曹 榮，張 媛，趙 玲，殷邦忠，劉 淇,*

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島 266071；2.獐子島集團(tuán)股份有限公司，遼寧 大連 116001）

海星皂苷測(cè)定條件優(yōu)化及其組織分布測(cè)定

曹 榮1，張 媛2，趙 玲1，殷邦忠1，劉 淇1,*

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島 266071；2.獐子島集團(tuán)股份有限公司，遼寧 大連 116001）

為了建立快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的海星皂苷含量檢測(cè)方法，以多棘海盤(pán)車為研究對(duì)象，分析濃硫酸用量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間等比色條件以及脫色、脫脂等樣品前處理?xiàng)l件對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，并采用優(yōu)化后的檢測(cè)方法對(duì)多棘海盤(pán)車不同組織中的皂苷含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明：適宜采用濃硫酸用量10%、反應(yīng)溫度60 ℃、反應(yīng)時(shí)間30 min的比色條件，樣品前處理過(guò)程中進(jìn)行脫色、脫脂以及丙酮沉淀可以顯著提高測(cè)定的準(zhǔn)確性。精密度實(shí)驗(yàn)和加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：皂苷含量低、中、高3 組樣品對(duì)應(yīng)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為4.71%、1.61%和1.52%，平均加標(biāo)回收率為99.64%，該方法的精密度和準(zhǔn)確性可以滿足檢測(cè)要求。多棘海盤(pán)車整體皂苷含量為3.65 mg/g（干基計(jì)），其中消化腺中皂苷含量最高，其次是體壁和生殖腺。

皂苷；多棘海盤(pán)車；比色法

海星屬于棘皮動(dòng)物門（Echinodermata），海星綱（Asteroidea），是一類海洋底棲的無(wú)脊椎動(dòng)物，在我國(guó)沿海海域分布廣泛[1]。海星大量掠食牡蠣、扇貝等，且具有很強(qiáng)的繁殖和再生能力，嚴(yán)重危害沿海的貝類養(yǎng)殖。目前貝類底播養(yǎng)殖區(qū)域的海星隨拖網(wǎng)起捕后多被直接丟棄或經(jīng)曝曬粉碎后用作農(nóng)作物肥料，這對(duì)環(huán)境是一種污染，也造成了資源的浪費(fèi)。

海星具有較高的蛋白、脂質(zhì)含量[2]，同時(shí)含有皂苷、甾醇、生物堿、多糖等多種結(jié)構(gòu)獨(dú)特的化學(xué)物質(zhì)[3]，在食品、飼料、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有良好的開(kāi)發(fā)前景。海星皂苷是海星的次生代謝產(chǎn)物，具有重要的生物功能和藥理活性，如調(diào)節(jié)生殖發(fā)育、降血壓、抗?jié)?、抗病毒、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)等，但同時(shí)也具有很強(qiáng)的溶血作用與毒性[4]，人或動(dòng)物過(guò)量服用后會(huì)產(chǎn)生頭暈、嘔吐等中毒癥狀，因此海星用作食品和飼料加工時(shí)具有一定的安全隱患[5]，針對(duì)海星中皂苷檢測(cè)方法和脫除技術(shù)的研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

目前皂苷的分析方法主要有比色法、薄層掃描法、色譜法、毛細(xì)管電泳法等[6]。不同類型的皂苷，其適用的檢測(cè)方法也不同。海星中的皂苷多以甾體化合物的形式存在[7]，利用其可被濃硫酸氧化脫水生成α,β-不飽和酮共軛體系的性質(zhì)[8]，可以采取紫外分光光度法測(cè)定其含量[9]，但該方法的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性會(huì)受到樣本中脂質(zhì)、色素、游離糖及部分水解苷元等的影響，因此有必要對(duì)該方法的測(cè)定條件進(jìn)行優(yōu)化。

