劉英麗，劉駿明，王 靜，孫寶國(guó),*，THIERRY Tr on

（ 1.北京工商大學(xué) 食品質(zhì)量與安全北 京實(shí)驗(yàn)室，北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京 100048；2.Aix Marseille Université, CNRS, iSm2 UMR 7313, Marseille, France 13397）

栓菌漆酶的異源表達(dá)及重組酶碳端和氮端組氨酸標(biāo)簽修飾對(duì)酶學(xué)特性的影響

劉英麗1，劉駿明1，王 靜1，孫寶國(guó)1,*，THIERRY Tr on2

（ 1.北京工商大學(xué) 食品質(zhì)量與安全北 京實(shí)驗(yàn)室，北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京 100048；2.Aix Marseille Université, CNRS, iSm2 UMR 7313, Marseille, France 13397）

以來源Trametes sp.C30 的LAC3漆酶基因?yàn)檠芯繉?duì)象，通過引物設(shè)計(jì)進(jìn)行突變，在其C端和N端進(jìn)行延長(zhǎng)，分別引入6 個(gè)組氨酸標(biāo)簽，并異源表達(dá)于釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae中，將獲得的重組酶進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)漆酶末端氨基酸序列的改變對(duì)酶學(xué)性質(zhì)的影響較大。C端引入組氨酸標(biāo)簽的重組酶的表達(dá)量不受影響，但是在N末端引入組氨酸標(biāo)簽的重組酶表達(dá)量只有LAC3的一半。添加組氨酸標(biāo)簽的融合蛋白對(duì)ABTS和SGZ兩種底物的親和力得到增強(qiáng)。而在酸堿穩(wěn)定性耐受方面，與LAC3相比，N末端氨基酸的改變使其在酸堿穩(wěn)定性方面得到了增強(qiáng)，中堿性條件下仍能保持較佳活性。C端和N端可塑性的研究對(duì)于漆酶新性狀的獲得具有重要意義。

漆酶；異源表達(dá)；組氨酸標(biāo)簽；碳端；氮端

漆酶（EC1.10.3.2）是一種含銅的多酚類氧化還原酶，最早于1883年從日本的漆樹（Rhus vernicifera）汁液中發(fā)現(xiàn)，屬藍(lán)多銅氧化酶（blue multicopper oxidase， BMCOs）家族[1]。其廣泛分布于自然界的昆蟲、高等植物、真菌和細(xì)菌中，特別在大型真菌如擔(dān)子菌、子囊菌和半知菌中發(fā)現(xiàn)較多。不同來源的漆酶，其結(jié)構(gòu)、性質(zhì)是不同的，典型的漆酶含有3 個(gè)結(jié)構(gòu)域，活性中心含4 個(gè)銅離子，由于銅離子獨(dú)有的氧化還原能力漆酶具寬泛的底物專一性，能催化多種酚類和芳香類化合物發(fā)生氧化直接生成水，基于此綠色特性，漆酶的應(yīng)用非常廣泛，目前的研究還主要集中在工業(yè)廢水廢料處理、紡織染料漂白[2]、紙漿木質(zhì)素去除[3]、土壤和水的生物修復(fù)、生物燃料電池[4-6]和生物傳感器[7-8]等方面。漆酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用比較有限，主要是利用漆酶氧化酚類底物的性質(zhì)解決果汁和果酒中的沉淀問題[9]；另外，利用漆酶的氧化性以及漆酶與面粉中的阿魏酸能形成凝膠兩者共同作用的特點(diǎn)，將漆酶應(yīng)用于面制品中可以使饅頭的品質(zhì)有較大的提升，使其外觀更白、結(jié)構(gòu)更細(xì)密均勻、體積變大、富有彈性、鎖住更多的水分[10]。隨著研究的深入，漆酶在農(nóng)產(chǎn)品加工改性、食品制造中的應(yīng)用價(jià)值將被進(jìn)一步挖掘激發(fā)出來，這也對(duì)漆酶的性質(zhì)提出了更多的要求，例如高的氧化還原電勢(shì)、中堿性條件下仍能保持最佳活性、較好的熱穩(wěn)定性等。然而，天然存在單一漆酶無法滿足這些條件，因此尋找具有新特性的漆酶十分必要。

