蔣騰川，宋新波,2,*，張麗娟

（1.天津中醫(yī)藥大學研究生院，天津 300193；2.天津中一制藥有限公司，天津 300193）

凝膠過濾色譜法測定3種不同來源多肽的相對分子質(zhì)量分布

蔣騰川1，宋新波1,2,*，張麗娟1

（1.天津中醫(yī)藥大學研究生院，天津 300193；2.天津中一制藥有限公司，天津 300193）

目的：建立凝膠過濾色譜法測定多肽（如大豆肽、白蛋白多肽、羊胎盤多肽）的相對分子質(zhì)量分布的方法。方法：采用TSK-GEL G2000SWXL色譜柱（300 mm×7.8 mm，5 μm）、流動相為 乙腈-水-三氟乙酸（15∶85∶0.07，V/V）、流速0.6 mL/min、柱溫30 ℃、進樣體積10 μL、檢測波長220 nm。結果：在相對分子質(zhì)量189.1～12 355之間，相對分子質(zhì)量對數(shù)與保留時間 呈線性關系，相關系數(shù)為0.995 6，方法精密度、重復性、穩(wěn)定性良好，準確度高。結論：本方法操作簡便快速、靈敏度高、重復性好，適用于多肽類物質(zhì)相對分子質(zhì)量分布的檢測。

凝膠過濾色譜法；大豆；白蛋白；羊胎盤；多肽；相對分子質(zhì)量

多肽是相對分子質(zhì)量介于氨基酸與蛋白質(zhì)之間的一類物質(zhì)，其吸收機制與游離氨基酸相比，具有耗能低、轉運速度快、載體不易飽和等優(yōu)點，是當今保健食品領域和生物醫(yī)藥領域的研究熱點之一[1]。傳統(tǒng)觀點認為蛋白質(zhì)在體內(nèi)需經(jīng)蛋白酶、腸內(nèi)菌群等作用完全消化為氨基酸才可以被吸收。隨著蛋白質(zhì)多肽類物質(zhì)消化吸收代謝的深入研究，科學家們發(fā)現(xiàn)由蛋白質(zhì)水解得到的小肽（一般認為是二肽、三肽）可被機體完整轉運，此后有研究[2-3]表明4個以上氨基酸殘基組成的寡肽也能被機體直接吸收。吳冬梅等[4]對多種多肽在大鼠離體小腸中的吸收情況進行了研究，認為被吸收肽的相對分子質(zhì)量多在1 000以內(nèi)。多肽除了具有良好的吸收特性外，還具 有眾多的生理活性，如抗菌、抗氧化、抗疲勞、調(diào)節(jié)免疫、血管緊張素轉換酶抑制作用[5-9]。多肽的相對分子質(zhì)量與其生理活性密切相關[10]，是多肽類產(chǎn)品質(zhì)量控制的關鍵因素之一，這就需要建立一種能有效測定多肽相對分子質(zhì)量的方法。

測定相對分子質(zhì)量的方法有多種，如超濾法[11]、凝膠電泳法[12]、凝膠過濾色譜法[13-14]、質(zhì)譜法[15-16]等。其中超濾法只能較為粗略地測定相對分子質(zhì)量分布，在分離純化部分應用較多；凝膠電泳法存在操作繁瑣、重現(xiàn)性差的缺點[17]，且對小肽的相對分子質(zhì)量測定有很大的局限性，適用于蛋白質(zhì)、多肽相對分子質(zhì)量分布研究的初期階段；質(zhì)譜法能較為精確地測定分子質(zhì)量分布，但設備昂貴，不宜做常規(guī)分析手段[18]；凝膠過濾色譜法具有操作簡便快速、重復性好、精確度高的特點[19-20]，已廣泛應用于測定多肽、多糖等大分子物質(zhì)的相對分子質(zhì)量及其分布[21-23]。本實驗采用凝膠過濾色譜法來測定大豆肽、白蛋白多肽、羊胎盤多肽的相對分子質(zhì)量，旨在為同類產(chǎn)品的生產(chǎn)制備和質(zhì)量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

