趙國(guó)忠，姚云平，曹小紅，陳 衛(wèi),*

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2.天津科技大學(xué) 教育部食品營(yíng)養(yǎng)與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

2 種米曲霉發(fā)酵醬油風(fēng)味物質(zhì)比較

趙國(guó)忠1，姚云平1，曹小紅2，陳 衛(wèi)1,*

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2.天津科技大學(xué) 教育部食品營(yíng)養(yǎng)與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

為進(jìn)一步比較傳統(tǒng)菌株米曲霉滬釀3.042和前期實(shí)驗(yàn)誘變菌株米曲霉100-8釀造醬油的差異。通過(guò)高效液相色譜、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀比較醬油中有機(jī)酸、氨基酸和風(fēng)味物質(zhì)成分的差異。通過(guò)發(fā)酵終期醬油有機(jī)酸的結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)：米曲霉100-8發(fā)酵 的醬油中蘋果酸含量增加，檸檬酸和琥珀酸含量下降。通過(guò)醬油發(fā)酵在大曲階段和后期階段的氨基酸比較發(fā)現(xiàn)，使用米曲霉100-8菌株發(fā)酵的醬油大曲及其后期發(fā)酵為醬油階段，天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸這3 種氨基酸含量都明顯升高。這些有機(jī)酸和氨基酸含量之間比例的差異性是造成醬油風(fēng)味不同的原因之一。對(duì)風(fēng)味物質(zhì)成分的分析發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照相比，米曲霉100-8發(fā)酵的醬油中醇、醛、酸和吡嗪類物質(zhì)都有所增加，其中風(fēng)味物質(zhì)增多最明顯的是吡嗪類。通過(guò)米曲霉100-8釀造的醬油與傳統(tǒng)米曲霉滬釀3.042比較，其有機(jī)酸、氨基酸和風(fēng)味物質(zhì)都有明顯的不同。

米曲霉；醬油；有機(jī)酸；氨基酸；風(fēng)味物質(zhì)

醬油[1]是一種在亞洲國(guó)家盛行的具有咸味和獨(dú)特風(fēng)味的大豆類傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品。醬油的消費(fèi)市場(chǎng)目前也正在從亞洲國(guó)家走向西方市場(chǎng)，在世界各地廣泛使用，并逐步實(shí)現(xiàn)了醬油的國(guó)際化。醬油幾乎是中國(guó)每家每戶佐餐的必需品，擔(dān)當(dāng)著基礎(chǔ)調(diào)味料的重要角色。中國(guó)每年的醬油產(chǎn)量超過(guò)500萬(wàn) t，占世界總產(chǎn)量的55%以上[2-3]。醬油是由豆粕和麩皮（或大豆和小麥）的混合原料通過(guò)米曲霉制曲發(fā)酵，后期 添加酵母和乳酸菌厭氧發(fā)酵，再用鹽水淋洗而成的。發(fā)酵而成的醬油，經(jīng)過(guò)復(fù)雜的生物化學(xué)作用，具有其獨(dú)特的風(fēng)味，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富。

醬油風(fēng)味的形成是一個(gè)極為復(fù)雜的、有微生物參與的過(guò)程，它的形成需要一些必須的化合物，如游離的氨基酸、水溶性肽及美拉德反應(yīng)產(chǎn)物[4-6]。這些風(fēng)味化合物主要來(lái)源于碳和氮的代謝。隨著功能性食品的發(fā)展，最近幾年人們?cè)絹?lái)越關(guān)注醬油中功能因子的研究，醬油中的許多風(fēng)味化合物即具有很好的功能特性，包括抗氧化[7-9]、抗癌[10]、降壓[11]、抗菌[12]、抗血小板聚集[13]、抗白內(nèi)障[14]和抗過(guò)敏原的功能特性。醬油同樣可以被視為是一種功能性食品。關(guān)于醬油風(fēng)味的研究正是目前研究的重點(diǎn)，而風(fēng)味的形成與發(fā)酵微生物有息息相關(guān)的聯(lián)系。本研究通過(guò)傳統(tǒng)米曲霉滬釀3.042和誘變菌株米曲霉100-8的風(fēng)味物質(zhì)成分的比較分析，為醬油風(fēng)味物質(zhì)成分的形成代謝途徑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆粕和麩皮均為天津市利民調(diào)料有限公司提供。