本實(shí)驗(yàn)以薯蕷皂苷元作為標(biāo)準(zhǔn)品，分析了濃硫酸用量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間對(duì)比色的影響，并以黃海和渤海較為常見(jiàn)的海星——多棘海盤(pán)車（Asterias amurensis）為研究對(duì)象，考察皂苷提取過(guò)程中脂質(zhì)脫除、色素脫除以及水解苷元分離對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，對(duì)基于紫外分光光度法的海星中皂苷定量檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化，并采用該方法對(duì)多棘海盤(pán)車中的皂苷分布進(jìn)行了分析，以期為海星的開(kāi)發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

多棘海盤(pán)車由大連獐子島集團(tuán)股份有限公司提供，2013年5月采集自渤海獐子島海域，選取輻徑（12±2） cm的樣品，洗凈后烘干、粉粹，過(guò)200 目篩備用。

薯蕷皂苷元標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma公司；濃硫酸、甲醇、丙酮、石油醚等均為分析純。

1.2 方法

專業(yè)核心課是財(cái)務(wù)管理專業(yè)的重要內(nèi)容，教師通過(guò)核心課能夠?qū)⒇?cái)務(wù)管理知識(shí)系統(tǒng)的傳授給學(xué)生，這樣學(xué)生就會(huì)具備實(shí)際操作的能力。核心課設(shè)置如下課程：財(cái)務(wù)管理案例、財(cái)務(wù)控制、稅法與籌劃等，我們可以將預(yù)算管理、高級(jí)財(cái)務(wù)管理、資本運(yùn)營(yíng)、非營(yíng)利組織財(cái)務(wù)等課程作為選修課供學(xué)生選擇學(xué)習(xí)。這樣也就體現(xiàn)了財(cái)務(wù)管理專業(yè)具備的獨(dú)特性。其中，中級(jí)財(cái)務(wù)會(huì)計(jì)、財(cái)務(wù)管理、財(cái)務(wù)管理案例、財(cái)務(wù)風(fēng)險(xiǎn)管理、稅法與籌劃、財(cái)務(wù)控制、財(cái)務(wù)分析、成本管理會(huì)計(jì)、資產(chǎn)評(píng)估是專業(yè)核心課的重要內(nèi)容。

1.2.1 溶液的配制

取50.0 mg于50 mL容量瓶中，甲醇定容，配制成1.0 mg/mL薯蕷皂苷元甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液。

以陜西辦事處、南陽(yáng)辦事處、邯鄲辦事處、膠東辦事處、豫東辦事處、晉南辦事處、福建辦事處，廣西辦事處、四川辦事處、山西省社會(huì)化服務(wù)體系為根據(jù)地，打造的十大現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)服務(wù)的探索基地和價(jià)值營(yíng)銷的實(shí)踐基地，形成了天脊品牌提升的重要基點(diǎn)和“市場(chǎng)堡壘”。

當(dāng)漿液擴(kuò)散方位角θ≤90°時(shí)，即漿液運(yùn)動(dòng)方向與裂隙面傾斜方向總體一致，隨著裂隙傾角的增大，在相同時(shí)間內(nèi)的注漿壓力較小，這是由于裂隙面傾斜時(shí)，漿液具有向下的自重分量，其與注漿壓力一起克服漿液阻力，促使?jié){液向下運(yùn)動(dòng)，在恒速率注漿情況下，裂隙傾角越大，注漿壓力越小，且當(dāng)注漿時(shí)間t=60 s時(shí)，漿液擴(kuò)散方位角θ=0°、傾角α=90°時(shí)的傾斜裂隙注漿壓力為水平裂隙的0.62倍。

1.2.2 比色條件優(yōu)化

1.2.2.1 吸收波長(zhǎng)的確定

標(biāo)準(zhǔn)品薯蕷皂苷元與濃硫酸反應(yīng)后，在200～1 000 nm范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，發(fā)現(xiàn)在紫外光區(qū)有強(qiáng)吸收，其中271 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰。這與文震等[9]發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)皂苷與濃硫酸反應(yīng)產(chǎn)物在277 nm有最大吸收峰以及王榮鎮(zhèn)等[10]發(fā)現(xiàn)紫蛇尾皂苷檢測(cè)波長(zhǎng)為276 nm的結(jié)論基本一致。

