劉海霞，劉 剛，張曉喻,*，朱明君，彭 彤，王戰(zhàn)國(guó)

（1.四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610101；2.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610064）

栘[木衣]屬植物多酚的含量測(cè)定與比較

劉海霞1，劉 剛1，張曉喻1,*，朱明君1，彭 彤2，王戰(zhàn)國(guó)2

（1.四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610101；2.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610064）

以根皮苷為標(biāo)樣，研究Folin-Ciocalteu（FC）比色法測(cè)定栘[木衣]屬3 個(gè)種的多酚含量適宜條件，進(jìn)一步用此改良法測(cè)定和比較多酚含量在栘[木衣]屬的3 個(gè)種的葉以及在長(zhǎng)爪栘[木衣]的不同器官中的差異性。結(jié)果表明，F(xiàn)C比色法最佳測(cè)定條件為：加質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的Na2CO3溶液2.5 mL和FC顯色劑0.5 mL，在55℃條件下反應(yīng)7 min。在1.252～15.024 μg/mL范圍內(nèi)，根皮苷的吸光度與其質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系（R2=0.999 1），平均 加樣回收率為（100.08±2.43）%；測(cè)定結(jié)果還表明，3 個(gè)物種的葉片多酚含量的差異顯著，云南栘[木衣]最低12.55 g/100 g，長(zhǎng)爪栘[木衣]最高25.35 g/100 g；長(zhǎng)爪栘[木衣]的不同器官均含有多酚類化合物，含量差異顯著（3.75～25.35 g/100 g）（P＜0.05），由低到高為：果核＜根＜果肉＜根皮＜果皮＜莖＜葉。結(jié)論：改良后的FC比色法，用于測(cè)定栘[木衣]的多酚含量，具有快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好的特點(diǎn)。栘[木衣]屬植物的多酚含量較高，且多酚含量有明顯的種間差異性及部位的差異性，栘[木衣]屬的植物具有較大的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用價(jià)值。

栘[木衣]；多酚；Folin-Ciocalteu法；改良；測(cè)定

栘[木衣]是薔薇科栘[木衣]屬植物的通稱，有3 個(gè)種：云南栘[木衣]（Docynia delavayi (Franch.) Schneid）、栘[木衣]（Docynia i ndica (Wall.) Dcne.）[1]和長(zhǎng)爪栘[木衣]（Docynia longiunguis Q.Luo et J.L.Liu）[2]，主要分布于云貴川等地，當(dāng)?shù)胤Q為野蘋果、野山楂，常用作健胃消食、行氣散瘀的食用果實(shí)[3-4]。研究顯示，栘[木衣]果實(shí)中富含生物堿、皂苷、糖、黃酮、強(qiáng)心苷、多酚等生物活性物質(zhì)，有保健美容等功能[5]。栘[木衣]果實(shí)有舒經(jīng)活血、和脾燥濕、舒肝止痛、清署消毒、降血糖及降血脂等功效[6]。栘[木衣]的莖皮、葉酸澀、涼，可藥食兩用，樹(shù)皮熬膏直接入藥，可治大面積燒燙傷；鮮樹(shù)皮和葉搗爛外敷可治骨折，還具有消炎、收斂等藥用功效[7-9]；栘[木衣]提取物具有抗氧化的作用，加入煙絲中可降低香煙對(duì)人體的危害[10-11]。

植物多酚是一類多羥基的化合物，存在于植物的葉、根、莖和果肉，是植物中含量?jī)H次于纖維素和木質(zhì)素的最重要次生代謝產(chǎn)物，其具有抗腫瘤、抗氧化、抗過(guò)敏、抑菌、防曬、美白、防治心腦血管疾病等多種生理功能[12-14]。目前，對(duì)栘[木衣]的研究開(kāi)發(fā)還處于初級(jí)階段，長(zhǎng)爪栘[木衣]是近年發(fā)現(xiàn)的新種，因此關(guān)于栘[木衣]屬3 個(gè)種植物的基礎(chǔ)性研究還很不足，對(duì)種屬所含的有效成分的研究較少，其中對(duì)栘[木衣]多酚的研究也比較少，開(kāi)發(fā)更少，尚未見(jiàn)關(guān)于栘[木衣]多酚含量的研究報(bào)道。植物多酚的測(cè)定方法有很多種[15-17]，最常用的是沒(méi)食子酸為對(duì)照品的Folin-Ciocalteu比色法[18]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)栘[木衣]含有根皮苷，因此本實(shí)驗(yàn)選擇根皮苷為對(duì)照品，對(duì)傳統(tǒng)的Folin-Ciocalteu比色法做了改良，建立一種專屬性強(qiáng)的栘[木衣]多酚的測(cè)定方法，并用此方法測(cè)定3 個(gè)不同種栘[木衣]的葉片多酚含量以及長(zhǎng)爪栘[木衣]的果皮、果肉、果核、根、根皮和莖等器官部位的多酚含量，考察種間含量的差異性及部位的差異性，為栘[木衣]資源的綜合利用和開(kāi)發(fā)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

