于正洪，姜恩澤，張杰明綜述，陳龍邦審校

0 引 言

人類基因組有2層意義，即遺傳信息和遺傳物質?；蚪M(Genome)就是一個物種中所有基因的整體組成［1］。美國科學家于1985年率先提出了人類基因組計劃，并于1990年正式啟動該計劃。這一預算達30億美元的人類基因組計劃由多國共同參與。這個計劃原本設想在2005年全部解開人體內約10萬余個基因密碼，并獲得組成人體4萬個基因的30億個堿基對的全部信息，同時繪制出人類基因的圖譜。在完成了人類和鼠的基因組測序工作后，許多科學家開始把研究重心轉向基因的功能研究，研究策略是誘使每個基因發(fā)生突變，并觀測結果及分子機制。但能夠用于哺乳動物的遺傳分析方法有限，傳統(tǒng)分析方法包括基因剔除、乙烷亞硝基脲化學誘變等花費大且效率低下，很難應用于基因功能的大規(guī)模分析?，F有研究已經證明，轉座子是多種生物中極為有價值的遺傳工具，這種自然的基因轉移因子不但可以抑制基因的活性，而且可以在果蠅或簡單生物中插入或突變基因以了解單個基因的功能［1］。在低等生物實驗中，轉座子十分有效，且已被大規(guī)模地用于轉基因和基因誘變分析，在酵母、線蟲和果蠅等低等生物類模式生物的基因功能研究中起到了重要作用。然而，在過去由于缺少可在哺乳動物中高效作用的轉座系統(tǒng)，在哺乳動物中的轉座子運用仍極其有限。

1 轉座子的作用機制

轉座指一段DNA序列從原位上單獨斷裂或復制下來后環(huán)化插入另一位點，并對其后的基因起調控作用的過程。這段復制或斷裂下來的DNA序列被稱為跳躍基因或轉座因子，包括轉座子(Tn)、轉座phage、插入序列(Is因子)等類型?；蚪M中一類可移動的DNA序列被稱為轉座子，轉座子能夠從原位切割斷裂，再到新的目標位置重新整合，從而能夠從基因組的一個位置“跳躍”到另一個位置。這樣的位置變換會改變原有基因的位置和結構，從而導致基因的改變，且轉座子還有被置換及插入外來基因的能力。轉座子轉座插入宿主DNA時會在插入處留下正向重復序列，先是在目標DNA位置的插入處酶切出交錯的切口，使目標DNA產生2個突出的單鏈末端，然后轉座子同單鏈連接，使留下的缺口補平。這一系列過程在轉座子插入處生成了宿主DNA 的正向重復［2］。

與簡單的“插入序列”不同，轉座子可以在宿主基因組中發(fā)生基因座位置改變，且不依賴于同源性重組的DNA片段，除能夠攜帶行使本身轉座功能的基因外，還能攜帶編碼其他功能的基因，故可將其作為一種基因載體。依據序列特征及轉座機制，轉座子可分為逆轉錄轉座子和DNA轉座子2大類;逆轉錄轉座子編碼逆轉錄酶，將染色體DNA轉錄形成RNA并以此為模板，通過“拷貝-黏貼”機制進行轉座，經逆轉錄酶作用重新合成DNA并插入到基因組中，引起穩(wěn)定突變;DNA轉座子編碼轉座酶一般直接通過“剪切-黏貼”機制轉座，不形成RNA，也與逆轉錄酶的作用無關，引起不穩(wěn)定突變［3］。目前應用于昆蟲實驗中的轉座子幾乎全部為DNA轉座子，這類轉座子末端為反向重復序列，中間區(qū)域為轉座酶基因，此基因編碼轉座酶，使末端重復序列與其內側的目標序列移動，即將目標序列部分切出，并將其整合到染色體的其他部位［4］，從而利用這類轉座子進行轉基因操作。在基因功能研究領域，目前以DNA轉座子為基因載體，在基因組中引入突變和基因標簽的技術已經逐漸得到廣泛應用，并且有成為研究重點的趨勢。近年來，在國內外研究學者的努力下，隨著技術改良與新轉座系統(tǒng)的建立，DNA轉座子基因載體的適用范圍已被拓展到寄生蟲、魚類和哺乳動物等模式動物的轉基因研究中。