作為含有3 個(gè)結(jié)構(gòu)域的具有催化活性的蛋白， 通過突變來研究漆酶結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系了解漆 酶結(jié)構(gòu)的可塑性是最常見的手段。許多研究結(jié)果表明了靠近活性中心特定位置的氨基酸與催化活性的關(guān)系，Solomon等[11-13]的研究小組作為先驅(qū)早在20世紀(jì)90年代就做了大量的工作，對(duì)活性中心氨基酸的定點(diǎn)突變與催化效率及電動(dòng)勢(shì)的關(guān)系做了詳盡的研究。更有學(xué)者通過較大幅度的變化如結(jié)構(gòu)域的互換來獲得新性狀的漆酶，Yuko等[14]將來源Lentinula edodes的不同漆酶lac1和lac4的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行重組，并在煙草細(xì) 胞中表達(dá)獲得了比親本更寬底物專一性的重組酶；Viviane等[15]將來源Trametes sp.C30漆酶的兩個(gè)同工酶lac1和lac3結(jié)構(gòu)域進(jìn)行重組，獲得的重組酶在降解藍(lán)色蒽醌染料AB64上有較好效果。而C末端和N末端的加工作用對(duì)漆酶正確折疊的指導(dǎo)作用近年來也引起人們的極大興趣，不同來源的漆酶其末端的加工作用差別很大。在子囊菌漆酶中，如熱白絲菌漆酶MaL[16]和嗜熱毀絲菌漆酶MtL[17]及粗糙脈孢菌[18]和柄孢霉[19]菌株中均發(fā)現(xiàn)C末端的修飾作用直接影響漆酶的活性，通過對(duì)熱白絲菌漆酶MaL/rMaL[16,20]和沙生梭孢殼菌漆酶TaLcc1[21]晶體結(jié)構(gòu)的分析發(fā)現(xiàn)，C末端的最后4 個(gè)殘基Asp-Ser-Gly-Leu（DSGL）會(huì)在通向漆酶三核中心的通道中形成一個(gè)塞子，從而堵住了可能存在的氧氣通道。因此，子囊菌中的C末端羧酸可能作為氧氣還原成水的質(zhì)子傳遞供體，從而影響蛋白的反應(yīng)活性[22]。目前，C末端的重要作用在子囊菌漆酶中體現(xiàn)較為顯著，而在漆酶來源非常廣泛的擔(dān)子菌中的作用尚未有界定，關(guān)于N端作用的研究也甚少。將獲得的擔(dān)子菌屬栓菌漆酶序列通過3D模型進(jìn)行結(jié)構(gòu)模擬（如圖1所示，結(jié)構(gòu)示意圖由Swiss Pdbviewer軟件繪制）可以看出僅僅對(duì)末端進(jìn)行定點(diǎn)突變可能意義不是很大，一定幅度的截平或者延長(zhǎng)末端對(duì)擔(dān)子菌漆酶結(jié)構(gòu)和性質(zhì)會(huì)有什么樣的影響？本實(shí)驗(yàn)以擔(dān)子菌漆酶Trametes sp. C30為研究對(duì)象，克隆得到漆酶基因lac3，利用突變的技術(shù)將其C端和N端延長(zhǎng)，融合一個(gè)含有6 個(gè)組氨酸的標(biāo)簽，PEG/LiAc法轉(zhuǎn)化釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae，并進(jìn)行蛋白的純化。通過對(duì)重組酶特性的研究，探討擔(dān)子菌漆酶C端和N端的延長(zhǎng)對(duì)漆酶功能活性的影響。選擇6 個(gè)組氨酸做標(biāo)簽進(jìn)行延長(zhǎng)，一方面是出于純化的考慮，另一方面6 個(gè)組氨酸標(biāo)簽具有良好的金屬螯合能力，可用于將酶分子定向固定在金屬電極的表面形成自組裝單層膜，有效地研究酶分子與底物間的電化學(xué)過程，為漆酶在生物電化學(xué)、生物傳感器、人工生物膜等領(lǐng)域的研究與應(yīng)用提供一定的研究基礎(chǔ)。

