-3S組）、高脂并灌胃9 mg/kg辣椒總堿（HF-9C組）、高脂并灌胃1 mg/kg花椒麻味素和8 mg/kg辣椒總堿（HF-1S∶8C組）、高脂并灌胃2 mg/kg花椒麻味素和7 mg/kg辣椒總堿（HF-2S∶7C組）、高脂并灌胃3 mg/kg花椒麻味素和6 mg/kg辣椒（HF-3S∶6C組），共7 組，每組8 只，飼養(yǎng)期間自由采食和飲水，喂養(yǎng)30 d后解剖，測定盲腸內(nèi)容物質(zhì)量、盲腸壁面積、游離氨、pH值、短鏈脂肪酸和微生物。結(jié)果：HF-2S∶7C組的采食量、盲腸壁濕質(zhì)量、pH值及總的短鏈脂肪酸含量都顯著增加，腸球菌顯著降低、乳酸菌和厭氧菌顯著增加、大腸桿菌顯著降低。結(jié)論：辣椒總堿和花椒麻味素對高脂大鼠腸道健康的最佳質(zhì)量比為7∶2。

辣椒總堿；花椒麻味素；高脂模型；腸道健康

辣椒是一種常見的茄科辣椒屬植物，在部分地區(qū)內(nèi)被廣泛食用。辣椒總堿是辣椒辛辣成分的主要物質(zhì)，是一類香草酰胺類生物堿，具有鎮(zhèn)痛止癢[1-2]、抗腫瘤[3-4]、保護心血管和胃腸道[5-6]等多種生理功能。辣椒總堿的分子式為C18H27NO3，化學(xué)名稱為反-8-甲基-N-香草基-6-壬烯基酰胺。天然辣椒總堿由辣椒總堿、二氫辣椒總堿、降二氫辣椒總堿、高二氫辣椒總堿和高辣椒總堿組成，其中辣椒總堿和二氫辣椒總堿約占辣椒中辣椒總堿量的90%[7-8]。

花椒別名川椒、紅椒、蜀椒、大紅袍，花椒麻味素是花椒中重要的活性成分，是花椒呈麻味的主要成分，花椒麻味素在花椒中大多以鏈狀不飽和脂肪酸酰胺的形式存在，在其他物質(zhì)中則以帶芳環(huán)的酰胺形式存在[9]，所以又稱花椒酰胺?；ń返穆槲冻煞植粌H具有麻醉、興奮、抑菌、祛風(fēng)除濕、殺蟲和鎮(zhèn)痛等功效，同時還具有抗血小板凝集、松弛胃體的環(huán)形肌和回腸縱向肌等有益健康的功能[10]。

腸道健康與人體健康關(guān)系密切，腸道健康又與腸道構(gòu)成及腸道活性物質(zhì)緊密聯(lián)系?，F(xiàn)如今，肥胖問題已成為一個世界性難題，肥胖患者腸道肯定發(fā)生了一系列的病理變化，本實驗室的前期研究結(jié)果表明單獨食用3 mg/kg的花椒麻味素和9 mg/kg的辣椒總堿能改善高脂大鼠腸道健康狀態(tài)，那么辣椒總堿與花椒麻味素配伍對高脂模型大鼠腸道環(huán)境又是如何影響的呢？在此設(shè)想的基礎(chǔ)上，本實驗探討辣椒總堿與花椒麻味素的不同質(zhì)量比對高脂模型大鼠腸道健康的影響。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

Sprague-Dawley（SD）健康大鼠56 只，體質(zhì)量70～120 g，清潔級，購自重慶滕鑫比爾實驗動物銷售有限公司，動物許可證號：SCXK（渝）20070008。

天然辣椒總堿（辣椒堿含量為95.7%）購于河南倍特生物科技有限公司；花椒麻味素為實驗室提取（純度為95.7%）；在萬分之一天平上分別稱取300 mg花椒麻味素、900 mg辣椒總堿、100 mg花椒麻味素和800 mg辣椒總堿、200 mg花椒麻味素和700 mg辣椒總堿、300 mg花椒麻味素和600 mg辣椒總堿，依次溶于100 mL大豆油中配成3 mg/kg花椒麻味素溶液、9 mg/kg辣椒總堿溶液、1 mg/kg花椒麻味素和8 mg/kg辣椒總堿溶液、2 mg/kg花椒麻味素和7 mg/kg辣椒總堿溶液、3 mg/kg花椒麻味素和6 mg/kg辣椒總堿溶液。

