易菊陽，梁鈺婷，陸 兵，吳 昊，黃桂華，陳桂光，梁智群*

（廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，亞熱帶農(nóng)業(yè)資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 53000 4）

高產(chǎn)α-葡萄糖苷酶黑曲霉的微波選育及發(fā)酵條件優(yōu)化

易菊陽，梁鈺婷，陸 兵，吳 昊，黃桂華，陳桂光，梁智群*

（廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，亞熱帶農(nóng)業(yè)資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 53000 4）

采用微波誘變技術(shù)對(duì)黑曲霉J2進(jìn)行選育，得到1株α-葡萄糖苷酶活力較高的突變菌株ANY-4，酶活力達(dá)到305 U/mL，比 出發(fā)菌株提高了38.6%，且穩(wěn)定性良好。通過單因素和正交試驗(yàn)得到最適培養(yǎng)條件為：玉米淀 粉80 g/L、玉米漿干粉40 g/L、初始pH 4.5、裝液量50 mL/500 mL、接種量3%、培養(yǎng)溫度36 ℃、搖床轉(zhuǎn)速240 r/min、培養(yǎng)時(shí)間40 h。在最優(yōu)培養(yǎng)條 件下進(jìn)行發(fā) 酵，α-葡萄糖苷酶活力達(dá)到427 U/mL，比優(yōu)化前提高了40%。

α-葡萄糖苷酶；微波誘變；黑曲霉；發(fā)酵條件優(yōu)化

α-葡萄糖苷酶（α-D-glucoside glucohydrolase）又稱α-葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶，不僅能切割多糖非還原端的α-葡萄糖苷鍵產(chǎn)生α-D-葡萄糖[1]，還能將低聚糖中的α-1,4-糖 苷鍵切開并在分子內(nèi)轉(zhuǎn)化成α-1,6-糖苷鍵[2]，從而生成異麥芽糖、潘糖、異麥芽三糖等功能性糖。α-葡萄糖苷酶種類多樣，廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中，其中黑曲霉和米曲霉產(chǎn)酶較高[3-4]。

α-葡萄糖苷酶是生產(chǎn)低聚異麥芽糖的關(guān)鍵酶[5]，而低聚異麥芽糖具有優(yōu)越的理化特性和生理功能，如調(diào)節(jié)腸道有益菌群和增殖雙岐桿菌[6-7]、抑制大腸桿菌[8]、提高免疫力[9]，因而被廣泛用于食品、醫(yī)藥、保健及飼料等行業(yè)。但目前國(guó)內(nèi)缺少大量廉價(jià)的酶源供應(yīng)，生產(chǎn)低聚異麥芽糖所用的α-葡萄糖苷酶不得不依賴進(jìn)口，多為日本天野酶制劑公司提供[10]，且價(jià)格昂貴約40萬元/噸[11]。國(guó)外學(xué)者在α-葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌種的選育、酶的分離純化、酶學(xué)性質(zhì)及固定化等[12-13]方面做了大量的研究工作，但國(guó)內(nèi)鮮有α-葡萄糖苷酶商品化的相關(guān)報(bào)道。

從以往的文獻(xiàn)報(bào)道來看，α-葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌種的選育方式主要集中在傳統(tǒng)的紫外誘變、氯化鋰誘變、Co60誘變、離子注入誘變、化學(xué)誘變及以上多種方法的聯(lián)合誘變方面[14-17]，采用微波誘變技術(shù)選育α-葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌株的相關(guān)報(bào)道較少。微波誘變所需設(shè)備簡(jiǎn)單、方法易行、操作安全、誘變效果較好[18-20]。本實(shí)驗(yàn)采用微波誘變技術(shù)，對(duì)α-葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌黑曲霉J2進(jìn)行誘變選育，通過優(yōu)化發(fā)酵條件，以期獲得酶活力大幅提高的突變菌株。

1 材料與方法

1.1 菌種、試劑與培養(yǎng)基

黑曲霉（Aspergillus niger）J2由本實(shí)驗(yàn)室成員野外篩選所得。

高溫α-淀粉酶、高溫β-淀粉酶 廣西南寧東恒華道生物；玉米淀粉 山東西王集體淀粉廠；玉米漿干粉山東康源生物科技有限公司；葡萄糖、麥芽糖、臺(tái)盼藍(lán)美國(guó)Sigma公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