圖1 來源于Trammeetteess sp.C30的漆酶3D結(jié)構(gòu)模型Fig.1 3D structure model of laccase from Trametes sp. C30

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Trametes sp. C30菌株、表達(dá)載體釀酒酵母S. cerevisiae W30 3-1A由法國(guó)埃克賽馬賽大學(xué)iSm2實(shí)驗(yàn)室Tron博士提供；大腸桿菌E. coli DH5α 美國(guó)Promega公司；選擇培養(yǎng)基（1 L，無氨基酸酵母氮源培養(yǎng)基6.7 g、葡萄糖20 g、酪蛋白水解物5 g、腺嘌呤90 mg、色氨酸40 mg、琥珀酸鹽緩沖液50 mmol/L，pH 5.3，CuSO4100 μmol/L） 美國(guó)BD公司；QuikChange Sitedirected mutagenesis試劑盒 美國(guó)Stratagene公司；丁香醛連氮（syringaldazine，SGZ）、2,2-連氮-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（2,2-azinobis（3-ehtylbenzothiazolin-6-sulfnic acid）diammonium salt，ABTS） 美國(guó)Spectrum公司；Anti-his（C-term）-HRP抗體 美國(guó)Invitrogen公司。

1.2 儀器與設(shè)備

T100 PCR儀、電泳轉(zhuǎn)印系列 美國(guó)Bio-Rad公司；V18R離心機(jī) 澳大利亞Dynamica公司；Genova Nano微量核酸蛋白分析儀 英國(guó)Jenway公司；Ecotron恒溫?fù)u床瑞士Infors公司；FPLC AKTA Purifier 100 美國(guó)GE公司；UV-2700紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 漆酶cDNA的克隆和突變體的構(gòu)建

以總RNA為模板，按文獻(xiàn)[23]的方法合成lac3 cDNA（GenBank登記號(hào)AY397783），克隆載體pAK145構(gòu)建參見Klonowska等[23]的方法。在lac3漆酶C端和N端引入一個(gè)含有6 個(gè)組氨酸標(biāo)簽的融合蛋白，以pAK145為模板，采用QuikChange Site-directed mutagenesis kit進(jìn)行定點(diǎn)突變，分別設(shè)計(jì)兩對(duì)引物：YL1 5’-GAA GCT GCT TCG CCT CTC AAT GAT GGT GGT GAT GGT GGC GCC CGA GAC CGT CGG G-3’ 和YL2 5’-CCC GAC GGT CTC GGG CGC CAC CAT CAC CAC CAT CAT TGA GAG GCG AAG CAG CTT C-3’；YL3 5'-GGT CAA GTC CGT GAC AGG TCC ATG GTG GTG GTG ATG GTG TAT TGC TGC AGA TAT TTG GG-3’ 和YL4 5'-CC CAA ATA TCT GCA GCA ATA CAC CAT CAC CAC CAC CAT GGA CCT GTC ACG GAC TTG ACC-3’。循環(huán)反應(yīng)參數(shù)為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，68 ℃ 10 min，共15 個(gè)循環(huán)。

1.3.2 轉(zhuǎn)化釀酒酵母及漆酶的培養(yǎng)

聚乙二醇-醋酸鋰（P EG-LiAc）誘導(dǎo)的化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化釀酒酵母S. cerevisiae W303-1A，SD平板中添加體積分?jǐn)?shù)為0.02%愈創(chuàng)木酚作為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選指示劑。將獲得的突變體漆酶在28 ℃，120 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)。

1.3.3 漆酶活性測(cè)定

在30 ℃條件下連續(xù)監(jiān)測(cè)2 min內(nèi)丁香醛連氮（syringaldazine，SGZ）的氧化速率，在1 mL pH 5.5 醋酸鹽緩沖體系中加入20 ?L SGZ（0.8 mg/mL），漆酶每分鐘每氧化1 μmol底物定義為1 個(gè)活力單位。

