賴海梅，劉書亮,2,*，鄒立扣，韓新鋒，周 康,2，朱冬梅，彭 珍，李建龍

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014；2.四川省農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 雅安 625014；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 都江堰校區(qū)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，四川 都江堰 611830）

肉雞屠宰場(chǎng)多重耐藥沙門氏菌Ⅰ類整合子與磺胺類耐藥基因（sul1、sul2和sul3）的檢測(cè)

賴海梅1，劉書亮1,2,*，鄒立扣3，韓新鋒1，周 康1,2，朱冬梅1，彭 珍1，李建龍1

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014；2.四川省農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 雅安 625014；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 都江堰校區(qū)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，四川 都江堰 611830）

目的：了解肉雞屠宰場(chǎng)多重耐藥沙門氏菌Ⅰ類整合子及磺胺類耐藥基因攜帶情況。方法：采用紙片擴(kuò)散法對(duì)肉雞屠宰場(chǎng)84 株沙門氏菌分離株進(jìn)行10 種抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)；應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）方法檢測(cè)多重耐藥沙門氏菌sul1、sul2、sul3和int1基因。結(jié)果：84 株沙門氏菌對(duì)氨芐西林和萘啶酸耐藥率高達(dá)100%，對(duì)環(huán)丙沙星、四環(huán)素、甲氧芐啶/磺胺甲噁唑、大觀霉素、氟苯尼考、慶大霉素耐藥率分別為39.29%、35.71%、35.71%、35.71%、22.62%、14.29%。38 株沙門氏菌對(duì)3 種及以上抗生素耐藥，屬于多重耐藥菌株。38 株多重耐藥菌株中，有20 株攜帶Ⅰ類整合子。30 株對(duì)甲氧芐啶/磺胺甲噁唑耐藥的菌株中，均能 檢測(cè)到sul1或sul2或sul3基因，與表型耐藥100%符合，其檢出率分別為40%、100%、63.3%。結(jié)論：肉雞屠宰場(chǎng)中沙門氏菌耐藥現(xiàn)象已不容樂觀，沙門氏菌多重耐藥性與Ⅰ類整合子的攜帶之間關(guān)系密切，且Ⅰ類整合子在磺胺類耐藥菌株的產(chǎn)生中起到重要作用。

沙門氏菌；Ⅰ類整合子；多重耐藥性；磺胺類耐藥基因

沙門氏菌是重要的人獸共患病病原菌，也是一種危害嚴(yán)重的食源性致病菌，可通過食物鏈感染人，受污染的動(dòng)物性食品是其重要來源[1-3]。近年來，隨著抗生素在食品動(dòng)物養(yǎng)殖上的廣泛應(yīng)用，沙門氏菌對(duì)常規(guī)抗生素產(chǎn)生耐藥性甚至多重耐藥性，不僅增加了畜禽疾病控制的難度，而且可通過食品污染威脅人類健康，這已引起人們普遍關(guān)注[4]。Ⅰ類整合子作為可移動(dòng)的DNA片段，能夠捕獲外源耐藥基因并將耐藥基因水平傳播，對(duì)細(xì)菌的耐藥性傳播有非常重要的意義[5-6]。沙門氏菌對(duì)磺胺類廣泛耐藥與磺胺類耐藥基因sul1、sul2和sul3基因有關(guān)。sul1基因常與其他耐藥基因整合到Ⅰ類整合子上，sul2基因常位于非接合性質(zhì)?；蚩梢苿?dòng)多重耐藥質(zhì)粒上，sul3是新發(fā)現(xiàn)的磺胺類耐藥基因[7-9]。Ⅰ類整合子與沙門氏菌廣泛耐藥有關(guān)[3,10]。所以應(yīng)用PCR方法對(duì)Ⅰ類整合子和磺胺類耐藥基因（sul1、sul2和sul3）進(jìn)行檢測(cè)，可從分子水平反映Ⅰ類整合子與磺胺類廣泛耐藥的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)對(duì)肉雞屠宰場(chǎng)分離的沙門氏菌耐藥性進(jìn)行調(diào)查，并應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）方法對(duì)其Ⅰ類整合子與磺胺類耐藥基因（sul1、sul2和sul3）進(jìn)行檢測(cè)，旨在分析磺胺類耐藥基因分布及Ⅰ類整合子在磺胺類耐藥基因傳播中的作用，為耐藥性安全評(píng)價(jià)提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 分離菌株

