宋 君，郭靈安*，雷紹榮，王 東，尹 全，張富麗，劉文娟，常麗娟

（四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，四川 成都 610066）

實時熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)基因玉米59122的方法建立及測量不確定度評估

宋 君，郭靈安*，雷紹榮，王 東，尹 全，張富麗，劉文娟，常麗娟

（四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，四川 成都 610066）

為了準(zhǔn)確定量檢測非故意擴散的轉(zhuǎn)基因玉米59122，建立轉(zhuǎn)基因玉米59122及產(chǎn)品的實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測方法，并用特異性、準(zhǔn)確度、靈敏度以及測量不確定度等指標(biāo)評價該方法。結(jié)果顯示，利用該方法只能檢出轉(zhuǎn)基因玉米59122；16 次重復(fù)測量含量為1%的轉(zhuǎn)基因玉米59122樣品，平均測量值（0.9%）接近真實值（1%），相對誤差為10%，測試回收率為90%，測量不確定度為0.002；能檢測到最低含量為2拷貝的59122分子片段；除去3 次偏離平均值較大的測量值外，13 次重復(fù)測量值的變異系數(shù)為0.05。因此，實驗建立的轉(zhuǎn)基因玉米59122實時熒光定量PCR方法具有較高的特異性、準(zhǔn)確度、靈敏度、精密度，較低的測量不確定度。

轉(zhuǎn)基因玉米59122；定量檢測方法；方法學(xué)評價

轉(zhuǎn)基因玉米59122（OECD Unique Identifier，DAS-59122-7）是先鋒高技術(shù)育種國際公司（Pioneer Hi-Bred International Inc.）和陶氏益農(nóng)公司（Dow AgroSciences LLC）將遺傳修飾的新型抗蟲基因cry34Ab1、cry35Ab1以及抗除草劑的標(biāo)記基因pat，通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化入受體玉米株系（Hi-Ⅱ）的抗蟲、耐除草劑玉米。2004年轉(zhuǎn)基因玉米DAS-59122-7最早在美國、墨西哥被批準(zhǔn)用于食用或飼料原材料，2005年在美國被批準(zhǔn)環(huán)境釋放；同年這種轉(zhuǎn)基因玉米在加拿大獲得環(huán)境釋放和食用或飼料應(yīng)用；日本于2006年同時批準(zhǔn)該轉(zhuǎn)基因玉米在本國環(huán)境釋放和食用及飼料加工應(yīng)用；澳大利亞、菲律賓、韓國等國于2005年只批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因玉米59122在本國用于食用及飼料加工。2013年3月，歐盟食品安全局就轉(zhuǎn)基因玉米59122面向市場用于種植、食品飼料加工發(fā)布意見，認(rèn)為轉(zhuǎn)基因玉米59122同普通玉米一樣安全，不會對動物以及人體健康構(gòu)成威脅[1]，但該意見并未明確同意進(jìn)口該轉(zhuǎn)基因玉米。目前，我國已批準(zhǔn)進(jìn)口轉(zhuǎn)基因玉米59122為加工原料，有效期限為2012年12月20日至2015年12月20日。

迄今我國尚無轉(zhuǎn)基因玉米59122的定量檢測標(biāo)準(zhǔn)，為了準(zhǔn)確、定量檢測非故意擴散的轉(zhuǎn)基因玉米59122，保障我國玉米生產(chǎn)安全和降低生態(tài)風(fēng)險，本實驗擬建立一種針對轉(zhuǎn)基因玉米59122轉(zhuǎn)化事件的實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測方法，并對其進(jìn)行了方法學(xué)評價和測量不確定度評估，以期為我國農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

含量為10%的轉(zhuǎn)基因玉米59122標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、含量為1%的轉(zhuǎn)基因玉米59122測試樣品、轉(zhuǎn)基因玉米TC1507、NK603、MON863、MON810、3272非目標(biāo)轉(zhuǎn)化體粉末樣品和轉(zhuǎn)基因大豆、棉花、油菜、甜菜種子粉末樣品 歐盟聯(lián)合研究中心測量與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究所。

植物基因組DNA純化試劑盒、探針型（TaqMan水解探針）實時PCR試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Nanodrop?1000超微量分光光度計 美國Thermo Fisher Scientific公司；7500實時熒光PCR系統(tǒng) 美國Applied Biosystem公司；以上儀器分別用于測試從轉(zhuǎn)基因玉米59122中分離、純化的基因組DNA的質(zhì)量和擴增玉米zSSⅡb內(nèi)源基因以及59122轉(zhuǎn)化事件DNA片段。