云南栘[木衣]的葉，2013年9月采于云南省普洱市；栘[木衣]的葉和長(zhǎng)爪栘[木衣]的葉、果實(shí)、根和莖，2013年9月采于四川省西昌市，各樣品經(jīng)西昌學(xué)院羅強(qiáng)教授鑒定，符合各物種的特征。

Folin-Ciocaileus試劑（FC試劑） 上海如吉生物科技有限公司；根皮苷標(biāo)準(zhǔn)品（HPLC測(cè)定＞98%）四川省成都市植標(biāo)化純有限公司；乙醇、無(wú)水Na2CO3等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1700紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；Wizard 2.0真空冷凍干燥箱 美國(guó)VirTis公司；B-260恒溫水浴鍋 上海亞榮生化儀器廠；KQ5200DE超聲波清洗儀昆山超聲儀器有限公司；BP211D電子天平 德國(guó)賽多利斯公司。

1.3 方法

1.3.1 儲(chǔ)備液與樣品提取液的制備

根皮苷儲(chǔ)備液：精確稱取25.04 mg根皮苷標(biāo)準(zhǔn)品，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶解后定容至50 mL，即得到質(zhì)量濃度500.8 ?g/mL的儲(chǔ)備液。

樣品處理：分別取3 種栘[木衣]的葉片以及長(zhǎng)爪栘[木衣]的莖、根和根皮，清水清洗，60℃烘干，研磨，備用。將長(zhǎng)爪栘[木衣]果實(shí)的果皮、果肉和果核分開(kāi)，冷凍干燥后，研磨，備用。

制備栘[木衣]多酚的提取液：稱取1.00 g預(yù)處理的樣品粉末，加20 mL體積分?jǐn)?shù)70%乙醇，室溫、200 W、40 KHz超聲提取30 min、過(guò)濾。提取3 次，合并濾液。濾液濃縮，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇定容至25 mL，得樣品的提取液。

1.3.2 選擇Folin-Ciocalteu比色法的測(cè)定條件

1.3.2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選取

分別準(zhǔn)確移取根皮苷儲(chǔ)備液、云南栘[木衣]葉片提取液各0.5 mL，均加入7.5 mL蒸餾水、0.5 mL FC試劑，搖勻后靜置1 min，分別再加入1.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)20% Na2CO3溶液，搖勻，75℃保溫10 min，迅速冷卻至室溫，以體積分?jǐn)?shù)70%乙醇0.5 mL為空白，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在200～800 nm波長(zhǎng)范圍進(jìn)行顯色前、后的掃描，確定最佳測(cè)定波長(zhǎng)。

1.3.2.2 確定反應(yīng)的溫度

準(zhǔn)確移取0.5 mL根皮苷儲(chǔ)備液于各比色管，加7.5 mL蒸餾水、0.5 mL FC試劑，搖勻后靜置1 min，再加1.5 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)20% Na2CO3溶液，搖勻，分別在25、35、45、55、65、75℃和85℃水浴保溫10 min，迅速冷卻至室溫，在760 nm波長(zhǎng)處測(cè)得吸光度，考察反應(yīng)溫度對(duì)顯色效果的影響，確定最佳反應(yīng)溫度。每個(gè)處理重復(fù)3 次。

1.3.2.3 確定反應(yīng)的時(shí)間

準(zhǔn)確移取0.5 mL根皮苷儲(chǔ)備液于各比色管，加7.5 mL蒸餾水、0.5 mL FC試劑，搖勻后靜置1 min，加1.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)20% Na2CO3溶液，搖勻，在55℃水浴分別保溫3、5、7、10、15、20 min和25 min，迅速冷至室溫，在760 nm波長(zhǎng)處測(cè)得吸光度，每個(gè)處理重復(fù)3 次，考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)顯色效果的影響，確定最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.3.2.4 確定顯色體系中Na2CO3的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