平板培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g/L、葡萄糖5 g/L、氯化鈉35 g/L、瓊脂20 g/L、臺(tái)盼藍(lán)0.2 g/L、麩皮浸汁3%（體積分?jǐn)?shù)），自然pH值，121 ℃滅菌20 min。

麩皮孢子培養(yǎng)基：麩皮4 g、蒸餾水2 mL，250 mL三角瓶，121 ℃滅菌20 min。

初篩培養(yǎng)基：麩皮30 g/L（沸水熬煮30 min，4 層紗布過濾去渣）、麥芽糖200 g/L，pH 4.5，115 ℃滅菌30 min。

復(fù)篩培養(yǎng)基：麩皮30 g/L（沸水熬煮30 min，4層紗布過濾去渣）、玉米淀粉45 g/L，pH 4.5，115 ℃滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米淀粉45 g/L、玉米漿干粉30 g/L，pH值自然，115 ℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

G80F23CN1P-G5（SO）微波爐 格蘭仕微波爐電器有限公司；UV-1601紫外分光光度計(jì) 日本Shimadzu公司；HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司；SPX-250生化培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 孢子懸液的制備

接2環(huán)孢子于麩皮培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)2 d，翻曲后再培養(yǎng)1 d，獲得孢子。再往長(zhǎng)滿孢子的三角瓶里加入適量無菌生理鹽水，用無菌玻璃棒攪拌均勻。將攪拌后的混合物轉(zhuǎn)移到過濾裝置中，用2層紗布過濾，收集粗濾液。然后將粗濾液轉(zhuǎn)移到搖床中，用玻璃珠振蕩打散孢子。再用4層紗布細(xì)濾孢子液，調(diào) 整孢子濃 度至106個(gè)/mL，得孢子懸液。

1.3.2 微波誘變實(shí)驗(yàn)

分別將5 mL（濃度106個(gè)/mL）孢子懸液置于潔凈的無菌試管中，套上試管帽。將試管斜置于裝滿冰水混合物的1 L燒杯內(nèi)，移置微波爐中，分別在功率為160、320、480、640、800 W下進(jìn)行誘變實(shí)驗(yàn)，每隔1 min（間隔時(shí)間由預(yù)實(shí)驗(yàn)確定）換冰1 次，以消除熱效應(yīng)對(duì)孢子的致死作用，按此方法確定輻射功率對(duì)致死率和突變率的影響。確定誘變功率后，設(shè)置輻照時(shí)間梯度1、2、3、4、5、6、7、8、9 min，考察誘變時(shí)間對(duì)致死率和突變率的影響。每次實(shí)驗(yàn)需將輻照后的孢子懸液置于4 ℃的冰箱避光冷藏2 h，然后再涂布平板恒溫培養(yǎng)。

1.3.3 菌株篩選

初篩：將微波輻照后的孢子懸液分別進(jìn)行10-1、10-2、10-3、10-4梯度稀釋，用稀釋后的懸液涂布平板，于37 ℃培養(yǎng)2 d，計(jì)算致死率。按高通量篩 選模型[21]對(duì)突變情況作出評(píng)價(jià)，并計(jì)算突變率。

式中：對(duì)照組不經(jīng)微波輻照，實(shí)驗(yàn)組經(jīng)微波輻照，突變菌株包括正突變菌株和負(fù)突變菌株；正突變菌株指實(shí)驗(yàn)組中相對(duì)于對(duì)照組酶活力提高的菌株；負(fù)突變菌株是實(shí)驗(yàn)組中相對(duì)于對(duì)照組酶活力降低的菌株。

搖瓶復(fù)篩：分別將初篩得到的正突變菌進(jìn)行活化和孢子培養(yǎng)，并制備106個(gè)/mL的孢子懸液，再分別吸取2 mL接種于裝液量為80 mL/500 mL復(fù)篩培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min培養(yǎng)36 h后，抽濾收集菌絲，用菌絲進(jìn)行轉(zhuǎn)苷反應(yīng)，檢測(cè)并計(jì)算酶活力。