1.3 方法

1.3.1 DNA的分離與純化

稱取含量為10%的轉(zhuǎn)基因玉米59122標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和含量為1%的轉(zhuǎn)基因玉米59122粉末各0.1g。按照植物基因組DNA純化試劑盒說明書分離、純化轉(zhuǎn)基因玉米59122基因組DNA。

1.3.2 引物和探針設(shè)計

采用GB 19495.5—2004《轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測：核酸定量PCR檢測方法》中的引物序列[2]，擴增玉米內(nèi)標(biāo)基因zSSⅡb；根據(jù)轉(zhuǎn)基因玉米59122的旁側(cè)序列（http:// www.shgmo.org/welcome.htm），設(shè)計跨越基因表達(dá)調(diào)控元件（CaMV35S）和玉米基因組的特異引物和探針（表1）。

表1 轉(zhuǎn)基因玉米59122定量檢測的引物和探針Table 1 The primers and probes used for the quantitative detection of genetically modified maize 59122

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備和反應(yīng)體系

將含量為10%的轉(zhuǎn)基因玉米59122標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)基因組DNA，按照1∶5稀釋成5個質(zhì)量濃度梯度：100、20、4、0.8、0.16 ng/μL；將含量為1%的轉(zhuǎn)基因玉米59122基因組DNA的質(zhì)量濃度稀釋成50 ng/μL。取上述DNA稀釋液3 μL加入到25 μL反應(yīng)體系：TaqMan Master mix（2×）12.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1μL，探針（10 μmol/L）0.5 μL，補水至25 μL。每個梯度質(zhì)量濃度的DNA稀釋液做3個平行反應(yīng)，測試樣品重復(fù)16 次擴增反應(yīng)。

把配制好的反應(yīng)體系置于7500型熒光定量PCR儀器上，運行如下程序：首先95 ℃預(yù)變性DNA模板，10 min；然后運行45 個熱循環(huán)反應(yīng)：95 ℃變性15 s；59 ℃退火60 s。

1.3.4 方法的特異性、靈敏度和精密度

為了檢驗方法的特異性，除了將本實驗設(shè)計的引物和探針在數(shù)據(jù)庫（EMBL、GenBank、Patent等）中搜索比對外，還用設(shè)計的引物和探針擴增轉(zhuǎn)基因玉米TC1507、NK603、MON863、MON810、3272非目標(biāo)轉(zhuǎn)化體粉末樣品和轉(zhuǎn)基因大豆、棉花、油菜、甜菜種子粉末樣品的DNA，確定方法的特異性。

根據(jù)玉米基因組大?。?×109bp），計算出4 μL含量10%的59122玉米粉末DNA溶液（16.54 ng/μL）含1 224 個拷貝59122轉(zhuǎn)化事件分子片段，然后連續(xù)4 次按照1∶5梯度稀釋，獲得59122分子片段的5 個梯度拷貝數(shù)分別為1 224、245、49、10、2 拷貝，分別以這5 個梯度拷貝數(shù)的DNA為模板進(jìn)行實時擴增以測定方法的靈敏度。

對轉(zhuǎn)基因成分含量為1%的樣品進(jìn)行16 次重復(fù)檢測，然后計算這些測量數(shù)據(jù)的變異系數(shù)和回收率來評估方法的精密度。變異系數(shù)和測量回收率的計算見公式（1）、（2）：

式中：C1為樣品轉(zhuǎn)基因成分測量值的平均值；C2為樣品轉(zhuǎn)基因成分真實值（約定值）。

1.3.5 轉(zhuǎn)基因玉米59122測量不確定度的計算

根據(jù)實驗獲得zSSⅡb（內(nèi)源基因）和59122分子片段（外源基因）的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Ct=K×lgA+B（Ct為定量PCR儀檢測到的超過熒光信號背景閾值的熱循環(huán)數(shù)，A為基因的絕對含量，B為一次函數(shù)的截距），計算出測試樣品中zSSⅡb基因和59122分子片段的絕對含量（A），再根據(jù)公式（3）計算出轉(zhuǎn)基因玉米59122的相對含量[3]。

