劉 平，胡志和*，吳子健，薛 璐，王鳳玲

（天津市食品生物技術重點實驗室，天津商業(yè)大學生物技術與食品科學學院，天津 300134）

超高壓處理菠蘿蛋白酶引發(fā)構象變化與酶活力的關系

劉 平，胡志和*，吳子健，薛 璐，王鳳玲

（天津市食品生物技術重點實驗室，天津商業(yè)大學生物技術與食品科學學院，天津 300134）

采用超高壓處理菠蘿蛋白酶，研究菠蘿蛋白酶結(jié)構變化與酶活力的關系。采用傅里葉紅外光譜（Fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)TIR）檢測二級結(jié)構變化，熒光光譜檢測三級結(jié)構變化，采用福林酚法測定酶活力。結(jié)果顯示，與0.1 MPa相比，在37 ℃，不同壓力（100～500 MPa）處理20 min，對菠蘿蛋白酶活力均有顯著影響（P＜0.05）。200 MPa處理時，酶活力達到最大值（3 524 U/g）， 提高了8.29%。200 MPa處理后的菠蘿蛋白酶，經(jīng)傅里葉紅外光譜分析結(jié)果顯示，β-折疊含量比常壓下增加了1.76 倍。內(nèi)源性熒光光譜結(jié)果顯示，280 nm波長處激發(fā)，熒光強度達到最高4 934。因此，菠蘿蛋白酶的活性與β-折疊的含量以及親水性Typ殘基的暴露程度有關。

超高壓；菠蘿蛋白酶；酶活力；構象；紅外光譜；熒光光譜

菠蘿蛋白酶在醫(yī)藥和化工領域有重要的利用價值。近年來，有關菠蘿蛋白酶的研究也是熱點[1-5]。菠蘿蛋白酶屬于巰基蛋白酶，相對分子質(zhì)量為23 828[6]，由20 種共212 個氨基酸組成。

陶敏等[7]利用超高壓處理菠蘿蛋白酶，發(fā)現(xiàn)超高壓能減弱溫度對菠蘿蛋白酶活性的影響程度。張兆琴等[8]研究了動態(tài)高壓微射流技術對菠蘿蛋白酶活性及構象的影響，結(jié)果顯示，其對菠蘿蛋白酶具有鈍化作用，構象分析表明，動態(tài)高壓微射流技術導致菠蘿蛋白酶部分去折疊，分子中酪氨酸和色氨酸殘基所處的微環(huán)境發(fā)生了變化。但構象變化與酶活性的關系在相關文獻中沒有具體闡述。

本研究采用不同超高壓條件處理菠蘿蛋白酶，利用紅外光譜和熒光光譜分析超高壓處理后的結(jié)構變化，采用福林-酚法檢測酶活變化。探討超高壓處理所引發(fā)菠蘿蛋白酶空間結(jié)構變化與酶活力之間的關系，為超高壓結(jié)合酶法生產(chǎn)水解產(chǎn)物提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試劑

菠蘿蛋白酶 美國Sigma公司；酪蛋白、NaOH、Na2CO3、三氟乙酸、福林-酚、Na2HPO3、NaH2PO3均為分析純級 天津昊斯生物技術有限公司；8-苯胺基-1-萘磺酸（8-anilinol-naphthalenesulfonic acid，ANS） 美國Sigma公司；KBr為光譜級 上?；瘜W試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

HPP.L2-800/2.5超高壓設備 天津市華泰森淼生物工程技術有限公司；DC-2030節(jié)能型智能恒溫槽 寧波新芝生物科技股份有限公司；Nicolet5700傅里葉紅外光譜儀 美國尼高力儀器公司；TU-1810型紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；L535-1型低速離心機 湘儀離心機儀器有限公司；F-4600熒光光度計 日立高新技術公司；FD-2冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；VELP漩渦振蕩器 德祥科技有限公司；塑料薄膜封口機 浙江江南實業(yè)有限公司；FA1104N型電子天平 上海精密科學儀器有限公司；FE20型pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HWS24型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品超高壓處理

采用HPP.L2-800/2.5超高壓設備處理樣品，外接DC-2030節(jié)能型智能恒溫槽控制溫度。將菠蘿蛋白酶溶于磷酸緩沖液（pH值調(diào)為7.5），配制質(zhì)量濃度為10 mg/mL。取菠蘿蛋白酶溶液5 mL，裝入聚乙烯塑料袋真空密封后，采用不同超高壓條件處理。條件為：保壓時間20 min、溫度37 ℃，處理壓力別為0.1、100、200、300、400、500、600 MPa，其中，對照組為常壓（0.1 MPa）處理的酶溶液。