1.3.4 突變菌株遺傳穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

將復(fù)篩得到的突變菌株連續(xù)傳代8 次，檢測(cè)并計(jì)算酶活力，考察其遺傳穩(wěn)定性。

1.3.5 α-葡萄糖苷酶發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

1.3.5.1 碳源對(duì)酶活力的影響

以體積分?jǐn)?shù)3%的麩皮浸汁為氮源，分別考察添加量為60 g/L的葡萄糖、乳糖、D-果糖、麥芽糖、木糖、蔗糖、小麥淀粉、木薯淀粉、玉米淀粉、可溶性淀粉等10 種碳源對(duì)酶活力的影響。其 中，小麥淀粉、木薯淀粉、玉米淀粉、可溶性淀粉在使用前需用高溫α-淀粉酶和高溫β-淀粉酶進(jìn)行水解，裝液量為80 mL/500 mL。確定最佳碳源后，按添加量20、30、40、50、60、70、80、90、100 g/L進(jìn)行優(yōu)化，接種量2%，每一梯度做3組平行，考察其對(duì)酶活力的影響。

1.3.5.2 氮源對(duì)酶活力的影響

以45 g/L的玉米淀粉為碳源，分別考察了添加量為30 g/L的氯化銨、硫酸銨、磷酸二氫銨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、玉米漿干粉等8 種氮源對(duì)酶活力的影響。并對(duì)最佳氮源按添加量10、20、30、40、50、60、70、80 g/L進(jìn)行優(yōu)化。其裝液量為80 mL/500 mL接種量為2%，每一梯度做3 組平行，考察其對(duì)酶活力的影響。

1.3.5.3 初始pH值對(duì)酶活力的影響

取500 mL三角瓶分別裝入80 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，用5 mol/L的NaOH溶液或鹽酸溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH值，建立pH 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0的梯度，每個(gè)梯度3 組平行，滅菌后加入1.6 mL種子液，考察其對(duì)酶活力的影響。

1.3.5.4 裝液量對(duì)酶活力的影響

取500 mL三角瓶分別裝入15、30、50、80、100、120、140、160、180 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，每組3 個(gè)平行樣，滅菌后分別接入2%的種子液，考察其對(duì)酶活力的影響。1.3.5.5 接種量對(duì)酶活力的影響

取500 mL三角瓶分別裝入80 mL發(fā)酵培養(yǎng)基。滅菌后按1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%接入種子液，每組3 個(gè)平行樣，考察其對(duì)酶活力的影響。

1.3.5.6 培養(yǎng)溫度對(duì)酶活力的影響

取500 mL三角瓶分別裝入80 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌后加入1.6 mL種子液，分別考察溫度28、30、32、34、37、40、42 ℃對(duì)酶活力的影響，每組3 組平行樣。

1.3.5.7 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)酶活力的影響

取500 mL三角瓶若干，分別裝入80 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌后加入1.6 mL種子液，分別考察轉(zhuǎn)速140、160、180、200、220、240 r/min對(duì)酶活力的影響，每組3組平行樣。

1.3.5.8 培養(yǎng)時(shí) 間對(duì)酶活力的影響

取500 mL三角瓶分別裝入80 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌后加入1.6 mL種子液，每8 h取樣檢測(cè)1 次，考察培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酶活力的影響。

1.3.6 α-葡萄糖苷酶發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

通過單因素試驗(yàn)可發(fā)現(xiàn)，在較大范圍內(nèi)，接種量、玉米淀粉與玉米漿干粉添加量對(duì)酶活力影響較??；當(dāng)搖床達(dá)到一定轉(zhuǎn)速后，酶活力上升平緩。而初始pH值、裝液量、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酶活力的影響都呈現(xiàn)出波峰狀，這表明酶活力對(duì)這些因素敏感，需嚴(yán)格控制。選擇初始pH值、裝液量、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行正交優(yōu)化，能為后續(xù)的上罐放大實(shí)驗(yàn)提供一定參考?；诖耍M(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 微波輻照功率對(duì)黑曲霉J2的誘變效果

將黑曲霉J2孢子懸液按微波輻照方法，分別置于不同功率下進(jìn)行誘變實(shí)驗(yàn)，其致死率和正突變率見圖1。孢子輻照致死率隨微波功率的遞增呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。隨著輻照功率的不斷增大，正突變率先增大后減小，當(dāng)處理功率為640 W時(shí)，正突變率達(dá)到最大值80%，隨后正突變率降低。因此，后續(xù)輻照實(shí)驗(yàn)選擇640 W進(jìn)行處理。

