龐之列，殷 燕，李春保*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，農(nóng)業(yè)部畜產(chǎn)品加工重點實驗室，食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210095）

解凍豬肉品質(zhì)和基于LF-NMR技術(shù)的檢測方法

龐之列，殷 燕，李春保*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，農(nóng)業(yè)部畜產(chǎn)品加工重點實驗室，食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210095）

研究解凍對豬肉營養(yǎng)品質(zhì)的影響，并研究利用低場核磁共振技術(shù)檢測解凍豬肉的可行性。選擇10 條宰后5 h內(nèi)的豬背最長肌，每條通脊沿垂直于肌纖維方向取質(zhì)量為100 g的肉塊5 塊，1 塊空白，其余在－20 ℃冷凍1、3、5、7 d后在0～4 ℃條件下解凍24 h后收集汁液，測定蛋白質(zhì)含量、氨基酸含量和礦物元素含量。選擇宰后5 h內(nèi)的豬背最長肌10 條，分別沿垂直于肌纖維方向分切厚度為2.5 cm的肉塊8 塊，分成4 組，每組2 塊肉樣，分別在0～4 ℃中貯藏0、24、48、72 h后，各組各取1 塊于－18 ℃中凍藏24 h后在0～4 ℃中解凍12 h，另一塊不處理，然后測定肉色（L*、a*和b*）、低場核磁共振橫向弛豫時間（T2）。結(jié)果表明，解凍會使豬肉蛋白質(zhì)、礦物元素和氨基酸的流失量顯著增大；解凍會導(dǎo)致豬肉低場核磁共振弛豫時間T2中第2個峰（T21）的峰時間（t21）、峰面積（A21）和峰面積比（P21）減小，色差中的紅度值（a*）增大。可以利用t21、A21、P21、a*這4 項指標(biāo)檢測解凍豬肉。

解凍豬肉；營養(yǎng)；低場核磁共振；檢測方法

冷凍貯藏是延長豬肉貨架期的最有效的手段之一，但是解凍會導(dǎo)致豬肉持水力的下降、滴水損失增大、嫩度降低等，影響豬肉的表觀顏色，造成營養(yǎng)成分的大量流失[1-2]。在我國市場上，很多解凍肉在銷售時并未被貼上標(biāo)簽，消費者在購買時難以辨別。目前解凍豬肉的檢測方法有感官判別法、生物成像法、酶分析法和光譜技術(shù)[3]。光譜技術(shù)中的低場核磁共振（low field nuclear magnetic resonance，LF-NMR）檢測法屬于近年來新興的解凍豬肉檢測方法[4]。Kari[5]、Thierry[6]等發(fā)現(xiàn)：解凍肉與新鮮的肉相比，它的橫向弛豫時間顯著性下降，而且肉在冷凍時的溫度越低，弛豫時間下降越顯著。根據(jù)這一特性，運用LF-NMR技術(shù)鑒別解凍豬肉是具有可行性的，但是如何運用LF-NMR技術(shù)去檢測解凍豬肉，還缺少具體的數(shù)據(jù)支撐，缺少一個完善的體系[7]。因此，也有必要深入研究建立一種基于LF-NMR技術(shù)的解凍豬肉快速檢測方法。綜上所述，本實驗分為2部分，第1部分定量分析了解凍對豬肉營養(yǎng)成分流失的影響，第2部分具體研究運用LF-NMR技術(shù)檢測解凍豬肉。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬肉背部最長肌采購自南京元潤食品有限公司，于宰后5 h 內(nèi)冷藏帶回實驗室進(jìn)行分析。

二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量分析試劑盒 美國Thermo公司；M2e酶標(biāo)儀 美國MD公司；Optima 2100 DV ICP電感耦合等離子體 美國Perkin Elmer公司；MARS微波消解儀 美國CEM公司；L-8900高速氨基酸分析儀 日本日立公司；CR-300色差計 日本Konica Minolta公司；PQ001低場核磁共振分析儀 上海紐邁電子科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 流失營養(yǎng)成分測定

1.2.1.1 樣品準(zhǔn)備

選擇10 條宰后5 h內(nèi)的豬背最長肌，沿肌肉走向垂直的方向分切成質(zhì)量約為100 g的肉塊5 塊，1 塊空白，其余在－20 ℃冷凍1、3、5、7 d后在0～4 ℃條件下解凍貯藏24 h后收集汁液，用于計算汁液流失率并測定汁液中的蛋白質(zhì)含量、水解氨基酸含量和礦物元素含量。