基礎(chǔ)飼料購自百森生物技術(shù)公司，其配方如表1所示；脂肪乳配方（以下均以質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示）：30%豬油、20%膽固醇、10%丙二醇、3%膽酸鈉、20%吐溫-80、17%純水。

表1 基礎(chǔ)飼料配方Table1 Composition of the basic diet

巴豆酸（色譜純） 日本東京天成工業(yè)株式會社；乙酸（色譜純） 英國Johnson Matthey公司；丙酸、丁酸、異丁酸（均為色譜純） 梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；氫氧化鈉、苯酚、次氯酸鈉、鎢酸鈉、硫酸（均為分析純） 成都市科龍化工試劑廠；亞硝基鐵氰化鈉（分析純） 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；SYBR?Green Realtime PCR Master Mix試劑盒寶生物（大連）有限公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；糞便細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 北京天根科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GC-2010高效氣相色譜儀 日本島津公司；H18424 pH計 意大利Hanna公司；Spectrumlab 22可見光分光光度計 上海棱光技術(shù)有限公司；HZT-300-A千分之一天平 福州華志科學(xué)儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組和飼養(yǎng)

SD健康大鼠56 只，飼養(yǎng)條件：室溫25 ℃，相對濕度40%～60%，自由進食飲水。每天記錄采食量，3 d稱 1 次體質(zhì)量。56 只SD大鼠適應(yīng)環(huán)境1 周后按體質(zhì)量隨機分為7 組，每組8 只。空白對照組每天灌胃2 mL生理鹽水，高脂對照組每天灌胃2 mL脂肪乳，其他各實驗組每天13：00灌胃2 mL脂肪乳與辣椒總堿和花椒麻味素，分別為3 mg/kg花椒麻味素（HF-3S組）、9 mg/kg辣椒總堿（HF-9C組）、1 mg/kg花椒麻味素和8 mg/kg辣椒總堿（HF-1S∶8C組）、2 mg/kg花椒麻味素和7 mg/kg辣椒總堿（HF-2S∶7C組）、3 mg/kg花椒麻味素和6 mg/kg辣椒（HF-3S∶6C組）。灌胃劑量均為0.1 mL/100 g（以體質(zhì)量計），飼養(yǎng)30 d后解剖，測定各組盲腸內(nèi)容物質(zhì)量、盲腸壁面積、游離氨、pH值和短鏈脂肪酸（short-chain fatty acid，SCFA）和微生物。

1.3.2 檢測指標(biāo)

1.3.2.1 SCFA的測定

稱取0.2 g盲腸內(nèi)容物放入超純水處理過的10 mL離心管中，立即加入2 mL含有5 mmol/L巴豆酸的10 mmol/L氫氧化鈉溶液，將預(yù)處理的盲腸內(nèi)容物樣品4 000 r/min離心15 min，吸取上清液轉(zhuǎn)移至預(yù)處理10 mL離心管中，10 000 r/min離心15 min，1 mL一次性注射器吸取上清液1 mL，0.25 μm濾膜過濾至2 mL進樣小瓶中待測[4]。

氣相色譜條件：進樣量1 μL；進樣口溫度220 ℃；柱流量0.95 mL/min，柱溫90 ℃、平衡時間0.5 min， 5 ℃/min升溫至150 ℃，保留時間7 min；檢測器溫度230 ℃；氫氣流量40 mL/min，空氣流量400 mL/min，尾吹流量40 mL/min[5]。

1.3.2.2 pH值的測定

稱取一定質(zhì)量的新鮮盲腸內(nèi)容物于10 mL去離子水預(yù)處理離心管中，加入10 倍（m/V）去離子水，旋渦混合儀上混勻后靜置，測上清液pH值。

1.3.2.3 盲腸內(nèi)容物及腸壁質(zhì)量的測定

用千分之一天平稱量盲腸內(nèi)容物及腸壁的質(zhì)量。

1.3.2.4 飼料效率的測定

實驗前測定每只大鼠的體質(zhì)量，喂養(yǎng)期間每天記錄采食量，喂養(yǎng)30 d后測定每只大鼠的體質(zhì)量。計算出實驗期30 d內(nèi)大鼠體質(zhì)量的增加量和總的飼料采食量，按照公式（1）計算飼料效率。

1.3.2.5 游離氨含量測定

無氨水的制備[6]：在1 000 mL蒸餾水中加入0.10 mL硫酸（ρ=1.84 g/mL），并在全玻璃蒸餾器中重蒸餾，棄去前50 mL蒸出液，然后將蒸出液收集在帶有玻璃塞的玻璃瓶中。