1.3.4 電泳條件及Western blotting雜交

采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和 Native-PAGE分析蛋白的分離情況，后者不加入二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT），不對(duì)樣品進(jìn)行煮沸。為了探明漆酶在非變性條件下的活性，將Native-PAGE凝膠剝離后浸泡在20 mmol/L pH 3.6的醋酸鹽緩沖液中10 min，再通過添加了2 mg/mL的對(duì)苯二胺（p-phenylenediamine，PPD）進(jìn)行染色，最后通過大量的水洗進(jìn)行染色終止。漆酶抗體的獲得通過免疫兔子獲得多克隆抗體，抗原采用純化后的天然Trametes sp. C30漆酶，對(duì)于突變體漆酶由于6 個(gè)組氨酸標(biāo)簽的融合，可使用Invitrogen公司的anti-his（C-term）-HRP抗體來對(duì)標(biāo)簽進(jìn)行識(shí)別。樣品通過SDS-PAGE來進(jìn)行分離，電轉(zhuǎn)移將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素薄膜，二抗選用羊抗兔的抗抗體。

1.3.5 漆酶的純化

將菌株液體發(fā)酵約4 d產(chǎn)生的胞外漆酶，在4 ℃、10 000 r/min條件下離心分離30 min獲得上清液，再通過微濾處理進(jìn)行濃縮，對(duì)于無標(biāo)簽的重組酶可將濃縮液上樣至DEAE-纖維素柱、Sephacryl S200進(jìn)行層析，對(duì)于含有組氨酸標(biāo)簽的蛋白可以直接將濃縮液通過Ni-NTA親和層析柱進(jìn)行純化，最終得到電泳純蛋白。

1.3.6 pH值和溫度對(duì)酶活力的影響

重組漆酶最適pH值的測(cè)定是在Mcllvaine檸檬酸/磷酸鹽緩沖液中，其pH值范圍為2.2～9.0，漆酶的活性測(cè)定以SG Z為底物，測(cè)得的最大值作為100%。

pH值對(duì)酶穩(wěn)定性影響的測(cè)定在室溫條件下于Mcllvaine緩沖液中進(jìn)行，測(cè)定在不同pH值條件下重組漆酶2、4、8、24 h的活性。溫度對(duì)酶穩(wěn)定性影響的測(cè)定是在不 同溫度條件下（30、40、50 ℃）將酶在100 mmol/L pH 5.5的醋酸鹽緩沖液中孵育2 h，每間隔15 min測(cè)一次酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體漆酶序列的確定

通過與lac3序列比對(duì)，可以確認(rèn)突變體漆酶的C端和N端成功融合了6 個(gè)組氨酸標(biāo)簽，部分序列比對(duì)結(jié)果如圖2所示，框內(nèi)為融合的組氨酸標(biāo)簽。

圖2 重組酶序列比對(duì)結(jié)果Fig.2 Sequence alignment of recombinant enzymes

2.2 陽(yáng)性重組子產(chǎn)酶性質(zhì)分析

平板中以添加愈創(chuàng)木酚為篩選標(biāo)記，將能夠產(chǎn)生紅色暈圈的重組子挑選出來，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，在4～5 d左右重組漆酶活性達(dá)到最高峰，之后開始下降。C端和N端融合6 個(gè)組氨酸標(biāo)簽后對(duì)漆酶活力影響較大，但是考慮到胞內(nèi)蛋白分泌量不同的影響，以比活力的計(jì)算來衡量融合標(biāo)簽后重組酶的特性更加有說服力。在最高峰t=120 h時(shí)，不添加標(biāo)簽的漆酶比活力為45 U/mg，C端和N端添加標(biāo)簽的重組酶比活力分別是24、20 U/mg。

將漆酶活力最高峰時(shí)的發(fā)酵液離心提取上清液后進(jìn)行SDS-PAGE（凝膠銀染）和Native-PAGE電泳，結(jié)果如圖3所示。

圖3 重組酶發(fā)酵液上清蛋白電泳圖譜Fig.3 Electrophoresis of recombinant laccase in culture supernatants