1.2.1.2 蛋白質(zhì)含量測定

BCA蛋白定量分析試劑盒，按V（A）∶V（B）=1∶50配制A-B混合液，與待測液在酶標(biāo)儀中放置反應(yīng)30 min（溫度37 ℃，振蕩1～2 次），選擇在562 nm波長處測定。

1.2.1.3 礦物元素含量測定

稱取0.50 g樣品，放入消解罐內(nèi)，加入10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)65%濃硝酸，晃勻靜置20 min，蓋緊消解管，在微波消解儀內(nèi)，參數(shù)如表1所示。

表1 MARS參數(shù)Table 1 Parameters of MARS

消解完成后冷卻至70 ℃以下打開消解管，在100 ℃水浴中排酸至沒有黃煙流出，少量多次用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%稀硝酸轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%稀硝酸定容，再轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中保存待測。使用電感耦合等離子體檢測樣品中Zn、P、Fe、Mn、Mg、Ca、Cu、Na和K的含量[8-9]。

1.2.1.4 氨基酸含量測定

參照GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測定》[10]，略有改動。稱取0.50 g樣品置于50 mL離心管中，添加10 mL 6mol/L鹽酸溶液，晃勻。用氮氣置換離心管中的空氣，蓋上蓋子，用封口膜封口。將離心管置于110 ℃鼓風(fēng)干燥箱中恒溫水解22 h，冷卻后用蒸餾水少量多次轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中，用蒸餾水定容。搖勻，過濾，取200 μL至5 mL離心管中，氮吹至干，加2 mL 0.02 mol/L鹽酸溶液，渦旋儀振蕩，過0.45 μm濾膜，裝瓶待測。

1.2.2 LF-NMR檢測解凍豬肉

1.2.2.1 樣品準(zhǔn)備

選擇10 條宰后5 h內(nèi)的整條豬背最長?。ㄍ梗?，沿肌肉走向垂直的方向分切厚度為2.5 cm的肉塊8 塊，分成4 組，每組2 塊肉樣，分別在0～4 ℃中貯藏0、24、48、72 h后，各組各取1塊于－18 ℃中凍藏24 h后在0～4 ℃中解凍12 h，另一塊不處理，然后測定肉色（L*、a*和b*）、LF-NMR橫向弛豫時間（T2）。

1.2.2.2 肉色測定

將分切的肉塊平放在紅色塑料盤上，置于0～4 ℃氧合30～40 min，之后用色差計測定L*（亮度值）、a*（紅度值）、b*（黃度值）。測定前，對色差計校正，之后將鏡頭垂直置于肉面上，鏡口緊扣肉面（不能漏光），按下攝像按扭，顏色參數(shù)L*、a*、b*即自動存入微機。每個樣品至少測定3 個點，取L*、a*、b*的平均值[11]。

1.2.2.3 LF-NMR弛豫時間測定

用刀修整肉塊的邊沿，并找出肌纖維的自然走向，在肉塊的切取過程中，應(yīng)避免肉眼可見的結(jié)締組織、血管及其他缺陷。用雙片刀（間距1 cm）沿肌纖維的自然走向分切成多個1 cm厚的小塊；再用鋒利的陶瓷刀從1 cm厚的小塊中分切出1 cm寬的肉柱（質(zhì)量為1.5 g），將肉柱放入特定的樣品管中，用LF-NMR儀進(jìn)行橫向弛豫時間（T2）的測定，每個肉樣平行測定2次，取平均值。在32 ℃、22.4 MHz共振頻率下，使用CPMG（carrpurcell-meiboom-gill）脈沖序列（90°脈沖和180°脈沖之間的時間τ=200 μs），重復(fù)掃描8 次，間隔3 s，得到2 000 個回波。

1.3 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)處理采用SAS 9.1.2軟件分析系統(tǒng)，其中解凍和貯藏時間對實驗指標(biāo)的影響采用析因方差分析（Factorial ANOVA），各處理組間的差異顯著性采用Duncan’ s Multiple Comparison。