甲醇、乙酸、乳酸、丙酸、檸檬酸、酒石酸、草酸、蘋果酸、琥珀酸（均為色譜純） 天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20AT高效液相色譜儀、QP2010plus氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津公司；1100高效液相色譜儀 美國(guó)安捷倫公司；固相微萃取 上海市實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 三角瓶種曲

用接種環(huán)挑取3 環(huán)米曲霉孢子于滅菌麩皮（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%水）中，混勻，30 ℃堆積培養(yǎng)。培養(yǎng)大約15 h第1次搖瓶，將培養(yǎng)基平鋪，30 ℃繼續(xù)培養(yǎng)8 h第2次搖瓶，繼續(xù)平鋪培養(yǎng)。變綠后扣瓶培養(yǎng)直至全部變綠。然后將其裝入牛皮紙袋中，50 ℃烘干6 h左右，種曲制成。1.3.2 竹匾大曲

接種質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%的種曲于滅過(guò)菌的大曲培養(yǎng)基（m（豆粕）∶m（麩皮）=6∶4），混勻后堆積培養(yǎng)，濕布蓋好，30 ℃恒溫培養(yǎng)。約15 h后第1次翻曲，30 ℃平鋪培養(yǎng)8 h以后，直到大曲培養(yǎng)基全部變白色，第2次翻曲后繼續(xù)平鋪培養(yǎng)。培養(yǎng)到種曲培養(yǎng)基變?yōu)辄S綠色，大曲即制成。

1.3.3 低鹽固態(tài)發(fā)酵

將大曲按照原料質(zhì)量比1∶1的比例，拌入50 ℃左右鹽度為質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%的鹽水，入缸壓實(shí)，表面鋪上塑料隔絕氧氣，40 ℃發(fā)酵10 d，35 ℃發(fā)酵20 d即可。

1.3.4 有機(jī)酸測(cè)定液相色譜條件

稱取10 g大曲或醬醪裝入100 mL的三角瓶中，加入50 mL蒸餾水，煮沸5 min，過(guò)濾，然后用100 mL容量瓶定容，再用C18萃取小柱過(guò)濾，進(jìn)樣針吸取20 μL樣品進(jìn)樣。

液相色譜柱：HydrospHere C18柱（250 mm× 4.6 mm）；流動(dòng)相：0.02 mol/L KH2PO4；流速0.5 mL/min；進(jìn)樣量20 ?L；紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)215 nm；柱溫30 ℃。

1.3.5 氨基酸測(cè)定液相色譜條件

樣品處理方法同1.3.4節(jié)。液相色譜柱：ODS HYPERSIL柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A相和B相梯度洗脫；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)338、262 nm；柱溫40 ℃。

流動(dòng)相A相：8.0 g結(jié)晶乙酸鈉1 000 mL水溶解，再加入225 μL三乙胺，攪拌并滴加體積分?jǐn)?shù)5%醋酸調(diào)節(jié)pH值為7.2，加5 mL四氫呋喃混合。

流動(dòng)相B相：12.0 g結(jié)晶乙酸鈉400 mL水溶解，滴加體積分?jǐn)?shù)5%醋酸調(diào)節(jié)pH值為7.2，加入800 mL乙腈和800 mL甲醇混合。

1.3.6 固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜條件

固相微萃取技術(shù)可以在一定程度上檢測(cè)出醬油中的可揮發(fā)性物質(zhì)的成分和相對(duì)含量[15]。使用方便，易操作。分別稱5 g大曲和醬醪于頂空瓶中，擰好瓶蓋，于50 ℃水浴中平衡30 min，將固相微萃取針插入頂空瓶中吸附30 min，然后進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜測(cè)定。

氣相色譜條件：色譜柱：VF-5MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 ?m）；升溫程序：起始溫度40 ℃，保持30 min，以4 ℃/min升至150 ℃，保持1 min，以8 ℃/min升到250 ℃，保持6 min；載氣（He）流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量0.5 ?L；分流比5∶1。