2012年11月—2013年6月從某肉雞屠宰場(chǎng)分離鑒定的84 株沙門氏菌（糞樣51 株，屠宰場(chǎng)生產(chǎn)環(huán)節(jié)肉雞胴體表面19 株，分割雞肉產(chǎn)品14 株），來源于284 份樣品（糞樣83 份、屠宰場(chǎng)生產(chǎn)環(huán)節(jié)肉雞胴體表面樣151 份、分割雞肉產(chǎn)品50 份）按照從一份陽性樣品中獲得一株沙門氏菌的原則保存菌株，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院四川省農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 參考菌株

腸炎沙門氏菌CICC21482，大腸桿菌ATCC25922，2株沙門氏菌int1可變區(qū)基因盒陽性菌株，攜帶bla（oxA-30/aadA1）和drfA1/orfC基因盒，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院四川省農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 培養(yǎng)基

M-H瓊脂、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.4 試劑

DNA Marker DL2000、瓊脂糖、2×PCR mix等均購(gòu)于寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.5 藥敏紙片

青霉素類：氨芐西林（ampicillin，AMP，10 μg/片）、阿莫西林/克拉維酸（amoxicillinclavulanic aicd，AMC，20/10 μg/片）；頭孢類：頭孢曲松（ceftriaxone，CRO，30 μg/片）；氨基糖苷類：慶大霉素（gentamycin，GEN，10 μg/片）、大觀霉素（spectinomycin，SPE，100 μg/片）；四環(huán)素類：四環(huán)素（tetracycline，TET，30 μg/片）；氯霉素類：氟苯尼考（fluorine benzene，F(xiàn)LO，75 μg/片）；磺胺類：甲氧芐啶/磺胺甲噁唑（trimethoprim-sulfamethoxazole，SXT，1.25/23.75 μg/片）；喹諾酮類：萘啶酸（nalidixic，NAL，30 μg/片）、環(huán)丙沙星（ciprofloxacin，CIP，5 μg/片）。以上試劑均購(gòu)自賽默飛世爾生物化學(xué)（北京）有限公司。

1.1.6 儀器與設(shè)備

DHP-9162恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；BSC-1300ⅡA2型生物安全柜 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；SORVALL離心機(jī) 美國(guó)科俊儀器有限公司；Milli-Q超純水系統(tǒng) 美國(guó)Millipore 公司；C1000 Thermal Cycler PCR儀、PowerPac Basic電泳儀、水平電泳槽、凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 藥敏實(shí)驗(yàn)

藥物敏感性實(shí)驗(yàn)按照WHO推薦的紙片擴(kuò)散法[11]和美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI2010）手冊(cè)[12]進(jìn)行10 種抗菌藥敏感性實(shí)驗(yàn)，以大腸桿菌為質(zhì)控菌株，結(jié)果參考CLSI對(duì)藥敏結(jié)果進(jìn)行判定。

1.2.2 Ⅰ類整合子和磺胺類耐藥基因的PCR檢測(cè)

根據(jù)藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷耐藥表型，以三重及以上耐藥的菌株和甲氧芐啶/磺胺異噁唑產(chǎn)生耐藥性的菌株作為實(shí)驗(yàn)菌株。