準(zhǔn)確移取0.5 mL根皮苷儲(chǔ)備液于各比色管，加7.5 mL蒸餾水、0.5 mL FC試劑，搖勻后靜置1 min，分別加質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%、10%、15%、20% Na2CO3溶液各1.5 mL，搖勻后55℃保溫7 min，迅速冷卻至室溫，在760 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，確定最佳Na2CO3溶液濃度。每個(gè)處理重復(fù)3 次。

1.3.2.5 確定顯色體系中各試劑的用量

最佳Na2CO3溶液用量：準(zhǔn)確移取0.5 mL根皮苷儲(chǔ)備液于各比色管，分別加8.5、8.0、7.5、7.0、6.5、6.0、5.5 mL蒸餾水，均加入0.5 mL的FC試劑，搖勻靜置1 min，對(duì)應(yīng)加0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% Na2CO3溶液，混勻后55℃保溫7 min，迅速冷卻至室溫，在760 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，分析Na2CO3溶液用量對(duì)比色測(cè)定的影響，確定FC試劑與Na2CO3溶液的最佳比例。每個(gè)處理重復(fù)3次。

FC試劑用量：準(zhǔn)確移取0.5 mL根皮苷儲(chǔ)備液于各比色管，分別加8.25、6.5、5.75、3.5 mL蒸餾水，分別加0.25、0.5、0.75、1.0 mL FC試劑，混勻后，按照FC試劑-Na2CO3溶液（1∶5，V/V），再加相應(yīng)體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% Na2CO3溶液，混勻后55℃保溫7 min，迅速冷卻至室溫，在760 nm波長(zhǎng)處測(cè)得吸光度，確定FC試劑的用量。每個(gè)處理重復(fù)3 次。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別準(zhǔn)確移取根皮苷儲(chǔ)備液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于7支10 mL容量瓶，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇定容，得不同質(zhì)量濃度根皮苷的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取0.5 mL不同質(zhì)量濃度根皮苷標(biāo)準(zhǔn)液，加6.5 mL蒸餾水0.5 mL FC試劑，搖勻后靜置1 min，再加2.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% Na2CO3溶液，搖勻，55℃保溫7 min，迅速冷卻至室溫，在760 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以根皮苷質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合，得根皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 FC法測(cè)定栘[木衣]多酚的方法學(xué)評(píng)價(jià)

精密度：分別準(zhǔn)確移取根皮苷低、中、高質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液各0.5 mL，按1.3.3節(jié)方法處理后測(cè)定吸光度，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），對(duì)該分析方法的精密度進(jìn)行評(píng)價(jià)。

重復(fù)性：準(zhǔn)確稱取1.00 g云南栘[木衣]葉的粉末6 份，按1.3.1節(jié)方法進(jìn)行樣品前處理，在1.3.3節(jié)條件下測(cè)定吸光度，計(jì)算多酚含量及結(jié)果的RSD，對(duì)該分析方法的重復(fù)性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

穩(wěn)定性：準(zhǔn)確移取云南栘[木衣]葉提取液0.5 mL，按1.3.3節(jié)的方法處理。分別測(cè)定樣品液反應(yīng)后0、1、2、3、4、5、6、7 h后的吸光度，計(jì)算RSD，分析該測(cè)定方法在一定時(shí)間內(nèi)的穩(wěn)定性。

加標(biāo)回收率：準(zhǔn)確稱取6份云南栘[木衣]葉的粉末樣品，各0.5 mg，置10 mL容量瓶，再分別精密加入根皮苷標(biāo)準(zhǔn)溶液（30.05 ?g/mL）1、2 mL各3 份，按1.3.1節(jié)方法提取，按1.3.3節(jié)條件處理后，測(cè)定吸光度，計(jì)算多酚含量，以總檢出量減去樣液含量再除以加標(biāo)量計(jì)算回收率，再計(jì)算RSD。

1.3.5 樣品中多酚含量的測(cè)定

準(zhǔn)確移取按1.3.1節(jié)方法制備的各樣品溶液0.5 mL，分別加6.5 mL蒸餾水和0.5 mL FC試劑，搖勻后靜置1 min，再加2.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% Na2CO3溶液，混勻后55℃保溫7 min，迅速冷至室溫，在760 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。將吸光度帶入回歸方程，計(jì)算多酚質(zhì)量濃度，根據(jù)下列公式計(jì)算樣品的總多酚含量。