質(zhì)譜條件：電子電離源；電子能量70 eV；傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度220 ℃；激活電壓1.5 V；質(zhì)量掃描范圍m/z 43～500。

分析方法：惠普化學(xué)工作站軟件對(duì)照NIST 05庫(kù)進(jìn)行數(shù)據(jù)收集，譜庫(kù)初步鑒定物質(zhì)成分，結(jié)合保留時(shí)間、質(zhì)譜、試劑成分和保留指數(shù)定性。面積歸一化法相對(duì)定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 大曲和醬油中主要有機(jī)酸測(cè)定

表1 醬油中各有機(jī)酸含量Table 1 Contents of organic acids in soy sauce g/100 mL

米曲霉100-8是經(jīng)過(guò)米曲霉3.042菌株誘變而來(lái)的菌株，米曲霉100-8菌株分泌蛋白酶的能力比米曲霉3.042菌株強(qiáng)。2個(gè)菌株發(fā)酵的醬油風(fēng)味也不同。因此，分別對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)間段（24、30、36 h）的醬油發(fā)酵大曲和后期階段的醬油的有機(jī)酸含量進(jìn)行測(cè)定[16]。經(jīng)測(cè)定發(fā)現(xiàn)大曲中的有機(jī)酸含量極微，很難檢測(cè)出來(lái)，醬油中的有機(jī)酸產(chǎn)生比較明顯。依據(jù)有機(jī)酸出峰時(shí)間、峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的方法計(jì)算醬油中各有機(jī)酸含量。結(jié)果如表1所示。

由表1可以看出，發(fā)酵終期米曲霉100-8發(fā)酵的醬油中酒石酸、甲酸、蘋果酸、乳酸和丙酸的含量都增多，而檸檬酸和琥珀酸的含量減少。蘋果酸和檸檬酸在食品中是2 種重要的酸類物質(zhì)。在大多數(shù)水果比如蘋果、桃、菠蘿、甜瓜、西瓜、葡萄和西紅柿中，蘋果酸含量較高，通常與檸檬酸一起組成了水果中的主要酸類物質(zhì)[17]。不同的水果中這2 種酸的比例的不同，也導(dǎo)致了其風(fēng)味口感的不同。琥珀酸作為食品中的添加劑，可以增強(qiáng)食品風(fēng)味[18]。目前未見(jiàn)到在米曲霉中酒石酸的生成途徑，在其他物種比如植物中酒石酸有的是由抗壞血酸經(jīng)過(guò)酶的作用轉(zhuǎn)化生成的，在豆科植物中，酒石酸也可由D-葡萄糖轉(zhuǎn)化生成[19]。檸檬酸、蘋果酸和酒石酸主要是食品中酸味成分的主要來(lái)源，構(gòu)成了食品中的酸性口味[20]。

結(jié)合米曲霉發(fā)酵過(guò)程中的三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA）途徑，蘋果酸、檸檬酸和琥珀酸 的產(chǎn)生主要由TCA循環(huán)途徑產(chǎn)生（圖1）。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[21]也發(fā)現(xiàn)在TCA循環(huán)的上游通路中，烏頭酸梅和異檸檬酸脫氫酶表達(dá)上升了2 倍以上（用圓形表示），其他酶上升也較為明顯（用五角星表示），由于這些酶的表達(dá)升高，促進(jìn)了檸檬酸和琥珀酸的降解，導(dǎo)致這2 種酸的下降，而蘋果酸處于TCA循環(huán)的下游。上游中酶表達(dá)量的增大促進(jìn)了下游蘋果酸合成的增多。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)同樣觀察到丙酮酸脫羧酶的增多，直接促進(jìn)下游循環(huán)草酰乙酸含量的增大，而蘋果酸脫氫酶的表達(dá)下降（用三角形表示）。蘋果酸在草酰乙酸的上游，正是下游草酰乙酸的增多，蘋果酸脫氫酶的降低，上游檸檬酸和琥珀酸的減少這兩方面的雙重作用使得蘋果酸含量增多。米曲霉100-8糖酵解途徑中丙酮酸的產(chǎn)生增加，當(dāng)加入鹽水進(jìn)入后期厭氧發(fā)酵以后，導(dǎo)致丙酮酸在酶的作用下生成的乳酸較多。轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果和發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中的結(jié)果相吻合。