1.2.2.1 模板的制備

采用熱裂解法[13-14]提取沙門氏菌DNA。取1.5 mL培養(yǎng)18～24 h的沙門氏菌培養(yǎng)液，12 000 r/min離心2 min，沉淀用1 mL滅菌超純水反復(fù)洗2 次，12 000 r/min離心2 min，沉淀加100 μL 1× TE（pH 8.0）溶液重懸細(xì)胞，100 ℃水浴10 min，再置于冰水浴5 min，12 000 r/min離心2 min，上清液即為PCR模板，－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank和文獻(xiàn)設(shè)計(jì)sul1[15]、sul2[15]、sul3[16]和int1[17]基因的引物見表1，由寶生物工程（大連）有限公司合成。

表1 PCR擴(kuò)增用引物Table 1 Primers for PCR amplification

1.2.2.3 PCR反應(yīng)

PCR擴(kuò)增體系為：25 μL反應(yīng)體系中加12.5 μL 2×PCR mix（0.25 μL 5 U/μL Taq酶，3 μL 25 mmol/L MgCl2，5 μL 10×PCR Reaction Buffer，4 μL 2.5 mmol/L dNTP），1 μL（10 μmol/L）上游和下游引物，1 μL模板DNA，加滅菌超純水至25 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性45 s，（int1 70℃、可變區(qū) 55 ℃、sul1 65 ℃、sul2 70 ℃、sul3 60 ℃）退火50 s，72 ℃延伸50 s，35 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

1.2.2.4 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)

PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠（0.5×TBE）電泳，瓊脂糖凝膠含Gold-View DNA染料（5 ?L/100 mL），緩沖液為0.5×TBE，以100 V恒壓電泳50 min后用凝膠成像系統(tǒng)照相。

1.2.2.5 序列測(cè)定

隨機(jī)選取沙門氏菌菌株P(guān)CR產(chǎn)物送上海英俊生物技術(shù)有限公司克隆測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 肉雞屠宰場(chǎng)沙門氏菌耐藥性

采用紙片擴(kuò)散法檢測(cè)了84 株沙門氏菌分離株對(duì)10 種抗菌藥的敏感性。結(jié)果表明 84 株沙門氏菌對(duì)氨芐西林和萘啶酸100%耐藥，對(duì)環(huán)丙沙星、四環(huán)素、甲氧芐啶/磺胺甲噁唑、大觀霉素、氟苯尼考、慶大霉素耐藥率較高，耐藥率分別為39.29%、35.71%、35.71%、35.71%、22.62%、14.29%；對(duì)阿莫西林/克拉維酸和頭孢曲松耐藥率較低，耐藥率分別為7.14%和1.59%（圖1）。所有沙門氏菌均對(duì)2 種及以上抗生素耐藥，38 株沙門氏菌對(duì)3 種及以上抗生素耐藥，表現(xiàn)為多重耐藥，多重耐藥率為45.24%（圖2）。51 株雞糞源沙門氏菌對(duì)氟苯尼考和阿莫西林/克拉維酸的 耐藥性與整體差異較大，耐藥率分別為41.18%和25.49%。19 株屠宰環(huán)節(jié)雞肉胴體表面源沙門氏菌對(duì)10 種抗菌藥的耐藥率與整體無明顯差異。14 株分割雞肉產(chǎn)品源沙門氏菌對(duì)氨芐西林、萘啶酸、阿莫西林/克拉維酸和頭孢曲松耐藥率與整體無明顯差異，對(duì)四環(huán)素、甲氧芐啶/磺胺甲噁唑、 氟苯尼考、環(huán)丙沙星的耐藥率相差較大，耐藥率分別為21.43%、7.14%、7.14%和7.14%，對(duì)大觀霉素和慶大霉素100%不耐藥。

圖1 肉雞屠宰場(chǎng)沙門氏菌對(duì)10 種抗生素的耐藥率Fig.1 Resistance rate of Salmonella from broiler slaughterhouse to 10 antibiotics

圖2 肉雞屠宰場(chǎng)沙門氏菌的多重耐藥情況Fig.2 Distribution of multiple drug resistant Salmonella from broiler slaughterhouse