2 結(jié)果與分析

2.1 汁液流失率

豬肉解凍后在0～4 ℃環(huán)境條件下貯藏24 h后的汁液流失率如表2所示。豬肉冷凍過程中形成的冰晶擠壓肌原纖維，改變細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，甚至造成細(xì)胞膜的破裂，導(dǎo)致解凍過程中汁液流失，保水性下降。所以解凍豬肉的流失率顯著增大（P＜0.05）；隨著冷凍時間的延長，豬肉的汁液流失率增大，冷凍1 d組與冷凍5、7 d間有顯著差異，其余各冷凍組的差異不顯著（P＞0.05）。

表2 汁液流失率Table 2 Drip loss rates

2.2 營養(yǎng)成分含量變化

在對解凍豬肉流失的汁液成分測定后發(fā)現(xiàn)，汁液中除了水分還包含蛋白質(zhì)和礦物元素。每100 g解凍豬肉所流失的營養(yǎng)成分含量變化如表3所示。

表3 豬肉營養(yǎng)成分含量變化Table 3 Changes of nutrients in pork μg/100g

解凍豬肉的蛋白質(zhì)和礦物元素的流失量顯著增加（P＜0.05），流失的各礦物元素量大小次序與豬肉中的各種元素含量次序是一致的，依次是K、P、Na、Mg、Ca、Fe、Zn、Cu、Mn。隨著冷凍時間的延長，蛋白質(zhì)流失量增加，冷凍1 d與7 d組差異顯著（P＜0.05）；隨著冷凍時間的延長，礦物元素流失量增加，其中K、P、Ca、Cu、Mn冷凍1d與冷凍5、7d組的流失量之間有顯著性差異（P＜0.05）；冷凍時間對Na、Mg、Fe、Zn的流失量作用不顯著（P＞0.05）。

2.3 氨基酸含量變化

解凍豬肉在0～4 ℃環(huán)境條件下貯藏24 h后，每100 g豬肉流失的氨基酸含量如表4所示。解凍會導(dǎo)致17 種氨基酸（包括必需氨基酸賴氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸）的流失量顯著增大（P＜0.05）。隨著冷凍時間的延長，氨基酸的流失量增大，其中以谷氨酸和天冬氨酸的增大趨勢最為顯著；冷凍7 d組的流失量顯著大于1、3 d 組（P＜0.05）。

表4 豬肉流失氨基酸量Table 4 Changes of amino acids in pork mg/100 g

2.4 運用LF-NMR技術(shù)檢測解凍豬肉

表5 不同處理豬肉實驗結(jié)果析因方差分析表Table 5 Factorial ANOVA of the measurements

從表5可以看出，結(jié)合水的峰面積和峰面積比會因為凍結(jié)解凍而顯著增大（P＜0.05）。但是，解凍對結(jié)合水的出峰時間沒有顯著影響（P＞0.05），冷凍前的貯藏時間對結(jié)合水的t2b、A2b、P2b3項指標(biāo)也沒有顯著性影響（P＞0.05）。因此，結(jié)合水的指標(biāo)不適合作為解凍豬肉的檢測指標(biāo)。

冷凍前的貯藏時間對t21、A21、P213 項指標(biāo)無顯著性的影響，但凍結(jié)解凍會導(dǎo)致t21顯著減小（P＜0.05），增大不易流動水的穩(wěn)定性（出峰時間縮短）；不易流動水的峰面積和峰面積比也會因為凍結(jié)解凍而顯著減小（P＜0.05）。凍結(jié)解凍對不易流動水的3項指標(biāo)均有顯著影響（P＜0.05），而且不易流動水是肉中水分的主要存在形式，便于檢測，因此，t21、A21、P21可以作為解凍豬肉的檢測指標(biāo)。

解凍會造成自由水的流失，表現(xiàn)為A22、P22的顯著減小（P＜0.05）；冷凍前的貯藏時間越長，t22、A22、P22有增大的趨勢。但解凍對自由水的出峰時間沒有顯著的影響（P＞0.05），且自由水只占豬肉中水分的很小一部分，受外界干擾程度大。為了檢測的準(zhǔn)確性，自由水的指標(biāo)不適合用于解凍豬肉的檢測。