在運用上，轉座子可以用于將基因整合到宿主細胞基因組中［4］。當轉座子在轉座過程中插入基因內部或是臨近位置時，會對被插入基因造成基因功能的突變或失活，因而可以用以研究基因功能［5］。此外，轉座子一個值得注意的特性是可以人為利用基因工程手段改造轉座子，將轉座識別序列和編碼轉座酶的序列分離，并在轉座序列中插入外源目的基因。當轉座酶與轉座序列同時存在時方可發(fā)生轉座。依此特性可建立二元轉座系統(tǒng)，以提高轉座的安全性［6］。

2 PB轉座子系統(tǒng)的優(yōu)勢

長期以來，具有活性的轉座子應用于哺乳動物的研究十分稀少。目前能在哺乳動物中使用的轉座子包括hAT樣轉座子、Tcl樣轉座子、PB轉座子家族，其中SB和PB活性最高［6－7］。然而，SB轉座子在轉座后會在供體處留下3個bp的足跡，并具有供體臨近位置轉座的偏好性。這些缺點使SB的使用受到限制。而PB不但轉座活性相對更強，還不會在供體處留下基因足跡，不改變供體位置的遺傳物質，因而備受關注［8］。在發(fā)現初期，PB轉座子能成功地在地中海果蠅、黑腹果蠅和家蠶等昆蟲中完成轉座［9］。隨著研究的深入，研究人員發(fā)現PB轉座子同樣可以在哺乳動物細胞中完成轉座［10］。PB轉座系統(tǒng)憑借其高活性、轉座無痕性的特點，以及在哺乳動物中的轉座活性，在分子醫(yī)學領域表現出廣闊的前景。

PB轉座子為自主因子，能夠將基因導入哺乳動物細胞，屬于真核生物的第2類轉座子。該轉座元件最早被發(fā)現于變異的棒狀病毒中，故得名PB。原始的PB元件有大約2400 bp，兩端擁有13個堿基對的末端重復序列和19 bp的內部重復序列，可以將外源性的目的基因插入在PB元件的內部重復序列之間，使之成為載體。其他單獨載體所表達的PB轉座酶也可用來激活PB元件的轉座活性，即轉座酶和序列本身可以分開。這些特性使之能夠將外源基因插入基因組的TTAA核苷酸序列中，如其他第2類轉座子介導“剪切-黏貼”式的基因插入。由于PB轉座子的轉座頻率較高，且能準確地在TTAA核苷酸序列目標位點處插入，故該轉座子被歸入特殊的TTAA轉移因子家族。且PB介導的轉座能夠應用于人類細胞，這可能為癌基因測定與基因療法提供條件。這種轉座子適用范圍較廣，且能夠在生物體染色體中準確地切出和轉座，從而早期在鱗翅目等昆蟲中可作為基因轉移載體發(fā)揮作用［11］。

與果蠅轉座子(P-轉座子)類似，PB轉座子也遵循“剪切-黏貼”式的轉座機制。不僅如此，PB轉座子還能在鱗翅目等多種昆蟲基因組中的特征性核苷酸序列目標位點(TTAA序列)進行準確的切出和轉座，與果蠅轉座子(P-轉座子)類似且切出和插入時均需要轉座子本身編碼的轉座酶的作用。這些特點P-轉座子不具備［12］。PB轉座子在轉座酶的作用下從供體染色體上切割斷裂并游離出來，而被剪切的供體染色體則分裂為2段，DNA連接酶將分為2段的供體染色體的斷端重新連接。目標染色體的特定位置(TTAA位點)被切開，末端為黏性末端。游離出來的PB轉座子在自身編碼轉座酶的作用下與切開的目標染色體末端連接，并將末端補齊。這樣在轉移到目標染色體上的PB轉座子兩側即出現了TTAA重復序列［13］。