實驗中微量液體體積轉(zhuǎn)移誤差和標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合數(shù)據(jù)對之間的非線性偏離是轉(zhuǎn)基因成分定量分析中的主要不確定度來源[3-8]。根據(jù)測量不確定度的評定[9-12]，先計算實驗中隨機效應(yīng)產(chǎn)生的A類不確定度（uA），然后計算數(shù)據(jù)對的非線性偏離、微量液體轉(zhuǎn)移誤差引起的B類不確定度（uB），再將A、B兩類不確定度合成為合成不確定度（uc）；最后計算出本實驗的測量不確定度（U）。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的特異性和標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用本實驗設(shè)計的引物和探針分別對轉(zhuǎn)基因玉米59122、TC1507、NK603、MON863、MON810、3272非目標(biāo)轉(zhuǎn)化體粉末樣品和轉(zhuǎn)基因大豆、棉花、油菜、甜菜種子粉末樣品的DNA進(jìn)行擴增（圖1），只有轉(zhuǎn)基因玉米59122的DNA得到擴增，擴增曲線呈典型“S”型曲線，說明設(shè)計的定量分析59122分子片段的引物和探針能夠用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米59122，不能用于其他轉(zhuǎn)基因作物和其他轉(zhuǎn)基因玉米非59122品系檢測，設(shè)計的引物和探針具有很高的特異性。

圖1 轉(zhuǎn)基因玉米59122擴增的特異性Fig.1 The specificity of amplification of genetically modified maize 59122

根據(jù)最小二乘法原理，Applied Biosystem Corporation 7500軟件擬合出標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2和圖3）。轉(zhuǎn)基因玉米59122的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=－3.57X+30.62（圖2），相關(guān)系數(shù)R2為0.983，擴增效率為90.56%；玉米內(nèi)源基因zSSⅡb的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=－3.58X+ 31.10（圖3），相關(guān)系數(shù)R2為0.998，擴增效率為90.37%。實驗結(jié)果顯示本實驗的內(nèi)源（zSSⅡb）、外源（59122分子片段）基因擴增效率高（大于90%），線性關(guān)系好（R2≥98%），說明本實驗設(shè)計的引物和探針擴增效率高，建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的數(shù)據(jù)對間的線性關(guān)系好。

圖2 59122分子片段標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of specific fragment of genetically modified maize 59122

圖3 3 zSSzSSⅡb基因標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of zSSⅡb gene of genetically modified maize 59122

2.2 方法的靈敏度和精密度

用1 224、245、49、10、2 個拷貝的59122分子片段作為模板，實時擴增結(jié)果表明本方法能檢測到2個拷貝的59122分子片段（圖4），本實驗建立的轉(zhuǎn)基因玉米59122定量檢測方法的檢測低限為2拷貝。

圖4 轉(zhuǎn)基因玉米59122檢測方法的靈敏度Fig.4 The sensitivity of the detection method for genetically modified maize 59122

表2 測試樣品（1%）轉(zhuǎn)基因玉米59122定量檢測結(jié)果Table 2 Quantitative detection of the molecular fragment from genetically modified maize 59122 in samples

表3 59122分子片段標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合Table 3 Standard curve fitting for of the molecular fragment from event 599112222

表4 zSS 基因標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合Table 4 Standard curve fitting for zSSS//b gen

2.3 測量不確定度

2.3.1 A類不確定度

根據(jù)貝塞爾公式計算由隨機效應(yīng)導(dǎo)致的A類不確定度，

式中：xi為59122分子片段測量值；x為16 次測量59122分子片段的平均值；n為測量次數(shù)16。

2.3.2 B類不確定度

2.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合中數(shù)據(jù)對非線性的不確定度

（lgA外、Ct外）在標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合中的非線性關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)差，為：

式中：n為標(biāo)準(zhǔn)曲線上數(shù)據(jù)對的總數(shù)；Ct外擬合值、Ct外測量值分別為由已知梯度含量值根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出的Ct（Ct擬合值）和定量PCR儀測量到的Ct（表3）。

測量次數(shù)p為16，最小二乘法引入的不確定度分量為：

式中：s（Ct外）為由標(biāo)準(zhǔn)溶液Ct值殘差（表3）計算的標(biāo)準(zhǔn)差；n為標(biāo)準(zhǔn)曲線上數(shù)據(jù)對總數(shù)；p為測量次數(shù)；為試樣重復(fù)測量p次結(jié)果的平均值；為繪制擬合直線全部（n個）輸入值lgAi的 總平均值。