1.3.2 福林-酚法檢測酶活力

采用福林-酚法測定不同超高壓條件處理的菠蘿蛋白酶的活力[7]。4 mL反應體系包括：1 mL酶緩沖溶液（不同壓強處理的酶液），1 mL酪蛋白溶液（10 g/L），40 ℃恒溫水浴中反應10 min，加入2 mL三氯乙酸（65.4 g/L）終止反應。終止反應后過濾，取1 mL濾液加入5 mL Na2CO3溶液（42.4 g/L）和1 mL福林-酚，40 ℃恒溫水浴中顯色20 min，在680 nm波長處測定其吸光度（每組條件做3 個平行，取均值）。酶活力計算見下式。

式中：X為樣品的酶活力/（U/g）；A為由標準曲線得出的樣品最終稀釋液的活力/（U/mL）；V為溶解樣品所使用的容量瓶的體積/mL；4為反應試劑的總體積/mL；n為樣品的稀釋倍數(shù)；m為樣品的質(zhì)量/g；10為反應時間/min。

1.3.3 樣品的紅外光譜掃描

不同超高壓條件處理的菠蘿蛋白酶冷凍干燥，稱取干燥樣品2 mg與100 mg KBr混合，壓片，采用Nicolet5700傅里葉紅外光譜儀掃描。以波數(shù)為橫坐標，透光率為縱坐標，采用EZOMNIC分析軟件分析其紅外光譜的變化。

1.3.4 樣品的熒光光譜掃描

1.3.4.1 菠蘿蛋白酶的內(nèi)源性熒光光譜掃描

將超高壓處理的菠蘿蛋白酶溶液（0.1 mg/mL）進行內(nèi)源性熒光測定。分別以295 nm和280 nm波長處為激發(fā)波長，掃描300～400 nm的發(fā)射光譜，狹縫寬度為2 nm。

1.3.4.2 菠蘿蛋白酶的外源性熒光光譜掃描

不同超高壓條件處理的菠蘿蛋白酶溶液（0.1 mg/mL）取4 m L，加入2 0 ? L的A N S外源熒光探針溶液（5.0 mmol/L）。避光反應1 h后，采用F-4600熒光光度計進行熒光光譜掃描。選擇228 nm激發(fā)后，掃描290～420 nm的發(fā)射光譜，狹縫寬度為2 nm。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)采用Origin8.0作圖；SPSS17.0軟件對高壓處理后的菠蘿蛋白酶活力大小，二級結(jié)構的峰面積大小以及熒光強度等實驗數(shù)據(jù)進行顯著性分析；采用EZ OMNIC軟件分析紅外光譜的變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 超高壓處理對菠蘿蛋白酶活力的影響

在37 ℃，不同壓力（0.1、100、200、300、400、500、600 MPa）下處理菠蘿蛋白酶20 min，測得酶活力變化見圖1。

圖1 37 ℃不同壓力下處理20 min對菠蘿蛋白酶活力的影響Fig.1 Effect of different pressures for 20 min at 37 ℃ on bromelain activity

由圖1可知，與對照組（0.1 MPa）相比，在所選壓力范圍內(nèi)，酶活力變化顯著（P＜0.05）。當壓力從0.1 MPa升高到200 MPa，酶活力從3 254 U/g增加到3 524 U/g，比常壓下提高了8.29%；當壓力從200 MPa升高到600 MPa，酶活力逐漸下降，在600 MPa時，酶活力為3 304 U/g，仍高于對照組。酶活力變化是因為酶在經(jīng)過超高壓處理后，酶活性中心的非共價鍵發(fā)生變化，導致酶活性中心部分裸露，其空間結(jié)構發(fā)生了改變[9-12]，引起生物活性變化，體現(xiàn)為酶活力變化[13]。

2.2 不同高壓處理的菠蘿蛋白酶的二級結(jié)構變化與酶活力的關系

蛋白質(zhì)的二級結(jié)構與氫鍵的形成方式有密切關系。α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角等二級結(jié)構中都有特定的氫鍵構成。這種特定氫鍵之間的結(jié)構差異能清楚地表現(xiàn)在對氫鍵變化敏感的紅外光譜上。目前用紅外光譜來研究蛋白質(zhì)二級結(jié)構的文獻很多[14-18]。紅外光譜主要分為3 個帶，酰氨Ⅰ帶1 600～1 700 cm-1，酰氨Ⅱ帶1 500～1 600 cm-1，酰氨Ⅲ帶1 230～1 240 cm-1[19]。但只有酰氨Ⅰ帶是對蛋白質(zhì)結(jié)構變化高度敏銳的一個譜帶。已有研究把酰氨Ⅰ帶主要歸屬于C—O鍵伸縮振動及肽鍵的C—N伸縮振動，可反映蛋白質(zhì)的二級結(jié)構[20]。其中α-螺旋含量以1 650～1 658 cm-1處峰面積表示，β-折疊為1 610～1 640 cm-1處峰面積表示，β-轉(zhuǎn)角為1 660～1 700 cm-1處峰面積表示。

