趙雨亭 四川大學生命科學學院

污染土壤中功能性菌種的分離與鑒定

趙雨亭 四川大學生命科學學院

從污染土壤中分離純化出3種具有降解原油作用的土著活性菌種S1、S2、S3，其中S1和S2菌種為芽孢桿菌，S3菌種為葡萄球菌。與進口生物修復劑Oil—Gator中分離出的OG菌種相比，S2菌種原油降解能力優(yōu)于OG菌種，S1菌種與之相當，S3稍弱。為保證菌劑中菌種的多樣性，使其能夠有效地抵抗環(huán)境的沖擊，確定菌劑培養(yǎng)方式為S1～S3混合培養(yǎng)。

污染土壤；土著微生物；菌種；降解試驗

污染土壤中存在著可降解石油烴的微生物，它們對環(huán)境的適應性強且污染過程中已經(jīng)歷一段自然馴化期，因而是生物降解的首選菌種。本試驗以長期被石油污染的土壤中的微生物為菌源，從中分離純化出高效的具有原油降解作用的菌種。對分離得到的菌種開展菌種降解原油試驗，通過比較原油去除率篩選出功能性菌種，并與進口藥劑Oil—Gator進行除油效果對比。

1 菌種分離純化

取大慶油田北I—2聯(lián)合站附近污油回收池邊10cm表層土壤，用于菌種的分離篩選工作。菌種富集、分離和純化過程如下：取5g原油污染土壤樣品（或1g污油降解素）置于液體LB富集培養(yǎng)基中，在30℃、200r/min的條件下液體富集培養(yǎng)；連續(xù)培養(yǎng)4代，每代培養(yǎng)至指數(shù)生長末期后以1%～2%的接種量進行轉(zhuǎn)接；當最后一代培養(yǎng)結(jié)束后，用微量移液器移取50μL細胞培養(yǎng)液涂布于平板培養(yǎng)基上，為確保獲得高度分散的單菌落，采用連續(xù)涂布的方法，共涂布5塊平板；平板置于30℃環(huán)境中，經(jīng)過約28～32h培養(yǎng)后形成單菌落；根據(jù)單菌落的外觀形態(tài)（包括菌落形狀、顏色、中央隆起程度、邊緣形狀及透明程度等感官指標），選取優(yōu)勢生長、數(shù)量居多、形態(tài)不同并且高度分散的單菌落至LB營養(yǎng)瓊脂斜面上畫線培養(yǎng)；待斜面上形成菌苔后置于4℃冰箱中保存、備用；革蘭氏染色、鏡鑒，判斷斜面是否為純菌；不純菌株通過平板畫線或液體富集培養(yǎng)后涂布進行二次純化。最終，從土著微生物中共分離出8支純培養(yǎng)微生物菌株，編碼序號為S1～S8。

2 菌種功能特性試驗

對從土壤中分離出來的8支菌種S1～S8及從Oil—Gator中分離出來的5支菌種OG1～OG5進行原油降解試驗。試驗主要分為菌種活化、降解原油、取樣檢測分析三個階段。

經(jīng)過120h的原油降解試驗，測定含油量，計算各菌種原油降解率，每個菌種平行測定3～5次。試驗結(jié)果表明，OG1～OG5菌種原油降解能力接近，降解率在9.1%～9.42%之間浮動；S1～S8菌種原油降解能力差別較大，其中S2菌種效果最佳，優(yōu)于OG進口藥劑中菌種的降油能力，S1菌種與之相當，S3稍弱。S4～S8菌種原油降解能力較差。

選取S1、S2、S3菌種作為土著活性菌種進行混合培養(yǎng)后，考察其原油降解率。試驗結(jié)果表明，用S1～S3菌種混合培養(yǎng)方式進行的原油降解試驗，其原油降解率達到9.48%，僅次于用S2菌種單獨培養(yǎng)方式的原油降解能力。

取S1～S3菌種，委托天津科技大學生物工程學院發(fā)酵工程國家重點實驗室進行菌種鑒定。試驗結(jié)果表明，Oil—Gator中分離出的5支菌種OG1～OG5菌均為奧德賽芽胞桿菌，S1菌為蠟樣芽胞桿菌，S2菌為溶血不動桿菌，S3菌為克氏葡萄球菌。

3 結(jié)語

（1）從污染土壤中分離純化出3種具有降解原油作用的土著活性菌種S1、S2、S3，其中S1和S2菌種為芽孢桿菌，S3菌種為葡萄球菌。

（2）與進口生物修復劑Oil—Gator中分離出的OG菌種相比，S2菌種原油降解能力優(yōu)于OG菌種，S1菌種與之相當，S3稍弱。

（3）為保證菌劑中菌種的多樣性，使其能夠有效地抵抗環(huán)境的沖擊，確定菌劑培養(yǎng)方式為S1～S3混合培養(yǎng)。

（欄目主持 樊韶華）

10.3969/j.issn.1006-6896.2014.12.067