將按1.3.2.1節(jié)預(yù)處理后的盲腸內(nèi)容物樣品4 000 r/min離心5 min，吸取上清液1 mL，依次加入1 mL含有0.001 mol/L亞硝基鐵氰化鈉的0.5 mol/L苯酚溶液和1 mL含有0.03 mol/L次氯酸鈉的0.625 mol/L氫氧化鈉溶液，60 ℃保溫5 min，625 nm波長處測定吸光度[7]。

1.3.2.6 盲腸壁面積測定

首先用冰冷的生理鹽水洗凈盲腸，充分展開后固定在A4紙上，勾出其輪廓，待紙干燥后將盲腸壁輪廓復(fù)寫在厚的打印紙上，然后將紙上的盲腸輪廓圖剪下。用精密度為0.000 1 g的電子天平準(zhǔn)確稱量輪廓圖紙質(zhì)量（m2）和1 cm2的打印紙質(zhì)量（m1），然后按照公式（2）計算盲腸壁面積/cm2。

1.3.2.7 盲腸內(nèi)容物菌群測定

糞便樣品DNA的提?。喊凑占S便基因組DNA提取試劑盒的說明進行提取。

各種細(xì)菌的基因序列如表2所示。

表2 各種細(xì)菌的基因序列Table2 Gene sequences of strains tested in this study

實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：反應(yīng)體系為20 μL：SYBR?Green Realtime PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.8 μL，模板2 μL，蒸餾水6.4 μL。反應(yīng)程序確定為：各細(xì)菌先經(jīng)過95 ℃ 1 min的變性，之后為95℃ 5 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min共40 個循環(huán)。得出各種細(xì)菌的Ct值。

由雙歧桿菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=-3.38x+43.6，相關(guān)系數(shù)為0.998；大腸桿菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=-3.27x+ 41.8，相關(guān)系數(shù)為0.997；腸球菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=-3.38x+47.3，相關(guān)系數(shù)為0.994；乳酸菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=-3.40x+38.3，相關(guān)系數(shù)為0.999；厭氧菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=-3.36x+45.4，相關(guān)系數(shù)為0.997，即可求出各細(xì)菌Ct值。

1.3.2.8 小腸和結(jié)腸組織形態(tài)測定

取材及固定→脫水→透明→包埋（軟蠟1處理30 min；軟蠟2處理30 min）→塑型和切片→展片和黏片→染色和封片→顯微鏡拍照

固定液為波恩試劑，配制方法（以下均為體積分?jǐn)?shù)）：75%飽和苦味酸溶液、25%飽和甲醛溶液和5%的冰醋酸。

1.4 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒總堿與花椒麻味素不同質(zhì)量比對SD高脂模型大鼠體質(zhì)量增加量、采食量及飼料效率的影響

表3 花椒麻味素和辣椒總堿不同質(zhì)量比對SD大鼠體質(zhì)量增加量、采食量及飼料效率的影響（x =8）Table3 Effects of different ratio mixtures of capsaicin and sanshool on food intake, body weight gain and feed efficiency in SD hyperlipidemia rats (x , = 8)

由表3可知，高脂對照組與空白對照組相比，體質(zhì)量和飼料效率顯著增加（P＜0.05），采食量顯著降低（P＜0.05）。與高脂對照組相比，HF-3S∶6C組的體質(zhì)量顯著增加（P＜0.05），HF-2S∶7C組的采食量顯著增加（P＜0.05）。2.2 辣椒總堿與花椒麻味素不同質(zhì)量比對盲腸總質(zhì)量、盲腸壁濕質(zhì)量及盲腸壁面積的影響

由表4可知，高脂對照組與空白對照組相比，盲腸總質(zhì)量顯著減少（P＜0.05），盲腸壁面積卻顯著增加（P＜0.05）。與高脂對照組相比，HF-3S組、HF-1S∶8C組和HF-3S∶6C組的盲腸總質(zhì)量顯著增加（P＜0.05），HF-9C組、HF-2S∶7C組和HF-3S∶6C組的盲腸壁濕質(zhì)量顯著增加（P＜0.05）。

表4 辣椒總堿與花椒麻味素不同質(zhì)量比對SD大鼠盲腸總質(zhì)量、盲腸壁濕質(zhì)量及盲腸壁面積的影響（x±s，n=8）Table4 Effects of different ratio mixtures of capsaicin and sanshool on total cecum weight, wall wet weight, and wall area in SD hyperlipidemia raattss (x±s，n=8）