國(guó)防科技工業(yè)主要是指從事武器科研裝備生產(chǎn)、研發(fā)工作的相關(guān)工業(yè)產(chǎn)業(yè)，具體包括航空、航天、核能、電子、船舶等多個(gè)部門，其對(duì)于我國(guó)國(guó)防事業(yè)的建設(shè)與發(fā)展有著直接的影響。在計(jì)劃經(jīng)濟(jì)時(shí)期，軍工企業(yè)本身所存在的競(jìng)爭(zhēng)壓力非常之小，同時(shí)國(guó)家的資金支持力度也比較大，因而對(duì)于自身的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)以及經(jīng)濟(jì)收益問(wèn)題并不重視［1］。然而隨著市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，軍工企業(yè)要想生存并長(zhǎng)期發(fā)展下去，就必須要尊重市場(chǎng)規(guī)律，參與到市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)中來(lái)，不斷提升自身的核心競(jìng)爭(zhēng)力，而市場(chǎng)導(dǎo)向下的軍民融合發(fā)展策略則恰恰能夠幫助軍工企業(yè)實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)。因此，軍工企業(yè)的軍民融合發(fā)展，在很大程度上也是為了滿足市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)環(huán)境下國(guó)防科技工業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展需求。

1.2.2.2 硫酸用量

準(zhǔn)確量取0.1 mL標(biāo)準(zhǔn)皂苷溶液，于冰水浴中分別加入濃硫酸0.2、0.5、1.0、2.0、3.0 mL，混勻，60℃水浴中反應(yīng)30 min，冰浴冷卻后用甲醇定容至10 mL，測(cè)定吸光度。

2.2 反應(yīng)條件對(duì)吸光度的影響

標(biāo)準(zhǔn)皂苷溶液0.1 mL中分別加入濃硫酸0.2、0.5、1.0、2.0、3.0 mL，在同樣溫度條件下反應(yīng)相同時(shí)間，反應(yīng)后吸光度見(jiàn)圖1a。0.2、0.5 mL和1.0 mL濃硫酸用量對(duì)應(yīng)的吸光度有顯著性差異（P＜0.01），1.0、2.0、3.0 mL濃硫酸用量對(duì)應(yīng)的吸光度無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。從經(jīng)濟(jì)和實(shí)驗(yàn)安全的角度，采用濃硫酸用量1.0 mL（即濃硫酸用量為反應(yīng)總體系的10%）。

1.2.2.4 反應(yīng)時(shí)間

準(zhǔn)確量取0.1 mL標(biāo)準(zhǔn)皂苷溶液，于冰水浴中加入濃硫酸1.0 mL，混勻，60 ℃水浴中分別反應(yīng)10、20、30、40、50、60 min，冰浴條件下冷卻后用甲醇定容至10 mL，測(cè)定吸光度。

1.2.3 樣品處理

廣汽本田首款純電動(dòng)SUV VE-1全球首發(fā)，市場(chǎng)指導(dǎo)價(jià)22.58萬(wàn)元，補(bǔ)貼后價(jià)格為17.08萬(wàn)元起。同時(shí)，廣汽本田首款插電式混動(dòng)SUV世銳也于車展亮相并揭曉市場(chǎng)指導(dǎo)價(jià)：豪華版20.68萬(wàn)元、補(bǔ)貼后價(jià)格18.08萬(wàn)元起；精英版19.68萬(wàn)元，補(bǔ)貼后價(jià)格17.08萬(wàn)元起。

1.2.4.2 精密度實(shí)驗(yàn)

1.2.4 方法精密度、準(zhǔn)確性驗(yàn)證

1.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

上海誠(chéng)達(dá)物流作為第三方運(yùn)輸公司，提供專業(yè)的第三方運(yùn)輸服務(wù)。但與運(yùn)輸相關(guān)的其他第三方物流服務(wù)并有涉及，導(dǎo)致了上海誠(chéng)達(dá)物流公司服務(wù)產(chǎn)品的單一性。

分別取薯蕷皂苷元-甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.0 mg/mL）0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL，冰浴條件下分別加入濃硫酸1.0 mL，60 ℃條件下反應(yīng)30 min，冰浴冷卻，甲醇定容至10 mL。于271 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