同理計算lgA內(nèi)的響應(yīng)值Ct內(nèi)對zSSⅡb標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)差：

zSSⅡb標(biāo)準(zhǔn)曲線的不確定度u（Ct內(nèi)）分量為：

2.3.2.2 微量移液器的不確定度

經(jīng)中國測試研究院對本實驗中使用的微量移液器校準(zhǔn)，10～100 μL測量范圍內(nèi)的最大允差為±0.8μL，因為微量移液器造成的不確定度呈均勻分布，所以10～100 μL微量移液器的測量不確定度 u1=0.8/3=0.4619μL，該移液器在本次實驗中的加樣體積為12.5 μL，其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel1=0.461 9/12.5=0.037；0.5～10 μL量程微量移液器的最大允差為±0.12 μL，其測量不確定度u2=0.12/3= 0.069 μL，在本實驗中的加樣體積分別為3、7 μL，故其相對不確定度分別為urel2=0.069/3=0.023、urel3=0.069/7=0.010；0.1～2.5μL的微量移液器最大允差為±0.04 μL，其測量不確定度u3=0.04/3=0.023μL，在本實驗中的加樣體積分別為0.5、1、1μL，故其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel4=0.023/0.5=0.046，urel5=0.023/1=0.023，urel6=0.023/1=0.023。由于3種不同量程的移液器在實驗過程中具獨立性，因此由微量移液器允差帶來的合成不確定度為：

用最大偏差估計不確定度的自由度為無窮大，ν3=ν4=ν5=∞。

2.3.2.3 B類標(biāo)準(zhǔn)不確定度的合成

因為各分量urel外、urel內(nèi)、urel移液器不確定度彼此獨立，靈敏系數(shù)都為1，urel外、urel內(nèi)、urel移液器合成為B類合成不確定度（urelB）。

2.3.3 合成不確定度uc

又因為A類不確定度和B類不確定度彼此獨立，所以

2.3.4 擴展不確定度U

根據(jù)擴展不確定公式，U=k×uc，在置信水準(zhǔn)P等于95%時，有效自由度veff為219的t分布臨界值，按照非整ν內(nèi)插計k為1.96，所以擴展不確定度U為0.002，所以測量結(jié)果C為0.009±0.002。