式中：ρ為樣液中多酚質(zhì)量濃度/（μg/mL）；V為樣液的體積/mL；m為葉子質(zhì)量/g；n為稀釋倍數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件處理，組間比較用方差分析，多重比較用最小顯著差數(shù)（least significant difference，LSD）法。

2 結(jié)果與分析

2.1 選擇FC比色法的測(cè)定條件

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選取

對(duì)根皮苷溶液、云南栘[木衣]葉的提取液，分別進(jìn)行顯色前、后的全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果見(jiàn)圖1、2。

圖1 根皮苷（A）、云南栘[木衣]葉提取液（B）顯色前后的光譜比較Fig.1 Spectra of phlorizin standard (A) and leaf extract from Docynia Dcne. (B) before and after colorization

從圖1可以看出：根皮苷標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液，顯色前均在295 nm波長(zhǎng)處有最大吸光度，顯色后，最大吸收波長(zhǎng)范圍為740～765 nm，并基本位于波長(zhǎng)760 nm處，所以，選擇760 nm為比色波長(zhǎng)。

2.1.2 反應(yīng)溫度的確定

多酚物質(zhì)與FC試劑反應(yīng)需要一定的溫度，過(guò)高或過(guò)低的溫度都不利于反應(yīng)的進(jìn)行。不同溫度條件下測(cè)定吸光度，見(jiàn)圖2。

圖2 反應(yīng)溫度變化對(duì)吸光度的影響Fig.2 Effect of reaction temperature on polyphenols determination

從圖2可知，反應(yīng)溫度為25～55 ℃范圍時(shí)，吸光度緩慢上升，統(tǒng)計(jì)分析表明，各溫度間的吸光度有顯著差異（P＜0.05）。溫度超過(guò)55 ℃后，吸光度開(kāi)始明顯下降，這可能是因?yàn)樵?5 ℃后，隨反應(yīng)溫度的升高，堿性條件中根皮苷與酚試劑生成的藍(lán)色絡(luò)合物的性質(zhì)變得不穩(wěn)定而被分解的原因。因此，測(cè)定溫度條件選擇55 ℃。

2.1.3 反應(yīng)時(shí)間的確定

圖3 反應(yīng)時(shí)間變化對(duì)吸光度的影響Fig.3 Effect of reaction time on the determination of polyphenols

由圖3可知，反應(yīng)時(shí)間對(duì)吸光度影響比較大，在

3～7 min內(nèi)，隨時(shí)間延長(zhǎng)吸光度逐漸增大，10 min時(shí)吸光度開(kāi)始降低，在10～25 min隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)吸光度顯著降低，這可能是加熱時(shí)間長(zhǎng)導(dǎo)致根皮苷與酚試劑在堿性環(huán)境中所生成的絡(luò)合物變得不穩(wěn)定。因此，選擇反應(yīng)加熱時(shí)間為7 min。

2.1.4 顯色體系中Na2CO3質(zhì)量分?jǐn)?shù)的確定

圖4 Na 4 Na2COCO3質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化對(duì)吸光度的影響Fig.4 Effect of sodium carbonate concentration on the determination of polyphenols

Na2CO3為FC比色法測(cè)定多酚反應(yīng)提供堿性環(huán)境，F(xiàn)C試劑與多酚在堿性環(huán)境中生成藍(lán)色絡(luò)合物。由圖4可知，當(dāng)Na2CO3質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%時(shí)，在760 nm波長(zhǎng)處的吸光度最大，之后隨著Na2CO3質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大吸光度開(kāi)始降低。分析原因，可能是反應(yīng)體系中堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大抑制了絡(luò)合物的形成。因此，選擇Na2CO3溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%。2.1.5 顯色體系中各試劑用量的確定

改變FC試劑與質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% Na2CO3的比例，用以確定根皮苷與FC試劑反應(yīng)所需堿環(huán)境的強(qiáng)弱，即FC試劑與Na2CO3的最佳比例，見(jiàn)圖5。

圖5 試劑用量變化對(duì)吸光度的影響Fig.5 Effect of reagent dosage on the determination of polyphenols