取6 份海星干粉，每份5.0 g，分別加入甲醇100 mL，超聲提取60 min，過(guò)濾。濾液分別進(jìn)行如下處理：Ⅰ濾液用甲醇定容至100 mL，直接取0.5 mL，按1.2.2節(jié)優(yōu)化后的條件進(jìn)行比色；Ⅱ?yàn)V液中按照0.01 g/mL的比例加入活性炭脫色，充分混勻后濾紙過(guò)濾，濾液用甲醇定容后比色；Ⅲ濾液中按照1∶2（V/V）的比例加入石油醚，采用分液漏斗脫除脂質(zhì)，收集下層液體用甲醇定容后比色；Ⅳ濾液中加入5 倍體積丙酮，8 000 r/min離心20 min后，棄上清液，黃色沉淀物用甲醇溶解、定容后比色；Ⅴ濾液依次脫色、脫脂處理后，甲醇定容比色；Ⅵ濾液依次脫色、脫脂、丙酮沉淀處理后，甲醇定容比色。

設(shè)置皂苷含量低、中、高3 組樣品（分別取海星干粉1.00 、4.00 g和7.00 g），按照1.2.2節(jié)優(yōu)化的條件進(jìn)行樣品處理，提取粗皂苷并測(cè)定含量。每組均重復(fù)3次，每次設(shè)2個(gè)平行。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表征精密度。

1.2.4.3 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

取已知皂苷含量的海星干粉樣品6份，每份1.00 g，按照1.2.2節(jié)優(yōu)化的條件進(jìn)行樣品處理，然后分別加入5.0 mg/mL薯蕷皂苷元標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，定容后比色。計(jì)算各組加標(biāo)回收率，以平均加標(biāo)回收率表征準(zhǔn)確性。

1.2.5 多棘海盤(pán)車不同組織中皂苷含 量測(cè)定

答：85歲的老人，吃點(diǎn)東西就要上廁所，肚里存不住東西，到醫(yī)院檢查沒(méi)有病，說(shuō)明腸道功能老化，屬于功能問(wèn)題，可服用水蘇糖、活菌制劑和植物活性硒，調(diào)節(jié)腸道功能。

鮮活多棘海盤(pán)車洗凈泥沙，分離出體壁、消化腺（包括胃、幽門盲囊）和生殖腺，烘干，研成粉末備用。分別取體壁、消化腺和生殖腺干粉5.0 g，按照1.2.2節(jié)和1.2.3節(jié)確立的條件進(jìn)行皂苷提取和含量測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 吸收光譜

1998年，地處松嫩平原的巨浪牧場(chǎng)連降暴雨，本已四處漏風(fēng)的泥草房再也經(jīng)不起暴風(fēng)雨的洗禮，一整面墻突然倒塌。無(wú)奈之下，全家只好緊急疏散，被牧場(chǎng)安置到場(chǎng)部西側(cè)一個(gè)叫“西牛舍”的地方。

準(zhǔn)確量取0.1 mL標(biāo)準(zhǔn)皂苷溶液，于冰水浴中加入濃硫酸1.0 mL，混勻，60 ℃水浴中反應(yīng)30 min，冰浴冷卻后用甲醇定容至10 mL。用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在200～1 000 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描。

1.2.2.3 反應(yīng)溫度

準(zhǔn)確量取0.1 mL標(biāo)準(zhǔn)皂苷溶液，于冰水浴中加入濃硫酸1.0 mL，混勻，分別在20、40、60、80℃、水浴中反應(yīng)30 min，冰浴冷卻后用甲醇定容至10 mL，測(cè)定吸光度。

標(biāo)準(zhǔn)皂苷溶液0.1 mL中加入濃硫酸1 mL，分別在20、40、60、80 ℃水浴中反應(yīng)30 min，反應(yīng)后的吸光度見(jiàn)圖1b。隨著反應(yīng)溫度的升高，吸光度呈增大的趨勢(shì)。20 ℃對(duì)應(yīng)的吸光度明顯低于其他組（P＜0.01），說(shuō)明20 ℃條件下皂苷與濃硫酸反應(yīng)不完全。60 ℃對(duì)應(yīng)的吸光度略高于40 ℃（P＜0.05），60、80 ℃對(duì)應(yīng)的吸光度之間差異不顯著（P＞0.05）。因此，60 ℃適宜作為反應(yīng)溫度。