圖1 酸類物質(zhì)在TCA循環(huán)中的代謝通路[[2211]]Fig.1 Acid metabolism in TCA cycle[[2211]]

2.2 大曲和醬油中氨基酸的測(cè)定結(jié)果

通過(guò)對(duì)大曲中不同時(shí)間段的氨基酸含量的測(cè)定[22]，如圖2A所示，橫軸以上柱狀圖表示米曲霉滬釀3.042發(fā)酵的大曲所測(cè)氨基酸的含量，橫軸以下柱狀圖表示米曲霉100-8發(fā)酵大曲所測(cè)氨基酸含量。其中，谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、蘇氨酸和精氨酸在米曲霉100-8發(fā)酵大曲中有較為明顯的升高。由圖2B可知，在米曲霉100-8發(fā)酵的醬油中，谷氨酸、天冬氨酸、蛋氨酸、纈氨酸、精氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、丙氨酸和甘氨酸的含量有所增高。

圖2 大曲（A）及醬油（B）中氨基酸的含量比較Fig.2 Comparison of amino acid contents in soy sauce and koji

綜上所述，米曲霉100-8發(fā)酵醬油中呈鮮味的氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸含量都增多；呈甜味的氨基酸：脯氨酸、丙氨酸、甘氨酸含量增多；呈苦味的氨基酸：蛋氨酸、精氨酸、異亮氨酸含量也相應(yīng)的增多。氨基酸的含量是醬油風(fēng)味的一個(gè)指標(biāo)，不同的氨基酸會(huì)形成不同的口味，在生產(chǎn)中提高產(chǎn)品氨基酸的含量可以直接提高醬油的風(fēng)味。

2.3 大曲和醬油中香氣成分的測(cè)定

圖3 大曲和醬油中風(fēng)味香氣成分總量比較Fig.3 Comparison of total contents of flavor components in soy sauce and koji

通過(guò)對(duì)相同質(zhì)量的大曲和醬油的分析（圖3）可以看出，醬油中的總含量遠(yuǎn)大于大曲中的風(fēng)味總物質(zhì)含量，可見(jiàn)醬油的釀造過(guò)程是其風(fēng)味物質(zhì)不斷形成積累的過(guò)程。

對(duì)發(fā)酵醬油的香氣成分分析結(jié)果如表2所示。利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)到醬油中的風(fēng)味物質(zhì)種類都超過(guò)55種，主要包括酯類、醇類、醛類、酸類、酮類、吡嗪、呋喃和酚類等。

表2 香氣成分測(cè)定比較分析Table 2 Comparative analysis of flavor components

續(xù)表2

圖4 醬油中部分風(fēng)味成分物質(zhì)的比較Fig.4 Comparison of flavor components in soy sauces fermented by the two strains

由醬油中風(fēng)味物質(zhì)的變化（圖4）可以看出，米曲霉100-8發(fā)酵的醬油中吡嗪類物質(zhì)、醇類物質(zhì)、醛類物質(zhì)和酸類物質(zhì)的含量增加較明顯。酯類物質(zhì)變化不明顯，含量稍微有所下降。吡嗪類峰面積增大6.9 倍，酸類物質(zhì)增大1 倍，醇類和醛類物質(zhì)都增大0.31 倍。醛類物質(zhì)含量的增加在一定程度上促進(jìn)了醇類物質(zhì)的產(chǎn)生。米曲霉100-8發(fā)酵醬油比米曲霉滬釀3.042發(fā)酵的醬油增多了11 種醇，分別為：2,6-二甲基-4-庚醇、2-甲基-5-（1-甲基乙烯基）環(huán)己醇、桉葉油醇、Z-4-十二烯醇、2,2-二甲基丙基環(huán)己醇、3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-醇、順-3-壬烯-1-醇、順-9-萘烷醇、1-十三烷醇、反-2-甲基環(huán)戊醇和2-己基-1-葵醇。酸類、醇類、醛類物質(zhì)的增多，證明由米曲霉100-8發(fā)酵的醬油中，基礎(chǔ)風(fēng)味物質(zhì)成分有所增加。