2.2 肉雞屠宰場(chǎng)多重耐藥沙門氏菌Ⅰ類整合子擴(kuò)增結(jié)果

38 株多重耐藥沙門氏菌有20 株int1陽性菌株，檢出率為52.6%，Ⅰ類整合子可變區(qū)基因盒檢測(cè)，擴(kuò)增結(jié)果為陰性（圖3、4）。5 株對(duì)3種抗生素耐藥沙門氏菌有1 株陽性菌株，33 株至少對(duì)4 種抗生素耐藥的沙門氏菌有19 株陽性菌株。26 株雞糞樣中多重耐藥沙門氏菌有18 株int1陽性菌株，檢出率為69.23%，屠宰加工胴體表面樣和分割雞肉產(chǎn)品樣多重耐藥沙門氏菌int1陽性檢出率均較整體偏低，檢出率分別為22.22%（2/9）和0%（0/3）。

圖3 部 分多重耐藥沙門氏菌iinntt11基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 PCR amplification of int1 gene from some multi-drug resista n t Salmonella isolates

圖4 部分多重耐藥沙門氏菌iinntt11可變區(qū)基因盒PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 PCR amplification of gene cassette from some multi-drug resistant Salmonella isolates

2.3 肉雞屠宰場(chǎng)多重耐藥沙門氏菌磺胺類耐藥基因擴(kuò)增結(jié)果

表2 30 株磺胺類耐藥沙門氏菌耐藥譜、Ⅰ類整合子和磺胺類耐藥基因Table 2 Antimicrobial resistance profile and integron-1 and sulfonamide resistant genes from 30 sulfonamide resistantSalmonneellllaa isolaatteess

選擇30 株對(duì)甲氧芐啶/磺胺甲噁唑耐藥的多重耐藥沙門氏菌（表2），通過PCR擴(kuò)增sul1、sul2和sul3基因。30 株耐藥菌均能擴(kuò)增出437 bp或285 bp或443 bp的條帶，序列測(cè)定表明，所測(cè)條帶與NCBI上公布的基因序列同源性在97%以上，本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增產(chǎn)物為沙門氏菌磺胺類耐藥基因（圖5～7）。PCR結(jié)果與表型耐藥100%一致，其中以sul2基因檢出率最高（100%，30/30），其次是sul3基因，檢出率為63.3%（19/30），sul1基因檢出率最低，為40%（12/30），10 株菌同時(shí)攜帶sul1、sul2和sul3三種基因，2 株菌同時(shí)攜帶sul1和sul2兩種基因，9 株菌同時(shí)攜帶sul2和sul3兩種基因（表3）。51 株雞糞樣中沙門氏菌中有23株對(duì)甲氧芐啶/磺胺甲噁唑耐藥，23 株沙門氏菌均能擴(kuò)增出sul1或sul2或sul3基因，其中sul1、sul2和sul3基因的檢出率分別為43.48%、100%和60.8 7%。19株屠宰加工胴體表面樣中有1 株對(duì)甲氧芐啶/磺胺甲噁唑耐藥，檢測(cè)到sul2基因和sul3基因，未檢測(cè)到sul1基因。14 株分割雞肉產(chǎn)品樣中有6 株對(duì)甲氧芐啶/磺胺甲噁唑耐藥，6 株沙門氏菌均能擴(kuò)增出sul1或sul2或sul3基因，sul1、sul2和sul3基因的檢出率分別為33.33%、100%和66.67%。肉雞屠宰場(chǎng)沙門氏菌不同環(huán)節(jié)磺胺類耐藥基因sul1、sul2和sul3基因檢出率差異不大。

圖5 部分多重耐藥沙門氏菌sul1sul1基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 PCR amplification of sul1sul1 gene from some multi-drug resistant Salmonella isolates

圖6 部分多重耐藥沙門氏菌sul2sul2基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.6 PCR amplification of sul2 gene from some multi-drug resistant Salmonella isolat es

圖7 部分多重耐藥沙門氏菌ssuull33基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.7 PCR amplification of ssuull33 gene from some multi-drug resistant Salmonella isolates