圖2 不同壓力下37 ℃、20 min處理后菠蘿蛋白酶的紅外光譜Fig.2 Infrared spectra of bromelain treated by different pressure at 37 ℃for 20 min

由圖2可知，不同壓力條件處理后，菠蘿蛋白酶紅外圖譜中酰胺Ⅰ帶的波數(shù)位于1 650 cm-1附近。采用EZ OMNIC軟件去卷積進一步分析紅外光譜圖，比較菠蘿蛋白酶中二級結(jié)構β-折疊，α-螺旋以及β-轉(zhuǎn)角的含量變化，見表1。

表1 不同壓力處理下37 ℃、20 min菠蘿蛋白酶二級結(jié)構的峰面積變化（x±s，n=3）Table1 Peak area changes of secondary structures of bromelain treated by different pressures at 37 ℃ for 20 min (±s, n=3)

由表1可知，與對照組相比，不同程度（100～600 MPa）的高壓處理后，菠蘿蛋白酶中β-折疊含量變化顯著（P＜0.05）。說明不同程度的壓力處理會影響菠蘿蛋白酶二級結(jié)構中β-折疊的含量。100 MPa和200 MPa處理后，菠蘿蛋白酶中β-折疊含量增加。在200 MPa時達到最高，是常壓下的2.76倍。300～600 MPa處理后，β-折疊含量呈現(xiàn)降低趨勢。在600 MPa含量最低，比常壓下降了41.05%。其變化規(guī)律與酶活力變化規(guī)律相似。不同壓力處理之后，α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角的峰面積較常壓下相比，含量變化顯著（P＜0.05）。但二者變化的規(guī)律與酶活力變化規(guī)律的相關性較低。

圖3 3 β-折疊的含量與酶活力的關系Fig.3 Relationship between β-sheet content and bromelain activity

由圖3可知，不同壓力處理菠蘿蛋白酶，其二級結(jié)構中β-折疊的含量變化趨勢與酶活力變化趨勢相似。100～600 MPa不同程度壓力處理，二者都呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，且二者同時在200 MPa時達到最大值。說明菠蘿蛋白酶二級結(jié)構中的β-折疊的含量與酶活力大小具有相關性，β-折疊的含量越多，酶活力越大。

2.3 菠蘿蛋白酶的活性與內(nèi)部氨基酸微環(huán)境的關系

2.3.1 超高壓處理菠蘿蛋白酶后的內(nèi)源性熒光檢測

在蛋白質(zhì)分子中有一些能發(fā)射熒光的氨基酸。比如色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）。但它們有不同的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜。一般實驗條件下Phe很難被激發(fā)。激發(fā)波長為295 nm時，僅有疏水性Trp殘基被激發(fā)，并產(chǎn)生熒光。激發(fā)波長為280 nm時，菠蘿蛋白酶內(nèi)源熒光主要來自疏水性Trp殘基和親水性Tyr殘基[21]。因此，選擇295 nm和280 nm作為激發(fā)波長，觀察菠蘿蛋白酶內(nèi)疏水性Trp殘基和親水性Tyr殘基的微環(huán)境變化。