色差的3 項指標(biāo)中，只有a*（紅度值）會因為解凍而顯著增大（P＜0.05），而L*（亮度值）和b*（黃度值）的變化規(guī)律性不顯著，不如a*明顯。因此，可以將a*作為用LF-NMR檢測解凍豬肉的輔助性檢測指標(biāo)。

綜上所述，LF-NMR橫向弛豫時間T2的不易流動水的3 項指標(biāo)（t21、A21、P21）和顏色參數(shù)a*值可作為判定解凍豬肉的指標(biāo)。對這4 項指標(biāo)的具體分析結(jié)果如圖1所示。

圖1 解凍隨貯藏時間對t2211（AA）、A2211（BB）、P2211（CC）和a*（D）的影響Fig.1 Changes of t21, A21, P21and a* with storage time for thawed and non-frozen pork

由圖1A可知，解凍豬肉在凍結(jié)過程中內(nèi)部形成冰晶，對肌原纖維結(jié)構(gòu)造成擠壓，導(dǎo)致部分不易流動水流出，存留在其中的不易流動水更加穩(wěn)定，表現(xiàn)為出峰時間的前移。如圖1B和圖1C所示，解凍肉的結(jié)構(gòu)在凍融過程中受到冰晶的擠壓和低溫的破壞，部分不易流動水流出，造成不易流動水的峰面積和峰比例顯著下降（P＜0.05）。如圖1D所示，解凍肉中的肌紅蛋白在與氧氣反應(yīng)后，生成氧合肌紅蛋白，表現(xiàn)為鮮紅色，使解凍肉的a*顯著高于正常豬肉。

3 討 論

凍結(jié)解凍作為一種有效的延長貨架期的貯藏手段，也會對豬肉的食用品質(zhì)造成不利影響。有研究[12-13]表明，豬肉的品質(zhì)會隨著凍結(jié)解凍而變得越來越差，表現(xiàn)為蛋白溶解度降低、蒸煮損失增加、滴水損失增加和嫩度變差等。冷凍時產(chǎn)生的冰晶不斷擠壓細(xì)胞結(jié)構(gòu)，作用于肌原纖維結(jié)構(gòu)，并對肌肉細(xì)胞膜和細(xì)胞器造成機械損傷，使蛋白質(zhì)變性，破壞豬肉的完整性，導(dǎo)致豬肉的保水性顯著下降[14-15]，流失更多的水分和營養(yǎng)物質(zhì)。本實驗的結(jié)果與此相一致：解凍之后，豬肉的汁液流失率會顯著增大，流失更多的蛋白質(zhì)、礦物元素。17 種氨基酸（谷氨酸和天冬氨酸最為顯著）的流失量也會增大。

本實驗還研究了應(yīng)用LF-NMR技術(shù)檢測解凍豬肉的可行性，豬肉肌肉中的水分主要是以自由水、不易流動水和結(jié)合水這3 種形式存在[16]。自由水指的是肌肉中能夠自由流動，存在于細(xì)胞外間隙中的水，它僅靠毛細(xì)管作用力而保持，約占總水分的15%；不易流動水是指那些存在于肌原纖維、纖絲中約占總水分80%的水分，由于它們與蛋白質(zhì)的親水基團相距較遠(yuǎn)，導(dǎo)致分子排列雖然有一定朝向性但排列的秩序不夠統(tǒng)一，會隨著蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或者電荷的變化而變化；結(jié)合水是指與蛋白質(zhì)大分子之間通過靜電引力而緊密結(jié)合的一部分水分子，大約占總水分的1%～4%，它們的狀態(tài)非常穩(wěn)定，基本不會受到肌肉蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的影響，也不會受到外力的影響。LF-NMR的橫向弛豫時間（T2值）的差異可有效區(qū)分肉品中水分的3 種分布狀態(tài)：T2b=1～10 ms反應(yīng)和大分子緊密相連的水[17]，可認(rèn)為其對應(yīng)結(jié)合水；T21=30～60 ms反應(yīng)位于高度組織化的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)部的水[12]或細(xì)胞內(nèi)水，可認(rèn)為其對應(yīng)不易流動水；T22=100～400 ms為肌原纖維蛋白外部的水[18]或細(xì)胞外水，對應(yīng)于自由水。本實驗在橫向弛豫測定中發(fā)現(xiàn)：豬肉在冷凍過程中，一方面，形成的冰晶不斷擠壓肌原纖維，使它們的結(jié)構(gòu)更加緊致，也使存在于其間的不易流動水的穩(wěn)定性增強，另一方面，解凍后不易流動水總量下降，穩(wěn)定性增大，表現(xiàn)為弛豫時間的提前（t21的下降）；解凍后豬肉內(nèi)部的機械損傷使保水性能下降，流失大量不易流水和自由水。在動態(tài)平衡的影響下，一部分不易流動水又轉(zhuǎn)換成為自由水，導(dǎo)致不易流動水的總量和所占比例大幅下降，表現(xiàn)為A21、P21的下降[19]。在色差測定中，發(fā)現(xiàn)解凍豬肉中的肌紅蛋白在與氧氣發(fā)生反應(yīng)之后，生成鮮紅色的氧合肌紅蛋白，使a*變化顯著。因此，本實驗最終在結(jié)合水、不易流動水、自由水的出峰時間、峰面積、峰面積比指標(biāo)中（t2b、A2b、P2b；t21、A21、P21；t22、A22、P22），挑選出了t21、A21、P21和色差a*作為檢測解凍豬肉的指標(biāo)[20-21]。