自主、合作、探究式學(xué)習(xí)是新課程改革所極力倡導(dǎo)的學(xué)習(xí)方式。在這種學(xué)習(xí)方式之下，學(xué)生的自主學(xué)習(xí)是基礎(chǔ)。通過(guò)學(xué)生的自主學(xué)習(xí)，我們才能很準(zhǔn)確地收集學(xué)生在自主學(xué)習(xí)過(guò)程中所遇到的困難，才能為接下來(lái)的“以學(xué)定教”提供教學(xué)決策，使得課堂教與學(xué)沿著正確的方向前進(jìn)。但是課堂教學(xué)是不能僅僅停留在學(xué)生的自主學(xué)習(xí)環(huán)節(jié)的，因?yàn)檫@樣的話學(xué)生只是發(fā)現(xiàn)了問(wèn)題，卻沒(méi)能很好地解決問(wèn)題。因此，從教學(xué)的實(shí)際效果上來(lái)說(shuō)還是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。所以說(shuō)，合作、探究環(huán)節(jié)才是新課程改革之下一堂課的最主要環(huán)節(jié)。通過(guò)這個(gè)環(huán)節(jié)，教師的教學(xué)目標(biāo)才能實(shí)現(xiàn)，課堂教學(xué)的重難點(diǎn)才能得到有效突破，學(xué)生的個(gè)性化學(xué)習(xí)成果也才能有所保障。

目前的小學(xué)英語(yǔ)課標(biāo)沒(méi)有具體規(guī)定小學(xué)階段的音標(biāo)學(xué)習(xí)要到何種程度，教學(xué)目標(biāo)只在于帶領(lǐng)孩子們感受擁有同樣元音發(fā)音規(guī)律的單詞，并沒(méi)有進(jìn)行系統(tǒng)的音標(biāo)教學(xué)?？墒墙鼛啄晷W(xué)英語(yǔ)測(cè)試中開(kāi)始出現(xiàn)音標(biāo)考察題，比如選出劃線部分讀音不同的單詞這種類似的題型，一般是10分的分值，而大部分孩子都會(huì)丟掉4-8分。丟分太多，孩子們紛紛對(duì)音標(biāo)題“發(fā)怵”。

標(biāo)準(zhǔn)皂苷溶液0.1 mL中加入濃硫酸1 mL，在60 ℃水浴中分別反應(yīng)10、20、30、40、50、60 min，反應(yīng)后的吸光度見(jiàn)圖1c。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光度呈增大的趨勢(shì)，30 min以后吸光度趨于平穩(wěn)。因此，反應(yīng)時(shí)間控制為30 min。

圖1 不同濃硫酸用量（a）、反應(yīng)溫度（b）、反應(yīng)時(shí)間（c）條件下的吸光度Fig.1 Absorbance as a function of sulfuric acid dosage (a), reaction temperature (b) and reaction time (c)

2.3 樣品處理?xiàng)l件對(duì)比色結(jié)果的影響

1.2.2 平衡指數(shù)測(cè)定方法 儀器采用以色列Sunlight醫(yī)療器械公司Tetrax平衡測(cè)試系統(tǒng)。平衡指數(shù)是由Tetrax測(cè)得的平衡參數(shù)計(jì)算出的一個(gè)用以表示患者跌倒風(fēng)險(xiǎn)的數(shù)值，這個(gè)值基于各種影響患者平衡的因素。測(cè)定方法簡(jiǎn)單無(wú)傷害，患者站在平衡測(cè)定儀上，通過(guò)8種姿勢(shì)對(duì)患者進(jìn)行測(cè)量，包括在自然站立情況下睜眼、閉眼、頭左右和前后專向，左右腳步同步性和腳下墊有泡沫橡膠腳墊等，5～10 min測(cè)定完畢，由專職治療師完成所有的檢測(cè)。檢查前向受檢者充分解釋檢查目的和注意事項(xiàng)，檢查時(shí)盡量保持檢測(cè)環(huán)境的安靜。測(cè)定結(jié)果以姿勢(shì)的總結(jié)表(BSS)和平衡指數(shù)的形式表示。