從圖5可看出，當(dāng)FC試劑加入量不變時(shí)，Na2CO3由0.5～1.0 mL，吸光度明顯增大，之后，隨著Na2CO3量的增大，吸光度呈緩慢上升的趨勢(shì)，當(dāng)Na2CO3加入量達(dá)到2.5 mL，即V（FC試劑）∶V（10% Na2CO3）=1∶5時(shí)，吸光度最大，之后，趨于平穩(wěn)。綜合考慮，選擇最佳10% Na2CO3加入量為2.5 mL，F(xiàn)C試劑與質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% Na2CO3最佳體積比為1∶5。

變化顯色體系中酚試劑的用量，同時(shí)按1∶5比例變化Na2CO3用量時(shí)，當(dāng)FC試劑加入體積0.75 mL，10% Na2CO3加入體積3.75 mL時(shí)，顯色體系中有白色沉淀出現(xiàn)，隨著FC試劑加入量的增大，沉淀隨之增多，這可能是因?yàn)轱@色體系中Na2CO3過(guò)量，多余的Na2CO3與其他物質(zhì)發(fā)生了反應(yīng)。因此，選擇加入FC試劑的量為0.5 mL比較合適。

2.2 根皮苷溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)上述優(yōu)化的測(cè)定條件，制作根皮苷溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程：y=0.067 3x+0.038 9、R2=0.999 1，表明當(dāng)根皮苷質(zhì)量濃度在1.252～15.024 ?g/mL范圍時(shí)，質(zhì)量濃度與其對(duì)應(yīng)吸光度呈良好的線性關(guān)系，可以用于總多酚含量的測(cè)定。

2.3 FC比色法測(cè)定栘[木衣]多酚的方法學(xué)評(píng)價(jià)

表1 精密度實(shí)驗(yàn)的結(jié)果Table 1 Results of precision experiments

分別用不同的樣品對(duì)測(cè)定方法的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、加標(biāo)回收率進(jìn)行考察。以根皮苷標(biāo)準(zhǔn)溶液為測(cè)定樣品，對(duì)測(cè)定方法進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可以看出，用根皮苷標(biāo)準(zhǔn)溶液的低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度，分別重復(fù)測(cè)定6 次，測(cè)定值的RSD分別為0.236%、0.053%、0.067%，表明該測(cè)定方法的精密度良好。

以云南栘[木衣]預(yù)處理樣品為測(cè)定樣品，對(duì)測(cè)定方法進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。可以看出，重復(fù)測(cè)定的云南栘[木衣]預(yù)處理樣品，平均值為13.45 g/100 g，測(cè)定值的RSD為1.63%，表明該方法的重復(fù)性良好。

表2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)Table 2 Results of repeatability experiments

以云南栘[木衣]預(yù)處理樣品為測(cè)定樣品，對(duì)該測(cè)定方法進(jìn)行穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3?？梢钥闯?，待測(cè)云南栘[木衣]預(yù)處理樣品溶液，在反應(yīng)結(jié)束后7 h內(nèi)，RSD為0.30%。在前60 min內(nèi)，該方法測(cè)得的吸光度基本保持不變（RSD為0.04%），表明該方法的穩(wěn)定性良好。

表3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)Table 3 Results of stability experiments

以云南栘[木衣]預(yù)處理樣品為測(cè)定樣品，加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4?？梢钥闯?，6 次加標(biāo)的平均回收百分率為100.08%，RSD為2.43%，表明該方法準(zhǔn)確可靠，可用于栘[木衣]中多酚含量的測(cè)定。

表4 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)Table 4 Results of recovery experiments with spiked samples

2.4 測(cè)定和比較植物中多酚的含量

2.4.1 3 種栘[木衣]及蘋果的多酚含量的測(cè)定與比較

對(duì)栘[木衣]屬中的3 個(gè)種及同科的蘋果，分別測(cè)定葉所含多酚的量，結(jié)果見(jiàn)表5。

表 55 栘[木衣]屬不同種及蘋果的葉中多酚含量比較Table 5 Polyphenol contents in leaves of different species of Doccyynniiaa Dcne. and apple