作為一種新的基因誘變工具，PB擁有許多目前基因轉移載體所不具備的優(yōu)勢。其構建過程更方便，也具有更高的安全性，且較其他轉座子擁有更高的轉座活性和更大的載體容量(可以容納9100～14300 bp的序列)，并且能夠實現無痕轉座。與傳統(tǒng)技術相比，PB轉座系統(tǒng)是一種新的基因轉移手段，具有以下的幾項優(yōu)勢:①容易確定整合位點;②轉基因得到長期穩(wěn)定的表達;③轉基因更易模擬內源基因的表達狀況，以單拷貝形式整合;④在活體中跟蹤轉基因時，非損傷性的可見標記替代了傳統(tǒng)的PCR等方法;⑤能同時攜帶多個基因的大片段DNA，有著較大的負載容量;⑥較高的整合效率［14］。

與病毒載體相比，PB還擁有以下優(yōu)勢:①PB轉座系統(tǒng)可以用于基因捕獲技術結合，配合表型分析獲取內源基因的表達譜;②基因型鑒定的效率大大提高，成本得以降低，因其可以在交配過程中將遺傳標記如熒光蛋白等引入，追蹤轉座子和轉座酶的分布，利用報告基因(如紅色熒光蛋白基因)可直接用肉眼區(qū)分純合子和雜合子的PB插入情況;③PB插入能打斷原有基因序列，從而破壞內源基因功能產生，且與傳統(tǒng)基因剔除誘變類似的表型;④由于其剪切十分精確，PB可廣泛插入基因組中，但有插入基因區(qū)的偏好;⑤PB可對突變表型的實現回復，能夠進一步確定表型和基因型的對應關系;⑥能夠在基因組中利用反向PCR確定PB的插入位置;⑦PB轉座系統(tǒng)可在生殖細胞中高效運作，不需要胚胎干細胞培養(yǎng)、動物手術等基因剔除的傳統(tǒng)誘變方法，僅需要簡單的交配就可以快速而高效地生產大量攜帶有單個PB、且可穩(wěn)定傳代動物品系。由此可見，PB轉座系統(tǒng)不僅是一種新的廣泛應用于科學實驗中的非病毒基因治療載體，也是一種新的可用于哺乳動物和培養(yǎng)細胞的轉基因工具［15］。

3 PB轉座子的應用

3.1 作為基因轉移載體 目前常用的基因轉移載體有病毒、轉座子等。PB是轉座子系統(tǒng)中最適合嵌合轉座的轉座子。Kettlun等［16］將一個高度位點特異性的合成鋅指結構DNA結構域整合在PB的轉座酶N-末端，以完成PB轉座子在人類細胞中的位點特異性基因組整合。將PB轉座子與DNA序列識別結構組合可使PB轉座子被用于特異性位點的轉座。PB轉座子的這一特性使之成為未來轉基因實驗的潛在工具。

此外，作為一種基因載體，PB的限制性相對較少，因而能夠廣泛應用于各種昆蟲。目前已成功獲得將PB作為轉基因昆蟲載體制取的轉基因昆蟲。鱗翅目昆蟲家蠶是一種常用的實驗動物，其生命周期短、飼養(yǎng)簡單，不僅是生產中的一種重要的經濟昆蟲，在真核基因表達調控的實驗中也是一種理想模式動物。通過使用PB這一理想轉座系統(tǒng)，可將外源基因導入家蠶基因組，并保證外來性狀的穩(wěn)定獲得、表達和遺傳，從而使家蠶在作為生物反應器領域的作用得到更好的發(fā)揮［17］。PB轉座子的發(fā)現和其在家蠶中的成功應用，為構建轉基因家蠶、培育抗病毒的家蠶品種和分析家蠶基因功能等工作提供條件。