相對分子質(zhì)量標準物質(zhì)：細胞色素C（Mr12355）、胰蛋白酶抑制劑（Mr6511）、人血管緊張素Ⅱ（Mr1045.5）、乙氨酰乙氨酰酪氨酰精氨酸（Mr451.2）、乙氨酰乙氨酰乙氨酸（Mr189.1） 中國計量科學研究院；大豆肽（編號：SS12204）、白蛋白多肽（編號：SS12265） 武漢天天好生物制品有限公司；羊胎盤多肽 實驗室自制；乙腈（色譜純） 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

LC-20AD高效液相色譜儀（配有SPD-10A紫外檢測器、CTO-10A柱溫箱） 日本島津公司；TSK-GEL G2000SWXL色譜柱（300 mm×7.8 mm，5 μm） 東曹（上海）生物科技有限公司；AL204型電子天平 瑞士Mettler-Toledo公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)儀 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 相對分子質(zhì)量標準物質(zhì)溶液的配制

分別精密稱取相對分子質(zhì)量標準物質(zhì)細胞色素C、胰蛋白酶抑制劑、人血管緊張素Ⅱ、乙氨酰乙氨酰酪氨酰精氨酸、乙氨酰乙氨酰乙氨酸適量，加超純水溶解配成2.5 mg/mL的溶液。按1∶1（V/V）的比例將上述溶液混合后搖勻，制成0.5 mg/mL的標準物質(zhì)溶液，用0.45 μm的濾膜過濾備用。

1.3.2 供試品溶液的配制

分別精密稱取各樣品適量，加超純水溶解配成5.0 mg/mL的溶液，用0.45 μm的濾膜過濾備用。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：TSK-GEL G2000SWXL（300 mm× 7.8 mm，5 μm）；流動相為乙腈-水-三氟乙酸（15∶85∶0.07，V/V）；流速0.6 mL/min；柱溫30 ℃；進樣體積10 μL；檢測波長220 nm。

1.4 統(tǒng)計分析

采用SHIMADZU GPC數(shù)據(jù)處理軟件分析色譜圖。

1.5 數(shù)均相對分子質(zhì)量和重均相對分子質(zhì)量的計算[20]

式（1）中：Ni為第i種分子的物質(zhì)的量；Mi為第i種分子的分子質(zhì)量。

式（2）中：Wi為第i種分子的質(zhì)量；Mi為第i種分子的分子質(zhì)量。

2 結果與分析

2.1 色譜柱的考察

圖1 凝膠色譜柱對混合標準物質(zhì)的分離Fig.1 Selection of column for GFC analysis

考察TSK-GEL G2000SWXL凝膠柱（普通批次）和TSK-GEL G2000SWXL凝膠柱（特殊批次）對混合標準物質(zhì)分離度的影響，結果顯示：采用TSKGEL G2000SWXL凝膠柱（普通批次）時混合標準物質(zhì)不能實現(xiàn)有效分離，如圖1中1號色譜圖所示，而采用TSKGEL G2000SWXL凝膠柱（特殊批次）時混合標準物質(zhì)得到有效分離，如圖1中2號色譜圖所示，其中最小分離度2.75，最小理論塔板數(shù)10248.8，最大理論塔板數(shù)32146.3。故最后選擇TSKGEL G2000SWXL凝膠柱（特殊批次）測定大豆肽、白蛋白多肽、羊胎盤多肽相對分子質(zhì)量及其分布。

2.2 流動相的考察

圖2 流動相的考察Fig.2 Optimization of the mobile phase

在流動相中乙腈-水為15∶85（V/V）的前提下，通過調(diào)節(jié)流動相中三氟乙酸的體積分數(shù)（0.01%～0.08%），考察三氟乙酸對混合標準物質(zhì)分離度的影響，結果顯示（圖2）混合標準物質(zhì)分離度隨三氟乙酸的體積分數(shù)增大而增大，但考慮到該色譜柱的pH值適用范圍為2.5～7.5，三氟乙酸體積分數(shù)過大會對色譜柱造成損傷，最后將三氟乙酸的的體積分數(shù)定為0.07%。