3 討 論

目前轉(zhuǎn)基因成分含量的分析主要采用熒光定量PCR方法[13-15]，本實驗設(shè)計了擴增轉(zhuǎn)基因玉米59122的引物和探針，用含量為10%轉(zhuǎn)基因玉米59122作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，建立了轉(zhuǎn)基因玉米59122的實時定量PCR檢測方法。引物和探針的高特異性是PCR方法檢驗基因或分子片段的首要要求。本實驗設(shè)計的引物和探針在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對，除了能與轉(zhuǎn)基因玉米59122的外源基因旁側(cè)序列（外源基因插入受體玉米基因組整合位點兩側(cè)的序列）結(jié)合外，沒有發(fā)現(xiàn)別的結(jié)合位點。此外，本實驗還用設(shè)計的引物和探針進(jìn)一步擴增了抗除草劑和抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米其他品系，仍然沒有檢測到59122分子片段，說明本實驗建立的定量分析轉(zhuǎn)基因玉米59122的方法具有很高的特異性。在實際操作中，PCR的擴增效率在90%～110%的范圍內(nèi)，對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的平均值在－3.6～－3.1之間，測試樣品的Ct值在18～30個循環(huán)數(shù)范圍內(nèi)，能夠獲得可靠的測量結(jié)果[4]。R2是反映標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)對相關(guān)性的重要參數(shù)，在基因的定量分析中，一般要求相關(guān)系數(shù)R2大于或等于0.98。本實驗用建立的轉(zhuǎn)基因玉米59122定量PCR檢測方法，制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為－3.57，擴增效率為90.56%，相關(guān)系數(shù)R2為0.983，用該標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的檢測結(jié)果（0.9%）接近樣品中59122含量的真實值（1%）。測量值與真實值的相對誤差（10%）小于25%，而且樣品測試的回收率為90%，充分顯示本方法的檢測結(jié)果具有較高的準(zhǔn)確度。靈敏度是評價一種檢測方法的主要指標(biāo)，在分析化學(xué)中一般是指測定方法能檢測出物質(zhì)的最低量或最低濃度。方法的靈敏度一般用檢測低限來表示，檢測低限越低，檢測方法越靈敏。本實驗建立的方法可以從反應(yīng)體系中檢測到連續(xù)按照1∶5稀釋后的2拷貝59122分子片段，說明本方法具有很高的靈敏度。精密度是用來表征各次測量的數(shù)據(jù)大小彼此接近的程度。測量精密度越高，說明各次測量數(shù)據(jù)比較接近，測量精密度是偶然誤差的反映。通過連續(xù)16 次重復(fù)測量同一樣品，測量值分布在0.7%～1.1%之間，變異系數(shù)為0.1。16 次測量值中有3 次測量值偏離平均值（0.9%）較大，1次測量值為1.1%，2次測量值為0.7%，這可能是由于模板DNA溶液微量轉(zhuǎn)移的誤差被PCR放大的結(jié)果。如果去掉這3次偏離平均值較大的數(shù)據(jù)，13次重復(fù)測量值的變異系數(shù)為0.05，顯示本方法具有較高的靈敏度。測量不確定度是與測量結(jié)果關(guān)聯(lián)的一個參數(shù)，用于表征合理賦予被測量的值的分散性[8]，是評估檢測數(shù)據(jù)質(zhì)量的重要參數(shù)。關(guān)于測量不確定的評估在理化分析文獻(xiàn)中報道較多[16-23]，在轉(zhuǎn)基因生物檢測中測量不確定度評估工作報道相對較少。本實驗按照不確定度評定[24]，分別計算了實驗中隨機效應(yīng)產(chǎn)生的不確定度uA，標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)對的非線性偏離、微量液體轉(zhuǎn)移誤差引起的不確定度uB，在此基礎(chǔ)上合成了各類不確定度，根據(jù)合成不確定度uc算出本實驗的測量不確定度U為0.002，測量值的分布范圍較窄，在0.7%～1.1%之間，說明本法檢測質(zhì)量較高。因此，從方法的特異性、靈敏度、精密度、準(zhǔn)確度以及構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率和相關(guān)系數(shù)等評價指標(biāo)看，本實驗建立的轉(zhuǎn)基因玉米59122實時定量PCR檢測方法是一種精準(zhǔn)檢測技術(shù)，能為我國轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管提供良好的技術(shù)支持。

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An Accurate Quantitative Assay for Genetically Modified Maize Event 59122: Method Establishment and Assessment of Its Measurement Uncertainty

SONG Jun, GUO Ling-an*, LEI Shao-rong, WANG Dong, YIN Quan, ZHANG Fu-li, LIU Wen-juan, CHANG Li-juan
(Institute of Quality Standards and Testing Technology for Agro-Products, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Chengdu 610066, China)

Genetically modified maize (Event 59122) used as a feedstock has been approved to be imported to China since 2012. But, there has so far been no quantitative assay available to detect the genetically modifi ed corn 59122 and its derivatives. In this study we established a quantitative detection method for this modifi ed maize corn using real-time fl uorescent quantitative PCR in order to accurately examine whether it is spread unintentionally, ensure the safety of corn production in China and reduce the ecological risk. Meanwhile, the method was evaluated by several methodological indicators such as specifi city, sensitivity, accuracy and measurement uncertainty. Our experimental results showed that this method was specifi c for modifi ed maize corn 59122. The average of 16 replicate detections for 1% modifi ed maize corn 59122 was 0.9% with a relative deviation of 10%. The recovery was 90%, and the measurement uncertainty was 0.002. The lowest detectable level was 2 copies of DNA fragments from the modifi ed maize crop 59122. The variation coeffi cient for the remaining 13 replications was 0.05 when the 3 replicate detections deviated largely from the average value (0.9%) were removed. Therefore, the quantitative detection method described in this paper for modifi ed maize maize 59122 has fairly high specifi city, accuracy, sensitivity and precision as well as low measurement uncertainty.

genetically modifi ed maize 59122; quantitative detection method; methodological assessment

Q03

A

1002-6630（2014）24-0259-06

10.7506/spkx1002-6630-201424050

2014-03-06

四川省質(zhì)監(jiān)局標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)體系項目（ZYBZ2013-39）

宋君（1973—），男，副研究員，博士，主要從事轉(zhuǎn)基因生物安全研究。E-mail：drsjn@126.com

*通信作者：郭靈安（1962—），男，副研究員，本科，主要從事食品安全研究。E-mail：gla028@163.com