圖1 微波輻照功率對(duì)致死率和突變率的影響Fig.1 Effect of microwave power on the death rate and mutation rate of spores

2.2 微波輻照時(shí)間對(duì)黑曲霉J2的誘變效果

將黑曲霉J2孢子懸浮液置于功率為640 W的微波爐中進(jìn)行輻照，不同處理時(shí)間下致死率和突變率的情況見圖2。

圖2 微波輻照時(shí)間對(duì)致死率和突變率的影響Fig.2 Effect of microwave irradiation time on the death rate and mutation rate of spores

由圖2可知，在640 W輻照條件下，孢子致死率隨著輻照時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，在0～2 min致死幅度較小，2～6 min致死幅度明顯加大，6～9 min致死幅度降低但總體致死率很高。輻照6 min時(shí)致死率達(dá)到了87%，輻照9 min時(shí)致死率高達(dá)98%。孢子正突變率隨輻照時(shí)間的增加，呈現(xiàn)先增長(zhǎng)后降低的趨勢(shì)。輻照5 min時(shí)正突變率達(dá)到了84%，輻照6 min時(shí)正突變率達(dá)到了最大值89%。因此，選擇6 min為最佳微波輻照時(shí)間。

2.3 突變菌株遺傳穩(wěn)定性比較

通過對(duì)5 872 株菌進(jìn)行初篩，并對(duì)56 株菌進(jìn)行復(fù)篩得到4 株酶活力相對(duì)較高的突變菌株，編號(hào)命名為ANY-1、ANY-2、ANY-3和ANY-4。將該4株突變菌株與原菌J2對(duì)照進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。其結(jié)果見圖3。

圖3 突變菌株遺傳穩(wěn)定性Fig.3 Genetic stabili ty of the mutant strains

由圖3可知，4 株突變菌株的總體酶活力高于出發(fā)菌株J2，但ANY-1和ANY-2在傳代的過程中酶活力波動(dòng)較大且呈下降趨勢(shì)，ANY-3和ANY-4傳代過程中酶活力相對(duì)穩(wěn)定。相比較而言ANY-4總體酶活力集中在300 U/mL，顯然高于ANY-3的酶活力，且表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。因此，ANY-4即為最終篩選所得的目的菌株。

2.4 發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果

2.4.1 碳源對(duì)酶活力的影響

圖4 碳源種類（A）及玉米淀粉添加量（B）對(duì)酶活力的影響Fig.4 Effects of carbon sources (A) and corn starch concentration ( B) on α-glucosidase activity

由圖4A可知，不同碳源對(duì)ANY-4產(chǎn)α-葡萄糖苷酶酶活力影響明顯。以麥芽糖、木薯淀粉、玉米淀粉和可溶性淀粉為碳源時(shí)，ANY-4酶活力較高，其中以玉米淀粉作為碳源時(shí)酶活力達(dá)到最高值305 U/mL。由圖4B可知，ANY-4酶活力隨著玉米淀粉添加量的增加先上升再趨于平穩(wěn)最后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，其中添加量在40～90 g/L時(shí)酶活力相對(duì)較高，當(dāng)添加量大于90 g/L時(shí)酶活力出現(xiàn)降低趨勢(shì)。因此，應(yīng)選玉米淀粉作為最佳碳源，其最佳添加量為80 g/L。

2.4.2 氮源對(duì)酶活力的影響

圖5 氮源種類（A）及玉米漿干粉添加量（B）對(duì)酶活力的影響Fig.5 Effects of nitrogen sources (A) and corn steep liquor concentration (B) on α-glucosidase activity

由圖5A可知，不同氮源對(duì)ANY-4產(chǎn)α-葡萄糖苷酶酶活力影響較大。在所考察的多種氮源中，玉米漿干粉對(duì)ANY-4產(chǎn)酶有明顯的促進(jìn)作用，其酶活力可達(dá)到308 U/mL。以氯化銨、硫酸銨、磷酸二氫銨、酵母膏等為氮源，ANY-4酶活力很低。由圖5B可知，酶活力隨玉米漿干粉添加量的增加先升高后降低，添加量在40～60 g/L時(shí)酶活力相對(duì)較高且趨于平穩(wěn)，最高酶活力達(dá)到了348 U/mL。因此，選用添加量為40 g/L的玉米漿干粉作為最佳氮源。