2.3.1.1 295 nm波長處激發(fā)的熒光強度

由圖4可知，2 9 5 n m波長處激發(fā)，從常壓（0.1 MPa）到600 MPa，發(fā)射波長位移變化范圍在330～332 nm內(nèi)，根據(jù)Burstern提出的色氨酸殘基微環(huán)境的特點[22]，即1）λmax=330～332 nm，埋藏在非極性區(qū)域內(nèi)；2）λmax=340～342 nm，固定在蛋白質(zhì)分子表面，且與水的接觸受到限制；3）λmax=350～352 nm，徹底暴露于水中（λmax為熒光發(fā)射光譜的峰位），處理前后的菠蘿蛋白酶的色氨酸發(fā)射波長均在330～332 nm范圍內(nèi)，說明色氨酸殘基埋藏在非極性區(qū)域內(nèi)。從熒光強度變化情況來看，不同壓力處理與對照組相比，除了100 MPa，其他條件的熒光強度變化都不顯著（P＞0.05）。100 MPa處理，熒光強度增大，說明色氨酸殘基的微環(huán)境發(fā)生了一定的變化。200、300、400、500、600 MPa處理，熒光強度幾乎沒有變化，說明色氨酸殘基的微環(huán)境基本沒有發(fā)生變化，也有可能是當壓力超過100 MPa之后，隨著壓強繼續(xù)增加，稍有變化的色氨酸微環(huán)境又逐漸被包埋起來，導致熒光強度變化不顯著。因此，295 nm波長處激發(fā)，色氨酸殘基在100 MPa時有一定的暴露伸展趨勢，但并未完全暴露出來。

圖4 不同壓力37℃處理菠蘿蛋白酶20 min、295 nm處激發(fā)時的熒光光譜Fig.4 Fluorescence spectra of bromelain treated by different pressures at 37 ℃ for 20 min at excitement wavelength of 295 nm

2.3.1.2 280 nm波長處激發(fā)的熒光強度

圖5 在37 ℃、不同壓力處理菠蘿蛋白酶20 min、280 nm處激發(fā)時的熒光光譜Fig.5 Fluorescence spectra of bromelain treated by different pressure at 37 ℃ for 20 min at excitement wavelength of 280 nm

由圖5可知，280 nm處激發(fā)，不同壓力處理的菠蘿蛋白酶熒光強度與對照組（0.1 MPa）相比變化顯著（P＜0.05）。100～600 MPa處理的菠蘿蛋白酶的熒光強度呈先增加后下降的趨勢。200 MPa時，熒光強度達到最大值4 934，比對照組的熒光強度增加了20.57%，說明此時菠蘿蛋白酶內(nèi)部親水性酪氨酸殘基暴露的最多。從200～600 MPa的壓力變化過程中，熒光強度呈現(xiàn)降低趨勢，說明裸露出來的氨基酸殘基部分又被包埋起來?？梢钥闯?，壓力的不斷變化，會使菠蘿蛋白酶內(nèi)部不同氨基酸的微環(huán)境處于漸變的狀態(tài)。結(jié)合在295 nm波長激發(fā)時（Trp）熒光強度變化不顯著（P＞0.05），由此推斷：280 nm處主要體現(xiàn)的是親水性Tyr殘基的暴露程度。同時，從菠蘿蛋白酶氨基酸序列[5]可以看出，在菠蘿蛋白酶的212 個氨基酸中（表2），共有11 個親水性酪氨酸，占氨基酸總數(shù)的5.19%。它們分別位于第11、39、61、87、89、106、123、142、143、185和207位。不同程度的超高壓處理后，很有可能是菠蘿蛋白酶上述位置的酪氨酸附近的微環(huán)境發(fā)生了變化。

表2 菠蘿蛋白酶氨基酸序列Table2 Amino acid sequence of bromelain

2.3.1.3 熒光強度變化與酶活力的關系

圖6 37 ℃不同壓力處理菠蘿蛋白酶20 min、280 nm處激發(fā)熒光強度與酶活力的關系Fig.6 Relationship between fluorescence intensity and bromelain activity treated by different pressure sat 37 ℃ for 20 min at excitation wavelength of 280 nm

由圖6可知，280 nm處激發(fā)，菠蘿蛋白酶的最大發(fā)射峰（波長）的熒光強度變化與酶活力的變化趨勢相似。壓力在0.1～200 MPa范圍內(nèi)，隨壓力增加，熒光強度也隨之增加，說明Tyr殘基暴露程度越大。與此同時酶活力也在增大，二者都在200 MPa處達到峰值（4 934， 3 524 U/g）。酶活力比常壓下提高了8.29%。隨著壓力繼續(xù)增加，二者都呈下降趨勢。由于280 nm波長處體現(xiàn)的主要是親水性酪氨酸的暴露程度，所以經(jīng)不同高壓處理后，Tyr殘基的暴露程度會影響菠蘿蛋白酶活力。Tyr殘基的暴露程度越大，酶活力越大。