2.3 標準曲線的繪制

取混合標準物質(zhì)溶液，進樣10μL，記錄色譜圖，如圖3所示。

圖3 混合標準物質(zhì)凝膠過濾色譜圖Fig.3 GFC chromatogram of mixed standards

5種標準物質(zhì)的保留時間、相對分子質(zhì)量和相對分子質(zhì)量對數(shù)的關系見表1。

表1 5種標準物質(zhì)的保留時間和相對分子質(zhì)量的對應關系Table 1 Relationships of retention time with relative molecular weights of five standards

以標準物質(zhì)相對分子質(zhì)量對數(shù)lgM對保留時間t做線性回歸，得回歸方程為lgM=―0.286t+6.939，相關系數(shù)r=0.9956，說明在相對分子質(zhì)量189.1～12355范圍內(nèi)，5種標準物質(zhì)相對分子質(zhì)量對數(shù)與保留時間呈良好的線性關系。

2.4 精密度實驗

取羊胎盤多肽供試品溶液10 μL，按1.3.3節(jié)色譜條件連續(xù)進樣6 次，測定保留時間為14.8 min左右的主色譜峰的保留時間和峰面積，計算其相對標準偏差分別為0.040%、0.037%，表明方法的精密度良好。

2.5 重復性實驗

精密稱取羊胎盤多肽供試品6 份，每份25 mg，按1.3.2節(jié)制備供試品溶液，按1.3.3節(jié)色譜條件分別進樣，測定保留時間為14.8 min左右的主色譜峰的保留時間和峰面積，計算其相對標準偏差分別為0.033%、0.273%，表明方法的重復性良好。

2.6 穩(wěn)定性實驗

取羊胎盤多肽供試品溶液10 μL，按1.3.3節(jié)色譜條件分別于取樣后0、2、4、6、8、18、24 h進樣，測定保留時間為14.8 min左右的主色譜峰的保留時間和峰面積，計算其相對標準偏差分別為0.147%、0.255%，表明方法的穩(wěn)定性良好。

2.7 準確度實驗

精密稱取相對分子質(zhì)量標準物質(zhì)人血管緊張素Ⅱ6份，加超純水溶解配成0.5 mg/mL的溶液。按1.3.3節(jié)色譜條件分別進樣分析，通過凝膠過濾色譜法得到的相對分子質(zhì)量與標準物質(zhì)已知相對分子質(zhì)量相對照，基本吻合（表2）。

表2 準確度實驗結果Table 2 Results of accuracy tests

2.8 樣品測定

圖4 大豆肽（A）、白蛋白多肽（B）、羊胎盤多肽（C）凝膠過濾色譜圖Fig.4 GFC chromatograms of soy peptide (A), albumin polypeptide (B), and sheep placenta polypeptide (C)

按1.3.3節(jié)色譜條件分別對大豆肽、白蛋白多肽、羊胎盤多肽進樣測定，記錄色譜圖，如圖4所示。采用SHIMADZU GPC數(shù)據(jù)處理軟件分別對以上色譜圖進行處理。各樣品中一些主要色譜峰的保留時間、重均相對分子質(zhì)量（Mw）、數(shù)均相對分子質(zhì)量（Mn）、多分散系數(shù)d（Mw/Mn）的基本情況如表3所示。

表3 大豆肽、白蛋白多肽、羊胎盤多肽相對分子質(zhì)量及其分布的測定結果Table 3 Rel ative molecular weights and distribution of soy peptide, albumin polypeptide and sheep placenta polypeptide

從表3可知，大豆肽、羊胎盤多肽、白蛋白多肽的重均相對分子質(zhì)量都在1 000以下，其中大豆肽的重均相對分子質(zhì)量主要集中在169～935之間、羊胎盤多肽的重均相對分子質(zhì)量主要集中在180～986之間，而白蛋白多肽的重均相對分子質(zhì)量相對較小。