由圖3A可知，同不轉(zhuǎn)入載體的陰性對(duì)照W303-1A相比，其他3 個(gè)重組酶在90 kD左右有一條明顯的條帶，而純化后的LAC3對(duì)應(yīng)的大小也是90 kD，可以分析得知重組后的漆酶表觀分子質(zhì)量在90 kD左右，比起理論分析值53 kD要高出許多，這可能是由于釀酒酵母做表達(dá)系統(tǒng)使漆酶的糖基化程度加重。由圖3B可以看出，與陰性對(duì)照相比，3 個(gè)重組酶均有漆酶活性。

2.3 重組漆酶的純化

對(duì)于LAC3重組酶的純化采用兩步層析法，添加了組氨酸標(biāo)簽的融合蛋白可以采用一步法通過Ni-NTA柱進(jìn)行純化，純化后的蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE和Western blotting分析，結(jié)果如圖4所示。純化后的蛋白表觀分子質(zhì)量在90 kD左右，與上清液分析的結(jié)果一致，Western blotting進(jìn)一步證實(shí)純化后的蛋白具有漆酶活性。

圖4 純化后的6HN 和C6H重組酶SDS-PAGE（A）和Western blotting（B）分析Fig.4 Purity of 6HN and C6H enzymes assessed by SDS-PAGE (A, 7.5%, 2 μg/lane) and Western blotting (B, anti-LAC, 4 μg/lane)

2.4 重組漆酶的性質(zhì)研究

2.4.1 pH值和溫度對(duì)酶活力的影響

圖5 pH值對(duì)漆酶活力的影響Fig.5 Effect of pH on laccase activity

由圖5可知，在極端酸性或堿性的條件下，3 種重組漆酶的活力均降低，在pH 5.5時(shí)酶殘留活力最大，是其最佳pH值。在不同的pH值條件下將漆酶放置緩沖液中24 h并檢測(cè)其活性，發(fā)現(xiàn)3 種重組酶在酸性如pH 2.2條件下3 種重組酶活性損失較大，殘留活力LAC3為6%，6HN幾乎完全失活，對(duì)酸性條件非常敏感，C6H忍耐力略高，殘留酶活力為21%；而在中堿性條件下如在pH 8.0時(shí)活性穩(wěn)定，殘留活力LAC3為89%，C6H為63%，6HN具較強(qiáng)的堿性耐受力，為96%。以LAC3做參照，將融合C端和N端組氨酸標(biāo)簽重組酶相對(duì)活力與LAC3的相對(duì)活力進(jìn)行比較，研究標(biāo)簽對(duì)重組酶酸堿穩(wěn)定性的相對(duì)影響隨pH值的變化見圖6。圖6A表明總體來說不同的pH值條件下在N端添加標(biāo)簽獲得的重組酶比LAC3的酸堿穩(wěn)定性更高，而C端組氨酸標(biāo)簽的影響則相反（圖6B）。同樣，末端氨基酸序列的改變對(duì)熱穩(wěn)定性的相對(duì)影響（以LAC3做參照）隨溫度的變化見圖7，可知末端添加標(biāo)簽對(duì)漆酶的熱穩(wěn)定性影響不大。

表1 所有重組酶在30 ℃，pH 6.0磷酸鹽緩沖液條件下的酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table1 Kinetic parameters measurement of all the engineered enzymes in phosphate buffer (pH 6.0) at 30 ℃

圖6 融合組氨酸標(biāo)簽的重組酶與LAC3相對(duì)活力的差異隨時(shí)間和pH值的變化Fig.6 Relative activity difference between fusion laccase as a function of time and pH

圖7 融合組氨酸標(biāo)簽的重組酶與LAC3相對(duì)活力的差異隨時(shí)間和溫度的變化Fig.7 Relative activity difference between fusion laccase and LAC3 as a function of time and temperature