由表5可知，栘[木衣]屬植物均富含多酚類物質(zhì)，3 個(gè)種的葉中多酚含量均在10 g/100 g以上，按干質(zhì)量計(jì)，長(zhǎng)爪栘[木衣]葉中多酚含量最高（25.35 g/100 g），栘[木衣]葉中多酚含量次之（17.87 g/100 g），云南栘[木衣]葉中多酚含量最少（12.55 g/100 g）。統(tǒng)計(jì)分析表明，3 個(gè)種的植物葉中多酚含量存在極顯著的差異性（P＜0.01），長(zhǎng)爪栘[木衣]的多酚含量是云南栘[木衣]的2 倍。

趙艷敏等[19]的研究發(fā)現(xiàn)，同屬薔薇科的蘋果，其葉中也含根皮苷。所以，本實(shí)驗(yàn)同時(shí)用優(yōu)化測(cè)定方法對(duì)蘋果葉的多酚進(jìn)行測(cè)定，得到其多酚含量為（6.80±0.45）g/100 g。與栘[木衣]屬植物比較，3 種栘[木衣]葉的多酚含量均遠(yuǎn)高于蘋果葉中多酚的含量，含量最低的云南栘[木衣]是其2 倍，含量高的長(zhǎng)爪栘[木衣]是其4 倍。

2.4.2 長(zhǎng)爪栘[木衣]不同器官多酚含量的測(cè)定與比較

在3 種栘[木衣]的葉中，長(zhǎng)爪栘[木衣]的多酚含量最高，因此，進(jìn)一步對(duì)長(zhǎng)爪栘[木衣]各器官的多酚含量進(jìn)行測(cè)定與比較，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 長(zhǎng)爪栘[木衣]不同器官多酚含量比較Table 6 Polyphenol contents in different organs of Docynia longiungui

由表6可以看出，長(zhǎng)爪栘[木衣]各器官均含有多酚，多酚的含量由低到高依次為，果核、根、果肉、根皮、果皮、莖、葉。多酚含量最高的是葉，為（25.35±2.42）g/100 g，次之的是莖，為（10.60±1.01）g/100 g，果皮為（8.57±0.45）g/100 g，根皮為（7.70±0.14）g/100 g；果核、根和果肉中的含量較低。

統(tǒng)計(jì)分析表明：長(zhǎng)爪栘[木衣]各器官中，葉中多酚含量遠(yuǎn)高于其他器官；莖、果皮、根皮、果肉中多酚含量的差異性極顯著（P＜0.01）；果核與根間的差異性不顯著（P＞0.05），長(zhǎng)爪栘[木衣]各器官多酚含量的高低順序是：葉＞莖＞果≈根。同一器官中，不同部位的含量也有明顯差異，果皮的多酚含量高于果肉的，果肉的又高于果核的；根皮的含量高于根的。因此，栘[木衣]多酚的分布在各器官、同一器官的不同部位均有顯著的差異性。

3 討 論

目前用于測(cè)定植物多酚含量的傳統(tǒng)FC比色法，是以沒(méi)食子酸為對(duì)照品，沒(méi)有考慮樣品中是否含有沒(méi)食子酸，或沒(méi)食子酸是否是特征性化合物，因此，在測(cè)定不同樣品多酚含量時(shí)有一定的缺陷。根據(jù)課題組前期研究結(jié)果[20]，可知栘[木衣]中含有根皮苷，所以選擇其為標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)于該樣品的多酚測(cè)定具有很強(qiáng)的專屬性。由于對(duì)照品的改變，對(duì)傳統(tǒng)FC比色法的條件進(jìn)行優(yōu)化，并進(jìn)行方法學(xué)的考察。結(jié)果表明，優(yōu)化的FC比色法具有快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、穩(wěn)定和高靈敏的特點(diǎn)，可快速測(cè)定栘[木衣]中多酚的含量，可否用于其他含根皮苷植物的多酚含量測(cè)定，有待進(jìn)一步的研究。

對(duì)栘[木衣]屬3 個(gè)物種的多酚含量進(jìn)行測(cè)定和比較，結(jié)果表明，栘[木衣]屬植物富含多酚，其葉的多酚含量高達(dá)10 g/100 g以上，明顯比其他植物的高[21-22]。栘[木衣]屬的植物間多酚的含量差異性極顯著，這很可能是由于栘[木衣]屬種間遺傳基因及土壤、氣候等環(huán)境因子的差異性導(dǎo)致的[23]。對(duì)長(zhǎng)爪栘[木衣]的不同部位，其多酚含量差異性顯著，此與對(duì)石榴[24]、丹參[25]等植物中特征性物質(zhì)的差異性研究，結(jié)論相似。測(cè)定和比較栘[木衣]屬3 個(gè)物種的多酚含量，對(duì)合理利用和綜合開(kāi)發(fā)此植物提供了有力的理論依據(jù)。