2.3 辣椒總堿與花椒麻味素不同質(zhì)量比對pH值和游離氨含量的影響

表5 辣椒總堿和花椒麻味素不同質(zhì)量比對SD大鼠盲腸內(nèi)容物中pH值、游離氨含量的影響（x±s，n==88）Table5 Effects of different ratio mixtures of capsaicin and sanshool on free ammonia in cecal contents (x ±s,, n == 88))

由表5可知，高脂對照組與空白對照組相比，pH值顯著降低（P＜0.05），游離氨顯著增加（P＜0.05）。與高脂對照組相比，HF-9C組、HF-1S∶8C組和HF-2S∶7C組的pH值顯著增加（P＜0.05），HF-9C組和HF-3S∶6C組的游離氨含量顯著降低（P＜0.05）。

2.4 辣椒總堿與花椒麻味素不同質(zhì)量比對盲腸內(nèi)容物短鏈脂肪酸的影響

表6 辣椒總堿與花椒麻味素不同質(zhì)量比對SD大鼠盲腸內(nèi)容物中短鏈脂肪酸的影響（x±s，n==88）Table6 Effects of different ratio mixtures of capsaicin and sanshool on short-chain fatty acids in cecal contents (x ±s,, n == 88)) μmol/g

由表6可知，高脂對照組與空白對照組相比，乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸及總SCFAs含量都顯著降低（P＜0.05）。與高脂對照組相比，HF-2S∶7C組的乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸及總的SCFAs含量都顯著增加（P＜0.05）。

2.5 辣椒總堿和花椒麻味素不同質(zhì)量比對盲腸內(nèi)容物微生物的影響

表7 辣椒總堿與花椒麻味素不同質(zhì)量比對SD大鼠盲腸內(nèi)容物中微生物的影響（x±s，n==88）Table7 Effects of different ratio mixtures of capsaicin and sanshool on microorganisms in cecal contentss((x ±s,, n == 88)) lg（CFU/g）

由表7可知，高脂對照組與空白對照組相比，腸球菌和大腸桿菌數(shù)目顯著增加（P＜0.05）、雙歧桿菌數(shù)目顯著降低（P＜0.05），與高脂對照組相比，HF-2S∶7C組的腸球菌和大腸桿菌數(shù)目顯著降低（P＜0.05）、乳酸菌和厭氧菌數(shù)目顯著增加（P＜0.05），HF-3S∶6C組的大腸桿菌數(shù)目顯著降低（P＜0.05）。

2.6 辣椒總堿和花椒麻味素不同質(zhì)量比對小腸和結(jié)腸組織形態(tài)的影響

2.6.1 辣椒總堿和花椒麻味素不同質(zhì)量比對小腸組織形態(tài)的影響

由圖1可知，高脂對照組和空白對照組相比，盲腸壁變得肥厚，有向腫瘤發(fā)展的趨勢，與高脂對照組相比，HF-1S∶8C和HF-2S∶7C組的小腸壁細(xì)胞和小腸絨毛趨近于正常，HF-3S∶6C的小腸壁也產(chǎn)生腫瘤現(xiàn)象（圖中箭頭所示），說明HF-1S∶8C和HF-2S∶7C組的辣椒總堿和花椒麻味素劑量能改善高脂飼料對小腸壁結(jié)構(gòu)的傷害。

圖1 小腸組織形態(tài)圖（200×）Fig.1 Intestinal morphology (200×)

2.6.2 辣椒總堿和花椒麻味素不同質(zhì)量比對結(jié)腸組織形態(tài)的影響

圖2 結(jié)腸組織形態(tài)圖（40×）Fig.2 Colon morphology (40×)

由圖2可知，高脂對照組和空白對照組相比，結(jié)腸腸絨毛中空腔較多，進而干擾腸絨毛對機體必需營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，與高脂對照組相比，辣椒總堿和花椒麻味素各劑量組的結(jié)腸結(jié)構(gòu)及腸絨毛變化不大，且趨近于空白對照組大鼠，說明辣椒總堿和花椒麻味素各劑量組能改善高脂大鼠結(jié)腸形態(tài)和結(jié)腸結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)論與討論