2.4.2 酶動(dòng)力學(xué)性質(zhì)研究

在30 ℃、pH 6.0的磷酸鹽緩沖液條件下分別以ABTS和SGZ為底物對(duì)3 種重組酶的酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表1。以SGZ做底物，C端和N端組氨酸標(biāo)簽的加入對(duì)Km影響不大，但是以ABTS做底物，C端氨基酸序列的改變對(duì)Km值影響較大，但是與底物的親和力得到了增強(qiáng)。在對(duì)kcat/Km催化效率的影響方面，以SGZ做底物，C端氨基酸序列的改變使其催化效率降低一半，但是對(duì)ABTS做底物影響不大，N端氨基酸序列的改變使其催化效率略有降低。

3 討 論

雖然活性中心某些氨基酸組成和排列順序與漆酶活性緊密相關(guān)，但是C末端和N末端的修飾加工所帶來的影響也不可忽視，C末端和N末端對(duì)漆酶的正確折疊的意義有待于進(jìn)一步研究。Gu等[24]在毛頭鬼傘漆酶的N端融合了一個(gè)含有10 個(gè)氨基酸的標(biāo)簽并表達(dá)在畢赤酵母中，獲得的兩個(gè)重組酶lac3和lac4，其表觀活性的得到了顯著的提高。本研究試圖在LAC3漆酶的C端和N端進(jìn)行延長(zhǎng)，分別引入一個(gè)含有6 個(gè)組氨酸的標(biāo)簽，探討了蛋白質(zhì)兩端氨基酸序列的變化對(duì)漆酶活性的影響。通過該實(shí)驗(yàn)成功獲得了2 個(gè)仍具有活性的重組漆酶，Western blotting檢驗(yàn)具有組氨酸標(biāo)簽，可用于漆酶自組裝單層膜的后續(xù)研究。漆酶兩端融合組氨酸標(biāo)簽異源表達(dá)后獲得的新酶，與未融合的LAC3相比，兩端氨基酸序列的改變使其比活力保持在50%左右?？紤]到其對(duì)蛋白表達(dá)的影響，在C端引入組氨酸標(biāo)簽的重組酶的表達(dá)量不受影響，但是N末端引入組氨酸標(biāo)簽的重組酶其表達(dá)量只有LAC3的一半。添加組氨酸標(biāo)簽的融合蛋白對(duì)ABTS和SGZ兩種底物的催化效率略有下降，但是對(duì)底物的親和力得到增強(qiáng)。而在酸堿和熱穩(wěn)定性耐受方面，同LAC3相比，末端氨基酸的改變使其在酸堿穩(wěn)定性方面得到了增強(qiáng)，熱穩(wěn)定性方面則變化不大。雖然在酶兩端引入的氨基酸序列長(zhǎng)度比較適中，僅6 個(gè)組氨酸，但是對(duì)酶性質(zhì)的影響比較大，尤其是對(duì)N端的改造，這可能是因?yàn)镹端插入氨基酸的位置離著胞外分泌信號(hào)肽的距離較近從而造成了表達(dá)量上的減少。

在對(duì)含標(biāo)簽的蛋白用Ni-NTA柱進(jìn)行純化過程中，發(fā)現(xiàn)蛋白結(jié)合在柱子上的量較少僅有10%～15%，造成純化得率較低，即通過組氨酸與鎳離子穩(wěn)定的螯合作用的蛋白量少，而通過Anti-his（C-term）-HRP 抗體對(duì)蛋白進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，所有的蛋白均有強(qiáng)烈信號(hào)，這可能是由于融合的組氨酸標(biāo)簽并未完全暴露在酶分子的表面，從而失去了與鎳離子螯合的機(jī)會(huì)。Bleve等[25]發(fā)現(xiàn)杏鮑菇漆酶基因EYR4在酵母中表達(dá)時(shí)并沒有漆酶活性，而通過對(duì)C端的氨基酸序列進(jìn)行2～18 個(gè)不等氨基酸的切除時(shí)可獲得對(duì)底物有不同親和力的突變體，說明了C端序列對(duì)酶活力、穩(wěn)定性和動(dòng)力學(xué)的重要影響。也許通過對(duì)C端和N端的氨基酸序列進(jìn)行部分切除，再加入組氨酸標(biāo)簽會(huì)有利于酶分子活性中心及融合蛋白的暴露，可作為下一步的研究展開探索。此外，結(jié)晶技術(shù)可能是比較直觀獲得漆酶結(jié)構(gòu)的方式，但是需要的重組酶產(chǎn)量較大純度較高，可通過對(duì)C和N末端截平后重組漆酶的變化比較后再做進(jìn)一步深入研究。