在米曲霉100-8發(fā)酵的醬油中，吡嗪和2,3,5,6-四甲基吡嗪被發(fā)現(xiàn)。此外，2-甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪和三甲基吡嗪類含量上升較為明顯，對(duì)醬油風(fēng)味影響巨大。吡嗪類物質(zhì)具有強(qiáng)烈的香氣，而且其香氣的透散性好，對(duì)香氣具有獨(dú)特的顯著貢獻(xiàn)[23-24]。吡嗪類物質(zhì)也是加熱食品中所具有的比較典型的香味成分，可以賦予其獨(dú)特的焙烤和堅(jiān)果風(fēng)味。吡嗪類物質(zhì)可以由美拉德反應(yīng)產(chǎn)生[25]。主要美拉德反應(yīng)的作用下葡萄糖和蛋白質(zhì)反應(yīng)生成3-脫氧葡糖醛酮，3-脫氧葡糖醛酮和氨基酸進(jìn)一步反應(yīng)生成希胺醇，最終得到吡嗪類化合物。

3 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)米曲霉滬釀3.042和米曲霉100-8發(fā)酵大曲和醬油的有機(jī)酸、氨基酸和香氣物質(zhì)成分的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)2 種菌株發(fā)酵產(chǎn)生醬油的不同風(fēng)味物質(zhì)，找到了米曲霉100-8的優(yōu)勢(shì)。通過(guò)高效液相色譜分析發(fā)現(xiàn)由于米曲霉100-8糖酵解代謝酶類物質(zhì)的增加，生成了較多的丙酮酸，進(jìn)入TCA循環(huán)以后，根據(jù)代謝酶的升高和降低，分析了部分有機(jī)酸的含量變化。醬油中氨基酸總量的提高對(duì)醬油品質(zhì)和風(fēng)味都有好處。通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定醬油香氣物質(zhì)的比較，發(fā)現(xiàn)米曲霉100-8發(fā)酵醬油產(chǎn)生的酸類、醇類、醛類、吡嗪類物質(zhì)增多比較明顯，對(duì)醬油的風(fēng)味影響較大。其中變化最明顯的是吡嗪類物質(zhì)的增多，該類化合物主要是由美拉德反應(yīng)生成的。

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Comparison of Flavor Compounds in Soy Sauces Fermented by Two Aspergillus oryzae Strains

ZHAO Guo-zhong1, YAO Yun-ping1, CAO Xiao-hong2, CHEN Wei1,*
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China; 2. Key Laboratory of Food Nutrition and Safety, Ministry of Education, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China)

The contents of organic acids, amino acids and fl avor components in soy sauce fermented by Aspergillus oryzae 3.042 were analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC) and gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) in comparison to those of soy sauce fermented by A. oryzae 100-8, a mutant strain. The organic acids, amino acids and fl avor components at the end of low-salt solid soy sauce fermentation by A. oryzae 3.042 and 100-8 strains were measured. The content of malic acid in soy paste fermented by A. oryzae 100-8 was increased, while citric acid and succinate were decreased. The contents of asparagic acid, glutamic acid and arginine were increased in fermented koji and soy sauce. The taste of soy sauce was also infl uenced by different ratios between organic acids and amino acids. The contents of alcohols, aldehydes, acids and pyrazines in soy sauce fermented by A. oryzae 100-8 were enhanced. More pyrazines were detected in soy paste fermented by A. oryzae 100-8. These results seem to provide a theoretical basis for the soy sauce industry.

Aspergillus oryzae; soy sauce; organic acids; amino acids; fl avors

TS264.2

A

1002-6630（2014）24-0249-05

10.7506/spkx1002-6630-201424048

2014-08-24

江蘇省自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（BK20140146）；第55批中國(guó)博士后科學(xué)基金面上資助項(xiàng)目（2014M551503）

趙國(guó)忠（1983—），男，講師，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸飳W(xué)。E-mail：zhaogz@jiangnan.edu.cn

*通信作者：陳衛(wèi)（1966—），男，教授，博士，研究方向?yàn)楣δ苄晕⑸飳W(xué)。E-mail：chenwei66@jiangnan.edu.cn