栘[木衣]屬3 個(gè)種為常綠或半常綠喬木，抗逆性強(qiáng)，可在貧瘠的土壤生長(zhǎng)，是兼具觀賞價(jià)值和藥食價(jià)值的植物資源[26-28]。栘[木衣]的資源豐富，目前，云南栘[木衣]在云南普洱市作為野生果樹(shù)進(jìn)行栽培和利用，但僅限于鮮果銷售及果實(shí)的初加工，其他兩種栘[木衣]還處于野生狀態(tài)，未進(jìn)行開(kāi)發(fā)。栘[木衣]果實(shí)具有良好的保健功能，這可能與其富含多酚物質(zhì)有關(guān)。研究結(jié)果已知，栘[木衣]葉、莖的多酚含量遠(yuǎn)高于果實(shí)，因此，栘[木衣]葉是潛在的多酚資源，其葉片一年四季均可采集，資源量大，可用于提取多酚類物質(zhì)，開(kāi)發(fā)抗氧化、抑菌等的功能食品[29-30]。

本實(shí)驗(yàn)確立了栘[木衣]多酚的測(cè)定方法，比較了栘[木衣]屬植物的多酚含量，本研究有助于對(duì)該屬植物系統(tǒng)、合理、全面的開(kāi)發(fā)利用，同時(shí)也拓寬了提取多酚類物質(zhì)的資源植物。

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Determination of Polyphenol Contents in Docynia Dcne.

LIU Hai-xia1, LIU Gang1, ZHANG Xiao-yu1,*, ZHU Ming-jun1, PENG Tong2, WANG Zhan-guo2
(1. College of Life Science, Sichuan Normal University, Chengdu 610101, China; 2. College of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu 610064, China)

Using phlorizin as reference substance, Folin-Ciocalteu colorimetric assay for polyphenols extracted from Docynia Dcne. was systematically investigated for developi ng an optimal colorimetric method. The contents of polyphenols in three species of Docynia Dcne. were determined and compared as well as in different parts of Docynia longiunguis. The optimum colorimetric conditions were determined as follows: 0.5 mL of FC reagent and 2.5 mL of 10% Na2CO3, 7 min of reaction time, and 55 ℃ of reac tion temperature. The absorbance of phlorizin was in good linear relationship with concentration in the range of 1.252–15.024 ?g/mL, R2= 0.999 1, and the average recovery for the analysis of spiked samples was 100.08%, with RSD of 2.43%. The contents of polyphenols in leaves of three species were significantly different, with the lowest and highest levels detected in Docynia delavayi (12.55 g/ 100 g) and Docynia longiunguis (25.35 g/100 g), respectively. Moreover, there was a significant difference in polyphenol contents among different organs of Docynia longiunguis, which showed the increasing order: pyrene < root < pulp < root bark < peel < stem < leaf. Conclusion: The established method was simple, stable, accurate, and suitable for the analysis of polyphenols and quality control of Docynia Dcne.. Docynia Dcne. is widespread and abundant with polyphenols, but there is a significant difference among species and organs. Accordingly, the plants of this genus have a high value for development and application.

Docynia Dcne.; polyphenol; Folin-Ciocalteu; improved method; determination

Q946；Q949.91

A

1002-6630（2014）24-0295-06

10.7506/spkx1002-6630-201424057

2014-06-13

四川師范大學(xué)校級(jí)重點(diǎn)培育項(xiàng)目（13ZDL11）；四川師范大學(xué)大精設(shè)備基金項(xiàng)目（DJ2013-02；DJ2014-13）；四川師范大學(xué)“土壤污染原位修復(fù)與綠色食品藥品開(kāi)發(fā)”創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目；攀枝花市科技局社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目（2014CY-S-8）；四川省教育廳科研基金項(xiàng)目（14ZA0025）

劉海霞（1990—），女，碩士研究生，主要從事植物資源的應(yīng)用研究。E-mail：qingtianwawa55@126.com

*通信作者：張曉喻（1973—），女，副教授，博士，主要從事植物資源應(yīng)用與開(kāi)發(fā)研究。E-mail：zhangxy2005@126.com