表3 多重耐藥沙門氏菌磺胺類耐藥基因分布與Ⅰ類整合子的關(guān)系Table 3 Distribution of sulfonamide resistant genes in multidrug resistaannccee Salmonneellllaa isolates and relation to integron-1

3 討 論

3.1 沙門氏菌對(duì)抗菌藥的耐藥性

本實(shí)驗(yàn)84 株肉雞屠宰場(chǎng)沙門氏菌對(duì)氨芐西林、萘啶酸、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、甲氧芐啶/磺胺甲噁唑、大觀霉素耐藥率均較高，耐3 種及3 種以上抗生素占45.24%，對(duì)6 種抗生素耐藥的菌株占11.90%，對(duì)7 種抗生素耐藥的菌株占14.29%，表明該肉雞屠宰場(chǎng)沙門氏菌耐藥性不容樂觀，肉雞產(chǎn)品可能成為耐藥沙門氏菌傳播的重要載體。這與Zhang等[18]的研究結(jié)果相同，他對(duì)肉雞屠宰加工生產(chǎn)鏈沙門氏菌耐藥性分析認(rèn)為雞肉產(chǎn)品是多重耐藥沙門氏菌的重要載體。雞肉產(chǎn)品污染了耐藥沙門氏菌，耐藥菌可將耐藥基因傳遞給人體益生菌，危害人類健康。因此，該肉雞屠宰場(chǎng)應(yīng)采取HACCP管理體系，控制肉雞屠宰場(chǎng)沙門氏菌耐藥菌株的產(chǎn)生及危害。

本研究中84 株沙門氏菌對(duì)氨芐西林和萘啶酸的耐藥性最強(qiáng)，這可能與肉雞養(yǎng)殖過程中相應(yīng)抗生素的使用有關(guān)。朱恒文[19]對(duì)肉雞屠宰加工生產(chǎn)鏈中沙門氏菌污染與溯源及耐藥性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沙門氏菌對(duì)強(qiáng)力霉素、鏈霉素和四環(huán)素的耐藥性最強(qiáng)，認(rèn)為可能與肉雞養(yǎng)殖過程中相應(yīng)抗生素的大量使用有關(guān)。張瑋等[5]對(duì)健康豬直腸糞便中沙門氏菌及姚大偉[20]、楊保偉[21]等對(duì)食源性沙門氏菌耐藥性研究均表明養(yǎng)殖場(chǎng)中存在抗生素濫用現(xiàn)象。此外，頭孢曲松是目前治療沙門氏菌感染的有效藥物，而本研究中沙門氏菌對(duì)頭孢曲松已表現(xiàn)出較低的耐藥性，說明養(yǎng)殖過程中可能存在持續(xù)使用該類抗生素現(xiàn)象，導(dǎo)致沙門氏菌對(duì)這些抗生素逐漸產(chǎn)生耐藥性，這應(yīng)引起重視。

3.2 沙門氏菌Ⅰ類整合子及磺胺類耐藥基因

整合子作為可移動(dòng)的DNA片段，為細(xì)菌耐藥性傳播提供了新的研究方向。本實(shí)驗(yàn)中多重耐藥沙門氏菌Ⅰ類整合子檢出率較文獻(xiàn)報(bào)道低，進(jìn)一步對(duì)其基因盒檢測(cè)卻全為陰性，推測(cè)其可能原因是Ⅰ類整合子在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中將耐藥基因轉(zhuǎn)移到基因組上。這與張瑋等[5]研究結(jié)果相同，張瑋等[5]對(duì)健康豬直腸糞便中Ⅰ類整合子的研究表明20 株多重耐藥沙門氏菌中，有19 株攜帶Ⅰ類整合子，對(duì)其基因盒進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果只有一株擴(kuò)增到基因盒（1/19），分析其可能原因是Ⅰ類整合子或轉(zhuǎn)座子在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中將耐藥基因由質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)移到基因組上。