3 討 論

根據(jù)凝膠過濾原理，同一類型化合物的保留時間與組分的相對分子質(zhì)量有關，大分子保留時間短，小分子保留時間長，根據(jù)標準物質(zhì)的保留時間與相對分子質(zhì)量的線性關系便可推算出未知組分的相對分子質(zhì)量。利用此法測定肽類物質(zhì)的相對分子質(zhì)量及其分布具有較高的精密度，而且操作簡單、結果可靠，適用于各種來源多肽的相對分子質(zhì)量及其分布的測定。

蛋白質(zhì)、多肽類產(chǎn)品的分子質(zhì)量具有多分散性，所以其分子質(zhì)量只具有統(tǒng)計平均的意義。用實驗方法測定的相對分子質(zhì)量只是統(tǒng)計平均值，若要確切描述多肽的相對分子質(zhì)量，除了知道統(tǒng)計平均值外，還應明確多肽的相對分子質(zhì)量分布。數(shù)均相對分子質(zhì)量（Mn）是根據(jù)樣品中不同相對分子質(zhì)量分子的數(shù)目統(tǒng)計的平均相對分子質(zhì)量；重均相對分子質(zhì)量（Mw）是根據(jù)樣品中不同相對分子質(zhì)量分子的質(zhì)量統(tǒng)計的平均相對分子質(zhì)量；多分散系數(shù)d為重均相對分子質(zhì)量與數(shù)均相對分子質(zhì)量的比值，用以表征樣品分子質(zhì)量的分散程度。d值越大，說明分子質(zhì)量越分散，d值為1時，說明分子質(zhì)量呈單分散[20]。在采用酶法水解蛋白質(zhì)制備多肽的過程中，水解過度會產(chǎn)生苦味肽和大量氨基酸，水解不全將得不到理想的多肽。有報道[24]稱雞肉在酶解過程中，其呈味成分會隨著水解程度的改變而改變。此外，水解度與酶解產(chǎn)物的乳化性、起泡性、溶解性、穩(wěn)定性等也具有一定的關系[25-26]。因此，在水解過程中必須嚴格控制蛋白質(zhì)的水解度。多肽的相對分子質(zhì)量分布與蛋白質(zhì)水解度密切相關，可直接客觀地反映出水解程度。采用凝膠過濾色譜法測定多肽的相對分子質(zhì)量分布，對多肽的生產(chǎn)制備和質(zhì)量控制都具有重要的指導意義。

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Determination of Relat ive Molecular Weight Distribution of Polypeptides from Three Different Sources by Gel Filtration Chromatography

JIANG Teng-chuan1, SONG Xin-bo1,2,*, ZHANG Li-juan1
(1. Graduate School, Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China; 2. Tianjin Zhongyi Pharmace u tical Co. Ltd., Tianjin 300193, China)

Objective: To establish a method to determine the relative molecular weight distribution of soy peptide, albumin polypeptide and sheep placenta polypeptide using gel fi ltration chromatography (GFC). Methods: TSK-GEL G2000SWXL (300 mm × 7.8 mm, 5 μm) column was equilibrated with a mobile phase composed of acetonitrile-water-trifl uoroacetic acid (15:85:0.07, V/V) at a fl ow rate of 0.6 mL/min. The column temperature was 30 ℃ and the injection volume was 10 μL. The detection wavelength was 220 nm. Results: A linear relationship between the logarithm of relative molecular weight and retention time was achieved in the relative molecular weight range of 189.1–12 355 with a correlation coeffi cient of 0.995 6. The precision, repeatability, stability and accuracy of the GFC method were good. Conclusion: This method is simple, rapid, sensitive, and reproducible for the determination of the relative molecular weight distribution of polypeptides.

gel fi ltration chromatography; soybean; albumin; sheep placenta; polypeptides; relative molecular weight

O657.7

A

1002-6630（2014）24-0312-04

10.7506/spkx1002-6630-201424060

2012-11-20

蔣騰川（1989—），女，碩士研究生，主要從事中藥研究與開發(fā)。E-mail：jiangtengchuan@163.com

*通信作者：宋新波（1964—），男，研究員，學士，主要從事中藥研究與開發(fā)。E-mail：songxinbo@tjutcm.edu.cn