2.4.3 初始pH值對(duì)酶活力的影響

圖6 初始pH值對(duì)酶活力的影響Fig.6 Effect of initial pH on α-glucosidase activity

由圖6可知，不同初始pH值對(duì)ANY-4產(chǎn)α-葡萄糖苷酶酶活力影響明顯。隨著初始pH值不斷加大，酶活力先增加后降低，當(dāng)pH值在4～5范圍內(nèi)表現(xiàn)出較高酶活，其中最高酶活力達(dá)到了363 U/mL。當(dāng)pH＞5時(shí)，酶活力大幅度降低。因此，pH 4.5為ANY-4菌株最適pH值。

2.4.4 裝液量對(duì)酶活力的影響

圖7 裝液量對(duì)酶活力的影響Fig.7 Effect of fermentation medium volume on α-glucosidase activity

由圖7可知，裝液量過小或過大都不利于產(chǎn)酶，最佳裝液量為50 mL/500 mL。裝液量過小，培養(yǎng)基養(yǎng)料相對(duì)不足，難以滿足菌生長(zhǎng)所需；裝液量過大，阻礙了發(fā)酵過程中的通氣和溶氧，致使菌體生長(zhǎng)緩慢、產(chǎn)酶過低。

2.4.5 接種量對(duì)酶活力的影響

圖8 接種量對(duì)酶活力的影響Fig.8 Effect of inoculum volume on α-glucosidase activity

由圖8可知，接種量從1%到9%對(duì)酶活力的影響總體不大，當(dāng)接種量為3%時(shí)有最大酶活力398 U/mL。因此，確定3%為搖瓶發(fā)酵最佳接種量。

2.4.6 發(fā)酵溫度對(duì)酶活力的影響

圖9 發(fā)酵溫度對(duì)酶活力的影響Fig.9 Effect of fermentation temperature on α-glucosidase activity

由圖9可知，隨著發(fā)酵溫度不斷升高，酶活力先升高后降低，在36 ℃時(shí)酶活力達(dá)到最大值387 U/mL。發(fā)酵溫度從28 ℃提高到36 ℃的過程中，酶活力上升幅度明顯。當(dāng)發(fā)酵溫度高于38 ℃后，酶活力迅速降低，42 ℃酶活力低至123 U/mL。因此，最佳發(fā)酵溫度為36 ℃。

2.4.7 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)酶活力的影響

由圖10可知，隨著搖床轉(zhuǎn)速的提高，酶活力呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，當(dāng)轉(zhuǎn)速提高到240 r/min時(shí)酶活力達(dá)到392 U/mL。由于實(shí)驗(yàn)室搖床轉(zhuǎn)速的限制，無法獲知更高轉(zhuǎn)速條件下酶活力的變化趨勢(shì)，基于黑曲霉為好氧菌的特性，因此做出以下推斷：當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速繼續(xù)增大時(shí)，酶活力還會(huì)相應(yīng)提高，但任何一個(gè)發(fā)酵體系其溶氧量是有限的，因此當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速提高到其飽和溶氧量后酶活力不再上升，達(dá)到最大值。

2.4.8 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酶活力的影響

圖11 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酶活力的影響Fig.11 Effect of cultivation time on α-glucosidase activity

由圖11可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，酶活力先上升后下降，在培養(yǎng)40 h左右出現(xiàn)最大酶活力。

2.5 正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 1 Results and range analysis of orthogonal array design experiments for optimizing fermentation conditions of ANY-4

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 2 Variance analysis of orthogonal array design experiments for optimizing fermentation conditions of ANY-4

由表1極差分析結(jié)果可知，影響發(fā)酵產(chǎn)α-葡萄糖苷酶的因素依次為：裝液量＞初始pH值＞培養(yǎng)時(shí)間＞發(fā)酵溫度。優(yōu)選組合為A2B2C2D2，在此條件下進(jìn)行發(fā)酵，酶活力可達(dá)到427 U/mL。由表2方差分析結(jié)果可知，初始pH值和裝液量對(duì)酶活力的影響顯著，培養(yǎng)時(shí)間和溫度影響不顯著。菌株ANY-4產(chǎn)α-葡萄糖苷酶最適條件為：玉米淀粉80 g/L、玉米漿干粉40 g/L、初始pH 4.5、接種量3%、裝液量50 mL/500 mL、36 ℃、240 r/min、培養(yǎng)40 h。