磺胺類藥物價(jià)格低，抗菌譜廣，藥效顯著，在動(dòng)物疾病防治中發(fā)揮了巨大的作用，與此同時(shí)，沙門氏菌對(duì)其產(chǎn)生了廣泛的耐藥性[11,22]。本研究中84 株沙門氏菌中有30 株對(duì)甲氧芐啶/磺胺甲噁唑耐藥，占35.71%，這與鄒明等[23]的報(bào)道基本一致。30 株磺胺耐藥菌株均能擴(kuò)增出sul1或sul2或sul3基因，但sul2基因是主要的磺胺類耐藥基因，這與Antunes[3]、董洪燕[8]、廖成水[24]等研究表明sul1基因是主要的磺胺類耐藥基因存在差異。這可能是由于不同地區(qū)沙門氏菌種類不同，使得耐藥基因的攜帶情況也不同。本實(shí)驗(yàn)中同時(shí)攜帶有int1基因和磺胺類耐藥基因sul的情況較為普遍，30 株對(duì)甲氧芐啶/磺胺異噁唑耐藥的沙門氏菌有17 株菌int1陽性，其中，52.9%的沙門氏菌int1與sul1基因同時(shí)存在，100%的int1與sul2基因同時(shí)存在，且有4 株int1陽性菌僅攜帶sul2基因，70.6%的int1與sul3基因同時(shí)存在。對(duì)于sul1基因研究的比較清楚，大量研究表明[3,10,25-26]，sul1基因常與qacEΔ1基因位于Ⅰ類整合子3′CS保守區(qū)。對(duì)于sul2基因的位置需要進(jìn)一步確認(rèn)，可能位于其他可移動(dòng)元件上。R?dstr?m等[27]研究表明sul2基因位于各種IncQ質(zhì)粒和其他非結(jié)合耐藥質(zhì)粒。Enne等[28]研究表明sul2基因位于小的非結(jié)合質(zhì)?；虼蟮目赊D(zhuǎn)移多重耐藥質(zhì)粒。Yau等[29]研究表明sul2基因與strA和strB有關(guān)，位于一個(gè)小的可移動(dòng)、非結(jié)合的多重復(fù)制質(zhì)粒上。對(duì)于sul3基因可能與qacH和mef(B)代替qacEΔ1/sul1基因位于Ⅰ類整合子3′CS保守區(qū)。Antunes等[30]研究表明sul3基因與Ⅰ類整合子3′CS qacH基因有關(guān)。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Ⅰ類整合子與磺胺類耐藥基因的傳播有關(guān)，在磺胺類耐藥菌株的產(chǎn)生中起到重要作用。

[1] 王曉泉. 不同來源多重耐藥性沙門氏菌分離株的耐藥機(jī)制和脈沖場(chǎng)電泳分析[D]. 揚(yáng)州: 揚(yáng)州大學(xué), 2007.

[2] 董睿. 雞蛋源沙門氏菌的分離鑒定及其耐藥基因和毒力基因的檢測(cè)[D]. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2012.

[3] ANTUNES P, MACHADO J, SOUSA J C, et al. Dissemination of sulfonamide resistance genes (sul1, sul2 and sul3) in portuguese Salmonella enterica strains and relation with integrons[J]. Americ an Society for Microbiology, 2005, 49(2): 836-839

[4] GUERRA B, SOTO S M, ARGUELLES J M, et al. Multidrug resistance is mediated by large plasmids carrying a class 1 integron inthe emergent Salmonella enterica serotype [4, 5, 12:i:-][J]. Antimicrob Agents Chemother, 2001, 45(4): 1305-1308.

[5] 張瑋, 李郁, 姚健, 等. 健康豬直腸糞便中沙門菌1類整合子與耐藥基因的檢測(cè)[J]. 中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志, 2010, 22(7): 594-598.

[6] 李郁, 焦新安, 魏建中, 等. 屠宰生豬多重耐藥沙門菌1類整合子與耐藥基因的檢測(cè)[J]. 中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào), 2008, 24(4): 327-330.