圖2 樣品前處理方式對(duì)吸光度的影響Fig.2 Effects of sample pretreatment methods on absorbance

由圖2可知，海星樣品脫色、脫脂及丙酮沉淀處理對(duì)吸光度均有一定的影響，其中活性炭脫色處理影響顯著（P＜0.05），脫脂、丙酮沉淀處理影響均極顯著（P＜0.01）。海星樣品用甲醇提取粗皂苷過(guò)程中，部分脂質(zhì)、色素、游離糖及部分水解苷元等會(huì)一并溶出，且都可能與濃硫酸發(fā)生反應(yīng)，造成吸光度增大，進(jìn)而影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性。Ⅵ組樣品經(jīng)脫色、脫脂、丙酮沉淀處理后，吸光度為0.202，與對(duì)照Ⅰ組的吸光度0.376相比，明顯降低。

貴州中部長(zhǎng)順蘋(píng)果產(chǎn)區(qū)雨水多光照差，建議套袋栽培，有利于果實(shí)著色，隔離藥劑，提高品質(zhì)。而威寧地區(qū)，紫外線強(qiáng)，果面光潔度較差，外觀品質(zhì)差，但能保證果實(shí)品質(zhì)，可根據(jù)市場(chǎng)需求選擇性套袋。建議有技術(shù)條件的區(qū)域進(jìn)行無(wú)袋栽培。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以薯蕷皂苷元作為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。溶液中皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)在2～40 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈線性相關(guān)，其回歸方程式為：Y=0.022X+0.001 8，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8。以吸光度0.01對(duì)應(yīng)的皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為檢測(cè)限，計(jì)算出最低檢測(cè)限為0.37 μg/mL。

2.5 精密度與加標(biāo)回收率精密度實(shí)驗(yàn)和加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1、2。皂苷含量低、中、高3組樣品對(duì)應(yīng)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為

表1 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of precision experiments

表2 樣品加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of spiked recovery experiments

4.71 %、1.61%和1.52%，說(shuō)明方法精密度高、重復(fù)性好。平均加標(biāo)回收率為99.64%（相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.72%），說(shuō)明方法準(zhǔn)確性高。

2.6 多棘海盤(pán)車中皂苷的組織分布

表3 多棘海盤(pán)車各組織中海星皂苷含量（以干基計(jì)）Table 3 Saponin contents in different tissues of Asterias amurensis

采用建立的檢測(cè)方法測(cè)定多棘海盤(pán)車中皂苷的組織分布。由表3可知，體壁、消化腺和生殖腺中皂苷含量有極顯著差異（P＜0.01）。其中，消化腺中皂苷含量最高，其次是體壁和生殖腺。

3 討 論

多棘海盤(pán)車中皂苷組織分布的檢測(cè)結(jié)果與Kicha等[11]研究結(jié)果類似，Kicha等[11]采用高效液相色譜法測(cè)得海燕（Asterina pectinifera）中甾體物質(zhì)含量的分布規(guī)律為：幽門盲囊＞胃＞體壁＞性腺。郭承華等[12]測(cè)得羅氏海盤(pán)車幽門盲囊、胃、體壁、生殖腺的皂苷含量分別為4.16、3.04、1.54、0.24 mg/g，同樣是幽門盲囊中含量最高。Garneau等[13]測(cè)得北極海星（Leptasterias polaris）中皂苷含量分布規(guī)律為：胃＞幽門盲囊＞體壁＞性腺。這些研究均表明海星消化腺（胃、幽門盲囊）中具有較高的皂苷含量，這種現(xiàn)象可能與海星獨(dú)特的生理有關(guān)，相關(guān)機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