本實驗的主要目的是探討辣椒總堿和花椒麻味素不同質(zhì)量比對高脂大鼠腸道健康的影響。從實驗結(jié)果看，辣椒總堿和花椒麻味素的配比作用能提高體質(zhì)量增加量、采食量、盲腸總質(zhì)量和盲腸壁濕質(zhì)量，促進乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸及總SCFAs的產(chǎn)生，抑制腸道中有害菌如大腸桿菌和腸球菌的生長，促進雙歧桿菌和乳酸菌等有益微生物的生長，減少了有害次級代謝產(chǎn)物游離氨的生成；腸道健康的改善與增加SCFAs產(chǎn)量、降低腸道中氨和苯酚濃度、改善細(xì)菌活性等方面相關(guān)[18]。腸道正常的生理功能與腸道微生物息息相關(guān)，機體攝入的食物殘渣進入盲腸，被腸道微生物進一步分解代謝，抗消化淀粉可發(fā)酵產(chǎn)生乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸等短鏈脂肪酸，含氮化合物被微生物發(fā)酵產(chǎn)生游離氨等有害產(chǎn)物，因此進入盲腸的殘渣成分會直接影響腸道微生態(tài)。有害代謝產(chǎn)物游離氨能改變結(jié)腸表皮細(xì)胞的形態(tài)和代謝，被認(rèn)為是結(jié)腸內(nèi)潛在的腫瘤促進因子，腸道內(nèi)游離氨主要是由細(xì)菌分泌的脲酶分解尿總堿產(chǎn)生的，一部分游離氨在大腸中被細(xì)菌用于蛋白質(zhì)的合成[19]。有研究表明，腸道菌群嚴(yán)重失調(diào)（雙歧桿菌下降，大腸桿菌、梭菌大量繁殖），尿總堿合成受阻，會產(chǎn)生更多的氨[20]。雙歧桿菌等有益微生物能大量合成動物所需的營養(yǎng)物質(zhì)和維生素，對多種腸道病原微生物產(chǎn)生拮抗，調(diào)節(jié)腸道菌群、增強機體免疫力，還能抗腫瘤、抗衰老、抗感染，以及提高人體對放射線的耐受力。綜合各項指標(biāo)的變化情況，辣椒總堿和花椒麻味素都能一定程度地改善高脂模型大鼠的腸道健康狀態(tài)，本實驗?zāi)転榉逝秩巳喝粘?yīng)該攝入辣椒總堿和花椒麻味素的量提供參考值，但是對于辣椒總堿和花椒麻味素是如何影響腸道健康的機理還有待進一步研究。

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Intestinal Health Effect of Capsaicin and Sanshool in Female Sprague-Dawley Hyperlipidemia Rats

YE Min1, ZHANG Lei2, WANG Qian-qian1, LIU Qing-qing1, LIU Xiong1,*
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. College of Life Sciences, Chongqing Normal University, Chongqing 401331, China)

Objective: To study the potential intestinal health effect of capsaicin and sanshool in hyperlipidemia rats. Methods: A total of 56 Female Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into blank (CON), high-fat-control (HF-CON), high-fat plus 3 mg/kg sanshool (HF-3S), high-fat plus 9 mg/kg capsaicin (HF-9C), high-fat plus 1 mg/kg sanshool and 8 mg/kg capsaicin (HF-1S:8C), high-fat plus 2 mg/kg sanshool and 7 mg/kg capsaicin (HF-2S:7C), high-fat plus 3 mg/kg sanshool and 6 mg/kg capsaicin (HF-3S:6C) groups based on their weights with 8 rats in each group. Under normal feeding conditions, feed intake was recorded daily. After being fed for 30 days, the rats were executed. Their cecum samples were weighted. Free ammonia, pH, short chain fatty acids (SCFAs) and microorganisms in cecum were determined. Results: Feed intake, and cecum wall wet weight, pH and SCFAs in HF-2S:7C group were significantly increased; Enterococcus and E. col i counts were decreased significantly, while lactic acid bacteria and anaerobic bacteria were increased significantly. Conclusion: proper intake of capsaicin and sanshool can be beneficial to intestinal health in hyperlipidemia rats and the optimum proportion of capsaicin and sanshool for rat intestinal health is 7:2.

capsaicin; sanshool; hyperlipidemia model; intestinal health

TS201.4

A

1002-6630（2014）21-0190-06

10.7506/spkx1002-6630-201421037

2014-01-22

國家自然科學(xué)基金面上項目（31171679）；重慶師范大學(xué)基金資助項目（14XLB004）

葉敏（1990—），女，碩士研究生，研究方向為食品化學(xué)與營養(yǎng)學(xué)。E-mail：yemin0303@163.com

*通信作者：劉雄（1970—），男，教授，博士，研究方向為碳水化合物功能與利用，食品營養(yǎng)學(xué)。 E-mail：liuxiong848@hotmail.com