[7] HUR J, KIM J H, PA RK J H, et al. Molecular and virulence characteristics of multi-drug resistant Salmonella enteritidis strains isolated from poultry[J]. The Veterinary Journal, 2011, 189(3): 306-311.

[8] 董洪燕, 繆曉斌, 李鑫, 等. 雞白痢沙門菌分離株的耐藥性及磺胺類耐藥機(jī)制研究[J]. 中國(guó)家禽, 2010, 32(9): 29-33.

[9] SANDVANG D, AARESTRUP F M, JENSEN L B. Characterization of integrons and antibiotic resistance genes in Danish multiresistant Salmonella enteric Typhimurium DT104[J]. FEMS Microbiology Letters, 1998, 160: 37-41.

[10] ENNE V I, LIVERMORE D M, STEPHENS P, et al. Persistence of sulfonamide resistance in the UK despite national perscribing restriction[J]. Lancet, 2001, 357: 1325-1328.

[11] PERRENTEN V, BOERLIN P. A new sulfonamide resistance gene (sul3) in Escherichia coli is widespread in the pig population of Switzerlan[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2003, 47: 1169-1172.

[12] 衛(wèi)生部醫(yī)政司. 全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程[M]. 3版. 南京: 東南大學(xué)出版社, 2006: 890-923.

[13] CLSI. M100-S19 Performance standards for antimicrobial susceptibility testing[S]. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute, 2010.

[14] 黃金林, 焦新安, 文其乙, 等. 應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)快速檢測(cè)沙門氏菌[J].揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào), 2002, 23(3): 5-7.

[15] 邵碧英, 陳彬, 湯敏英, 等. 沙門氏菌DNA提取及PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(7): 331-334.

[16] CHEN S, ZHAO S, WHITE D G, et al. Characterization of multipleantimicrobial-resistant Salmonella serovars isolated from retail meats[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2004, 70(1): 1-7.

[17] KERRN M B, KLEMMENSEN T, FRIMODT-M±LLER N, et al. Susceptibility of Danish Escherichia coli strains isolated from urinary tract infections and bacteraemia, and distribution of sul genes conferring sulphonamide resistance[J]. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2002, 50: 513-516.

[18] ZHANG A Y, WANG H N, TIAN G B, et al. Phenotypic and genotypic characterization of antimicrobial resistance in faecal bacteria from 30 Giant pandas[J]. International Journal of Antimicrobial Agents, 2009, 33(5): 456-460.

[19] 朱恒文. 肉雞屠宰加工生產(chǎn)鏈中沙門氏菌的污染與溯源及耐藥性分析[D]. 合肥: 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué), 2012.

[20] 姚大偉, 江蕓, 徐幸蓮, 等. 生鮮豬肉中沙門氏菌的分離、鑒定及耐藥性檢測(cè)[J]. 食品科學(xué), 2012, 33(24): 210-214.

[21] 楊保偉, 盛敏, 席美麗, 等. 食源性沙門氏菌耐藥性檢測(cè)及相關(guān)質(zhì)粒[J].微生物學(xué)報(bào), 2008, 48(8): 1006-1012.

[22] 周萬溶, 王紅寧, 張安云, 等. 豬和野生動(dòng)物源大腸桿菌及沙門氏菌中磺胺類藥物耐藥基因的檢測(cè)[J]. 中國(guó)獸醫(yī)科學(xué), 2007, 37(4): 287-290.

[23] 鄒明, 魏蕊蕊, 張純萍, 等. 雞源沙門氏菌的血清型、耐藥性和耐藥機(jī)制調(diào)查[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2013, 21(7): 855-862.

[24] 廖成水, 程相朝, 張春杰, 等. 雞源致病性沙門氏菌新近分離株的耐藥性與耐藥基因[J]. 中國(guó)獸醫(yī)科學(xué), 2011, 41(7): 751-755.

[25] HAMMERUMA M, SANDVANG D, ANDERSEN S R, et al. Detection of sul1, sul2 and sul3 in sulphonamide resistant Escherichia coli isolates obtained from healthy humans, pork and pigs in Denmark[J]. International Journal of Food Microbiology, 2006, 106(2): 235-237.