不同的海星種類，其皂苷含量有較大差異。如郭承華等[12]測(cè)得羅氏海盤(pán)車和海燕中的皂苷含量分別為0.70 mg/g和5.17 mg/g。即使同一種類的海星，其皂苷含量也可能因?yàn)榈乩矸植?、生長(zhǎng)季節(jié)等因素存在差別。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，渤海產(chǎn)多棘海盤(pán)車整體皂苷含量為3.65 mg/g，這一結(jié)果與王長(zhǎng)云等[5]測(cè)得多棘海盤(pán)車粗總皂苷含量為0.077%的結(jié)論有很大差異。這種差異一方面與樣品的地域性、季節(jié)性有關(guān)，更重要的可能與測(cè)定過(guò)程采用的方法不同有關(guān)。如張立新等[14]采用香草醛-硫酸顯色方法，測(cè)得海燕中的皂苷含量為0.313 mg/g，這一結(jié)果與郭承華等[12]采用甲醇提取、干燥后稱重法測(cè)定的海燕皂苷含量5.17 mg/g相差十余倍。

海星中的皂苷在化學(xué)結(jié)構(gòu)上多屬于甾體皂苷，香草醛-硫酸顯色法適用于典型的三萜皂苷，用該方法測(cè)定海星中的甾體皂苷時(shí)會(huì)因?yàn)椴萑╋@色后在可見(jiàn)光區(qū)沒(méi)有明顯的吸收峰而導(dǎo)致結(jié)果偏低。而稱重法過(guò)程繁瑣，測(cè)定周期長(zhǎng)。相對(duì)而言，比色法更為快速、簡(jiǎn)便，對(duì)比色條件進(jìn)行優(yōu)化后準(zhǔn)確率也較高，完全可以滿足日?？蒲械男枰?。

選用高產(chǎn)抗病蟲(chóng)良種，供試水稻品種為湘優(yōu)109、威優(yōu)431、協(xié)優(yōu)57、宜香481和川江優(yōu)527等，實(shí)行種子處理，采取旱育稀植，培育無(wú)病蟲(chóng)壯秧。進(jìn)行行規(guī)范化寬窄行栽插，合理施肥，科學(xué)管理，水稻生產(chǎn)全程實(shí)行健身控害栽培，嚴(yán)禁使用化學(xué)除草劑，創(chuàng)造有利于稻、鴨良好的生存條件。

4 結(jié) 論

采用分光光度法可以準(zhǔn)確測(cè)定海星中的皂苷含量。優(yōu)化后的提取和前處理?xiàng)l件為：海星干粉按照0.05 g/mL的比例加入甲醇，超聲提取60 min，過(guò)濾；濾液中按照0.01 g/mL的比例加入活性炭脫色，之后按照1∶2（V/V）的比例加入石油醚脫除脂質(zhì)，收集下層液體加入5 倍體積丙酮，8 000 r/min離心20 min后，棄上清液，黃色沉淀物用甲醇溶解并定容至100 mL，比色。優(yōu)化后的比色條件為取上述皂苷溶液0.5 mL，冰浴條件下加入濃硫酸1.0 mL，60 ℃條件下反應(yīng)30 min，冰浴冷卻，甲醇定容至10 mL；在271 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。精密度和加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)表明，該方法可以快速、準(zhǔn)確測(cè)定海星總皂苷含量。采用上述方法測(cè)得多棘海盤(pán)車皂苷含量為3.65 mg/g（以干基計(jì)），其中消化腺中皂苷含量最高，其次是體壁和生殖腺。

[1] 廖玉麟, 由香莉. 海盤(pán)車[J]. 生物學(xué)通報(bào), 2002, 37(11): 25-27.

[2] 郝林華, 李八方. 多棘海盤(pán)車營(yíng)養(yǎng)成分的研究[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 1998, 22(4): 385-388.

[3] 劉鐵錚, 郭愛(ài)潔, 王桂春, 等. 海星化學(xué)成分的生物活性及應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 38(13): 122-125.

[4] ANDERSSON L, BOHLIN L, IORIZZI M, et al. Biological activity of saponins and saponin-like compounds from starfi sh and brittle-stars[J]. Toxicon, 1989, 27(2): 179-188.