另外，漆酶是一種糖蛋白，其含糖量和種類隨來源的不同而不同，釀酒酵母表達(dá)后，漆酶的表觀分子質(zhì)量達(dá)90 kD左右。通過NetNGlyc 1.0對(duì)LAC3漆酶的序列進(jìn)行N-glycosylation糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)，其序列中含有7 個(gè)位點(diǎn)，假設(shè)每一條糖鏈有連接40 個(gè)甘露糖的潛力（約7 kD），7 個(gè)位點(diǎn)的分子質(zhì)量共計(jì)約49 kD，而漆酶的理論分子質(zhì)量在53 kD，總和與表觀分子質(zhì)量相近，說明漆酶含糖量非常高，發(fā)生了高度糖基化，而糖基化對(duì)漆酶結(jié)構(gòu)和酶活性的影響還有待于進(jìn)一步研究，可以考慮直接去糖基化或者更換一種表達(dá)系統(tǒng)。

總的來說，雖然擔(dān)子菌漆酶C端和N端在漆酶中的作用還不明確，但是通過對(duì)漆酶C端和N端截平或者延長(zhǎng)的可塑性研究，以期對(duì)擔(dān)子菌漆酶結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系有進(jìn)一步了解，為漆酶的改性獲得具有更好性狀的新型酶制劑研究和開發(fā)提供一定的思路和借鑒。

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Heterologous Expression of Trametes sp. Laccase in Saccharomyces cerevisiae and Characterization of Recombinant Enzyme by Fusing a Six-His Tag at N and C Termini

LIU Ying-li1, LIU Jun-ming1, WANG Jing1, SUN Bao-guo1,*, THIERRY Tron2
(1. Beijing Laboratory for Food Quality and Safety, Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China; 2. Aix Marseille Université, CNRS, iSm2 UMR 7313, Marseille 13397, France)

Although some amino acid components and sequence of the active center are strongly related with laccase activity, the impact of C- and N-te rminal modifications cannot be neglected. The effects of C- and N- terminal plasticity on the activity, structure and properties of Basidiomycetes laccase are still unclear so far. In this study, the laccase gene LAC3 was cloned from Trametes sp. C30 and two mutants were obtained by fusing an additional 6-histidine tag at both C and N termini. All these stains were successfully expressed in the yeast Saccharomyces cerevisiae. The recombinant enzymes obtained were compared and the results showed that the modification of terminal amino acid sequence of the enzyme considerably affected its characteristics. Compared with LAC3, the production of C-terminal histidine-tagged recombinant enzyme was not affected, but the production of N-terminal histidine-tagged recombinant enzyme was only half of the amount of LAC3. The affinity to the substrate ABTS and SGZ was enhanced by both histidine-tagged fusion proteins. Compared with LAC3, the pH stability was enhanced and the activity was maintained better under alkaline or neutral conditions with the modification on the N-terminal. Studies of the pla sticity of the C and N termini have great significance to obtain new laccases.

laccase; heterologous expression; his-tag; C terminus; N terminus

TS201.2

A

1002-6630（2014）21-0143-06

10.7506/spkx1002-6630-201421028

2014-06-15

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31271976）；北京市屬高等學(xué)校高層次人才引進(jìn)與培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目（CIT&TCD20130309；IDHT20130506）；北京工商大學(xué)青年啟動(dòng)基金項(xiàng)目（QNJJ2012-24）

劉英麗（1981—），女，講師，博士，主要從事食品品質(zhì)改良研究。E-mail：liuyingli@th.btbu.edu.cn

*通信作者：孫寶國(guó)（1961—），男，教授，博士，主要從事食品質(zhì)量與安全研究。E-mail：sunbg@btbu.edu.cn