[26] GUERRA B, JUNKER E, HELMUTH R. Incidence of the recently described sulfonamide resistance gene sul3 among German Salmonella enteric strains isolated from livestock and food[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2004, 48(7): 2712-2715.

[27] R?DSTR?M P, SWEDBERG G. RSF1010 and a conjugative plasmid contain sulⅡ, one of two known genes for plasmid-borne sulfonamide resistance dihydropteroate synthase[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy,1988, 32(11): 1684-1692.

[28] ENNE V I, LIVERMORE D M, STEPHENS P, et al. Persistence of sulphonamide resistance in Escherichia coli in the UK despite national prescribing restriction[J]. The Lancet, 2001, 357: 1325-1328.

[29] YAU S, LIU X, DJORDJEVIC S P, et al. REF1010-like plasmids in Australian Salmonella enteric serovar Typhimurium and origin of their sul2-strA-strB antibiotic resistance gene cluster[J]. Microbial Drug Resistance, 2010, 16(4): 249-252.

[30] ANTUNES P, MACHADO J, PEIXE L. Dissemination of sul3-containing elements linked to class 1 integrons with an unusual 3’conserved sequence region among Salmonella isolates[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2007, 51(4): 1545-1548.

Detection of Integton-1 and Sulphonamide Resistant Genes of Multi-Drug Resistant Salmonella Species Isolated from Broiler S laughterhouse

LAI Hai-mei1, LIU Shu-liang1,2,*, ZOU Li-kou3, HAN Xin-feng1, ZHOU Kang1,2, ZHU Dong-mei1, PENG Zhen1, LI Jian-long1
(1. College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China; 2. Key Laboratory of Agricultural Products Processing and Preservation Engineering of Sichuan Province, Ya’an 625014, China; 3. Laboratory of Microbiolog y, Dujiangyan Campus, Sichuan Agricultural University, Dujiangyan 611830, China)

Objective: To characterize multi-drug resistant Salmonella isolates carrying integeon-1 and sulfonamides-resistant genes from broiler slaughterhouse. Methods: The susceptibility of 84 Salmonella isolates from broiler slaughterhouse to 10 varieties of antibiotics was evaluated by K-B disc method. In addition, PCR was used to detect the presence of the int1, sul1, sul2 and sul3 genes of multi-drug resistance in Salmonella isolates. Results: The resistant rates of these 84 Salmonella isolates were 100% to ampicilin and nalidixic acid, and 39.29%, 35.71%, 35.71%, 35.71%, 22.62% and 14.29% to ciprofl oxacin, tetracycline, b enzyl methyl oxygen/sulfamethoxazole, spectinomycin, fl uorine benzene nicol and gentamicin, respectively. It was found that 38 of these isolates exhibited resistance to at least three antibiotics as multi-drug resistant strains. Among the 38 multi-drug resistant Salmonella strains, 20 carried integron-1. Sulfonamide resistant genes such as sul1 or sul2 or sul3 genes were detected in 30 sulfonamides resistant Salmonella isolates, suggesting 100% consistency between the results of drug sensitivity tests and PCR. The detection rates of the sulfonamides resistant genes sul1, sul2 and sul3 genes by PCR were 40%, 100% and 63.3%, respectively. Conclusion: These results implied that the antimicrobial resistance of Salmonella isolates from broiler slaughterhouse is not optimistic. A close correlation exists between the multi-drug resistance and the carrier condition of the integron-1, which may play a critical role in the sulphonamide resistance in Salmonella isolates.

Salmonella; integron-1; multi-drug resistance; sulfonamide-resistant genes

TS201.6

A

1002-6630（2014）24-0178-06

10.7506/spkx1002-6630-201424034

2014-01-21

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（200903055）

賴海梅（1988—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸?。E-mail：764113722@qq.com

*通信作者：劉書亮（1968—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸锱c發(fā)酵工程。E-mail：lsliang999@163.com