[5] 王長(zhǎng)云, 顧謙群. 多棘海盤(pán)車用作新型海洋食品原料的可行性研究[J].中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 1999, 6(4): 67-71.

[6] 陳方, 宋海峰. 皂苷分析方法研究進(jìn)展[J]. 天津中醫(yī)藥, 2005, 22(3): 257-258.

[7] 郭萬(wàn)成, 劉麗娟, 張翠仙, 等. 海星中的皂甙和多羥基甾體化合物[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā), 2005, 17(1): 108-114.

[8] IORIZZI M, de MARINO S, MINALE L, et al. Investigation of the polar steroids from an Antarctic Starfi sh of the family (Echinasteridae): isolation of twenty seven polyhydroxysteroids and steroidal oligoglycosides, structures and biological activities[J]. Tetrahedron, 1996, 52(33): 10997-11012.

[9] 文震, 朱志鑫, 申德妍, 等. 紫外分光光度法測(cè)定海星皂甙的含量[J].分析科學(xué)學(xué)報(bào), 2004, 20(6): 592-594.

[10] 王榮鎮(zhèn), 黨永龍, 馮建榮, 等. 正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化紫蛇尾皂苷提取工藝研究[J]. 海洋科學(xué), 2012, 36(2): 46-49.

[11] KICHA A A, IVANCHINA N V, GORSHKOVA I A, et al. The distribution of free sterols, polyhydroxysteroids and steroid glycosides in various body components of the starfish Patiria (=Asterina) pectinifera[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology, 2001, 128(1): 43-52.

[12] 郭承華, 高學(xué)良, 呂建剛, 等. 羅氏海盤(pán)車組織中海星皂甙的分布及活性研究[J]. 黃渤海海洋, 2000, 18(2): 56-60.

[13] GARNEAU F X, HARVEY C, SIMARD J L, et al. The distribution of asterosaponins in various body components of the starfish (Leptasterias polaris)[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry, 1989, 92(2): 411-416.

[14] 張立新, 薛峰, 趙愛(ài)云, 等. 海星中皂苷總含量測(cè)定方法的研究[J].食品科學(xué), 2007, 28(1): 243-246.

Optimization of Experimental Conditions for the Analysis of Tissue Distribution of Saponin in Asterias amurensis

CAO Rong1, ZHANG Yuan2, ZHAO Ling1, YIN Bang-zhong1, LIU Qi1,*
(1. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Zhangzidao Group Co. Ltd., Dalian 116001, China)

The objective of this study was to establish a rapid, simple and accurate colorimetric method for the determination of saponin in starfi sh. Asterias amurensis was selected as the raw materials. The effects of colorimetric conditions such as sulfuric acid dosage, reaction temperature and reaction time as well as sample preparation procedures such as decoloration and degreasing on saponin determination were analyzed. It was shown that addition of sulfuric acid in a proportion of 10% (V/V) and reaction temperature at 60 ℃ for 30 min were suitable colorimetric conditions, and the pretreatment steps decoloration, degreasing and acetone precipitation could signifi cantly improve the accuracy of determination. The results of precision and spiked recovery experiments showed that RSDs (relative standard deviations) for three groups with low, medium and high saponin contents were 4.71%, 1.61% and 1.52%, respectively, and the average recovery was 99.64%. Asterias amuren sis was detected to contain 3.65 mg/g saponin (dry basis). The digestive gland of Asterias amurensis showed the highest saponin content, followed by the body wall and gonad.

saponin; Asterias amurensis; colorimetric method

TS254.7

A

1002-6630（2014）24-0174-04

10.7506/spkx1002-6630-201424033

2014-02-17

中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（20603022011005）

曹榮（1981—），男，副研究員，博士，主要從事水產(chǎn)品品質(zhì)評(píng)定與控制技術(shù)研究。E-mail：caorong@ysfri.ac.cn

*通信作者：劉淇（1965—），男，研究員，本科，主要從事水產(chǎn)品加工研究。E-mail：liuqi@ysfri.ac.cn