3 討論與結(jié)論

微波是一種穿透力極強(qiáng)的電磁波，能使水分子、核苷酸等極性分子高速旋轉(zhuǎn)。在2 450 MHz頻率下，微波能使水分子在1 s內(nèi)180°來回轉(zhuǎn)動(dòng)24.5×108次，由于分之間的強(qiáng)烈摩擦，使得細(xì)胞內(nèi)DNA分子的氫鍵和堿基受損，從而導(dǎo)致遺傳變異。微波誘變育種在很多領(lǐng)域已經(jīng)取得一定成效。潘麗霞等[22]利用微波誘變成功選育出1株利用木糖產(chǎn)油酵母，其產(chǎn)油能力是原始菌株的2.56 倍。王勇等[23]采用微波誘變技術(shù)對(duì)啤酒酵母出發(fā)菌株SY-9進(jìn)行處理，得到1 株適量低產(chǎn)SO2的新菌株。朱莉娜等[24]采用微波誘變技術(shù)對(duì)啤酒酵母進(jìn)行誘變，得到1株適量低產(chǎn)高級(jí)醇啤酒酵母新菌株。梅林等[25]對(duì)枯草芽孢桿菌菌株進(jìn)行微波誘變處理，得到1 株穩(wěn)定性良好菌株，凝乳酶活力達(dá)到516.12 U/g，比出發(fā)菌株提高了29%。馬勇等[26]通過微波誘變成功選育出1 株產(chǎn)油酵母菌。徐偉等[27]利用微波輻照誘變成功選育了1 株高產(chǎn)橙色素且性狀穩(wěn)定的紅曲霉菌。因此，利用微波誘變對(duì)α-葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌株進(jìn)行選育具有可行性。

本實(shí)驗(yàn)采用微波誘變技術(shù)對(duì)黑曲霉J2進(jìn)行誘變。通過初篩、復(fù)篩及穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，從而獲得了一株名為ANY-4，酶活力較高且遺傳穩(wěn)定的優(yōu)良菌株。其 酶活力達(dá)到了305 U/mL，相對(duì)出發(fā)菌株220 U/mL的酶活力提高了38.6%。后經(jīng)單因素試驗(yàn)和正交優(yōu)化試驗(yàn)，酶活力進(jìn)一步提高到427 U/mL，相對(duì)優(yōu)化前提高了40%，優(yōu)化效果明顯。因此，微波誘變能有效選育出高產(chǎn)α-葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株。

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Microwave Breeding of Aspergillus niger with High α-Glu cosidase Activity and Optimization of Its Fermentation Conditions

YI Ju-yang, LIANG Yu-ting, LU Bing, WU Hao, HUANG Gui-hua, CHEN Gui-guang, LIANG Zhi-qun*
(State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-Bioresources, College of Life Science and Technology, Guangxi University, Nanning 530004, China)

α-Glucosidase is the key enzyme involved in the production of isomaltoligosaccharides which are widely applied in the food, medicine, health care and feed industries. A mutant Aspergillus strain named ANY-4, with high α-glucosidase activity and good genetic stability, was obtained from Aspergillus niger J2 via micro wave-induced mutation. Its enzymatic activity was 305 U/mL, which was 38.6 % higher than that of Aspergillus niger J2. To produce α-glucosidase with a high yield, single factor experiments and orthogonal array design methods were performed to determine the optimal fermentation conditions as follows: corn starch 80 g/L, corn steep liquor powde r 40 g/L, initial pH 4.5, fermentation medium volume 50 mL in 500 mL flasks, i noculum quantity 3% (V/V), 36 ℃, 240 r/min and fermentation for 40 h. Under these conditions, the α-glucosidase activity was 427 U/mL, which was increased by 40% as compared to that obtained before optimization.

α-glucosidase; microwave mutagenesis; Aspergillus niger; optimization

Q815

A

1002-6630（2014）15-0145-06

10.7506/spkx1002-6630-201415030

2013-10-10

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目（2006AA10Z339）；國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目（20362001）

易菊陽（1987—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸锕こ獭-mail：jyyi2011@163.com

*通信作者：梁智群（1959—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸?。E-mail：zqliang@gxu.edu.cn