綜上所述，基于LF-NMR技術(shù)，利用t21、A21、P21、a*這4 項指標(biāo)檢測解凍豬肉具有可行性。但是在實際推廣運用前還需要對t21、A21、P21、a*進(jìn)行有效域值的劃分，尚有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

解凍會導(dǎo)致豬肉的品質(zhì)下降，汁液流失率增大，蛋白質(zhì)、礦物元素和氨基酸的流失量增大。解凍會導(dǎo)致豬肉LF-NMR弛豫時間T2中第2個峰（T21）的峰時間（t21）、峰面積（A21）和峰面積比（P21）減小，并導(dǎo)致色差測定中的紅度值（a*）增大?？梢岳肔F-NMR技術(shù)中的t21、A21、P21以及色差測定值a*這4 項指標(biāo)組合，檢測解凍豬肉。

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Applicability of LF-NMR to Detect Quality of Thawed Pork

PANG Zhi-lie, YIN Yan, LI Chun-bao*
(Synergetic Innovation Center of Food Safety and Nutrition, Key Laboratory of Animal Products Processing, Ministry of Agriculture, College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

This study was designed to investigate the influence of thawing on pork nutrition and the feasibility of detecting thawed pork by low-field nuclear magnetic resonance (LF-NMR) technology. Five pieces weighed at 100 g were removed from pork longissimus dorsi muscle along the direction of perpendicular to the muscle fibers, and four of these pieces were frozen at -20 ℃ for 1, 3, 5 and 7 d, respectively and then thawed at 0–4 ℃ for 24 h. Another piece was used as control. The exudate was collected to determine the contents of proteins, amino acids and mineral elements. Additional pork longissimus dorsi muscle was divided into 8 2.5 cm thick pieces along the direction of perpendicular to the muscle fibers at 5 h postmortem. These pieces were divided into four groups and stored at 0–4 ℃ for 0, 24, 48 and 72 h, respectively. One piece in each group was frozen for 24 h at -18 ℃ and then thawed for 12 h at 0–4 ℃ and the other one was used as control. The color parameters L*, a* and b* and NMR T2were measured. The results showed that thawing could significantly increase the total loss of proteins, mineral elements and amino acids, reduce the peak time (t21), area (A21) and area ratio (P21) of the second peak (T21) of LF-NMR T2relaxation time and increase the redness (a*). These four indexes of t21, A21, P21and a* can be used to detect thawed pork.

thawed pork; nutrition; low field nuclear magnetic resonance (LF-NMR); detection

TS251.7

A

1002-6630（2014）24-0219-05

10.7506/spkx1002-6630-201424042

2014-05-23

國家重大科學(xué)儀器設(shè)備開發(fā)專項（2013YQ17046308）；教育部“新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計劃”項目（NCET-11-0668）；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（生豬）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（CARS36-B-11）；“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD28B01）

龐之列（1990—），男，碩士，研究方向為肉品加工與質(zhì)量控制。E-mail：pangzhilie@126.com

*通信作者：李春保（1978—），男，副教授，博士，研究方向為肉品加工與質(zhì)量控制。E-mail：chbli2002@sina.com