2.3.2 超高壓處理菠蘿蛋白酶后的外源性熒光檢測

蛋白質(zhì)分子表面被一層親水基包圍。帶有疏水側(cè)鏈的殘基一般位于其分子內(nèi)部。蛋白質(zhì)高級結(jié)構的特征是疏水與親水之間的平衡。所以蛋白質(zhì)高級結(jié)構的穩(wěn)定在很大程度上依賴于分子內(nèi)部的疏水作用[21]。蛋白質(zhì)內(nèi)疏水性氨基酸有蛋氨酸（M）、色氨酸（W）、苯丙氨酸（F）、纈氨酸（V）、亮氨酸（L）、異亮氨酸（I）、脯氨酸（P）和丙氨酸（A）。不同壓力處理菠蘿蛋白酶后，加入外源性探針ANS[23-24]，將228 nm作為激發(fā)波長，掃描熒光光譜圖。不同壓強處理菠蘿蛋白酶，228 nm波長處激發(fā)時，熒光光譜圖見圖7。

圖7 37 ℃，不同壓力處理菠蘿蛋白酶20 min、228 nm處激發(fā)時的熒光光譜Fig.7 Fluorescence spectra of bromelain treated by different pressures at 37 ℃ for 20 min at excitement wavelength of 228 nm

由圖7可知，228 nm處激發(fā)，不同程度高壓處理的菠蘿蛋白酶熒光強度與對照組（0.1 MPa）比變化顯著（P＜0.05）。說明高壓處理后菠蘿蛋白酶內(nèi)部的疏水氨基酸的微環(huán)境發(fā)生了不同程度的變化。在200 MPa時，疏水氨基酸熒光強度最大（2 902），說明此條件下疏水性氨基酸殘基暴露的最多。100～600 MPa處理時，熒光強度值出現(xiàn)了上下波動。說明在高壓處理的過程中，疏水氨基酸有部分暴露和掩埋。菠蘿蛋白酶一級結(jié)構[5]顯示，疏水性氨基酸一共有78 個（表2），占所有氨基酸總數(shù)的36.8%。根據(jù)Lim規(guī)則[25]，在2～6、13～17、27～31、28～32、29～33、30～35、45～49、70～75、81～85、82～86、101～105、121～125、129～133、132～136、148～152、178～182、201～205、202～206等區(qū)域極易形成疏水性區(qū)域。推測高壓處理后，可能是上述位置的氨基酸微環(huán)境有變化。228 nm波長處激發(fā)，由于熒光強度的變化與酶活力變化沒有相似的規(guī)律性，所以疏水性氨基酸熒光總強度變化與酶活力變化相關性較差。

3 結(jié) 論

超高壓作用菠蘿蛋白酶后，空間結(jié)構會發(fā)生伸展或被重新包埋，這與Somkuti等[12]的研究結(jié)果相吻合。其中，菠蘿蛋白酶大小與其二、三級結(jié)構的變化密切相關。二級結(jié)構研究顯示，其酶活力大小與β-折疊的含量有關，β-折疊含量越大，酶活力越大。三級結(jié)構研究顯示，親水性酪氨酸的暴露程度與菠蘿蛋白酶活力大小有關，其暴露程度越大，酶活力越大。

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Relationship between Bromelain Activity and Conformational Changes Caused by Ultra High Static Pressure

LIU Ping, HU Zhi-he*, WU Zi-jian, XUE Lu, WANG Feng-ling
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, School of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

The relationship between structural changes and bromelain activity was investig ated. After bromelain was treated at various pressure levels, its secondary structure changes were observed by Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), its tertiary structure changes were examined by fluorescence spectroscopy, and its activity was tested using Folin phenol method. The results showed that compared with the control group (0.1 MPa), the bromelain activity significantly changed after treatment at 37 ℃ for 20 min at 100-500 MPa (P ＜ 0.05). The maximum level (3 524 U/g) of bromelain activity was observed after treatment of the enzyme at 200 MPa, representing a 8.29% increase over the control group. Moreover, the treated enzyme displayed a 2.76-fold increase in β-sheet content as analyzed by Fourier transform infrared spectroscopy. The maximum endogenous fluorescence spectral intensity of 4 934 was found at excitation wavelength of 280 nm. Therefore, bromelain activity is related to the β-sheet content and the exposure degree of Tyr residues.

ultra high static pressure; bromelain; enzyme activity; conformation; infrared spectroscopy; fluorescence spectroscopy

Q71

A

1002-6630（2014）21-0138-05

10.7506/spkx1002-6630-201421027

2014-06-22

國家自然科學基金面上項目（31271841）；天津市高等學校創(chuàng)新團隊項目（TD12-5049）

劉平（1987—），女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術。E-mail：liuping0402@126.com

*通信作者：胡志和（1962—），男，教授，碩士，研究方向為專用功能食品。E-mail：hzhihe@tjcu.edu.cn