3.2 篩選新的癌基因 高等動物的基因功能分析由于缺乏必要的插入誘變工具而一直十分困難。逆轉錄病毒曾被用來發(fā)現癌基因，但僅能用于造血組織和乳腺等噬病毒性組織。之后發(fā)現的SB轉座子可用于包括胚胎干細胞在內的多種細胞。而PB轉座子擁有比SB轉座子更高的容量，且沒有鄰近轉座偏好，因而可成為更好的癌基因篩選工具。

將PB轉座子插入可能的癌基因可有效誘發(fā)動物細胞癌變，以確定癌基因。Rad等［6］建立了表達PB轉座酶小鼠和載有不同基因的多種PB轉座序列。實驗利用基因工程將PB嵌入小鼠基因組中，并使其在染色體基因上產生作用，從而引起一些致癌基因被破壞。研究人員分析實驗小鼠中腫瘤的發(fā)展，找到基因組中轉座子的分子印跡，分析并發(fā)現新的致癌基因。當研究人員利用PB系統(tǒng)在63個小鼠白血病樣品中篩查癌基因時，分析72個基因組中轉座子直接位點的工作中發(fā)現其中約2/5是從未發(fā)現過的新的基因位點。此外，該方法能夠在特定的器官中開啟或關閉特定的基因表達，從而便于基因組中癌基因的研究［6］。

在二元轉座系統(tǒng)中，轉座酶與轉座序列位相互分離，但在雙陽性小鼠體內，表達的轉座酶依然可以催化轉座序列的轉座。該系統(tǒng)可在轉座酶與轉座序列共存的小鼠中誘發(fā)導入轉座序列的癌基因所對應的癌癥。同樣，使用PB轉座子破壞抑癌基因也可用于確定被轉座破壞的序列在疾病發(fā)生機制中的作用。

3.3 用于哺乳動物基因功能的研究 人類的基因組中約有28000個基因編碼蛋白質［16］。除此之外，還有很多同樣行使重要功能的非編碼RNA基因和DNA調控元件。針對所有這些基因組分的功能解讀對于人類生物學及疾病的研究具有重大的理論指導意義和實際應用價值。小鼠和人有超過99%的基因同源。因此，在小鼠基因中進行遺傳分析研究對于人類基因功能的測定和疾病相關基因的發(fā)現具有十分重大的意義。Sheng等［18］改造了PB系統(tǒng)，在體外培養(yǎng)的哺乳動物細胞和小鼠體內建立了PB轉座介導的轉基因方法，發(fā)現其能在小鼠體內高效轉座，除能在體外培養(yǎng)的哺乳動物細胞中轉座，研究利用PB轉座介導的插入誘變結果在小鼠體內有效地破壞基因功能。研究者發(fā)現PB轉座子在人和小鼠的細胞中都表現出高效的轉座活性［18］。經過3個月的時間研究，初步確定了70多個陌生的小鼠基因的功能［17］。首個高效實用的哺乳動物轉座子追蹤系統(tǒng)的建立使得PB系統(tǒng)的轉基因技術直接對小鼠的受精卵進行修改，而不需要進行干細胞培養(yǎng)。該系統(tǒng)的建立為大規(guī)模哺乳動物基因功能的測定指明方向，也為哺乳動物基因組水平的高效基因誘變提供重要工具。

3.4 在基因治療中的作用 基因療法的應用離不開能夠高效而穩(wěn)定地將遺傳信息載入基因組的載體。目前大多數的基因插入使用病毒載體。然而，病毒載體具有許多缺陷，如病毒載體的容量極其有限，病毒感染會引起宿主免疫反應而需要空載病毒的對照，且病毒具有突變的風險。不僅如此，許多傳統(tǒng)載體，如腺病毒，不能使目的基因長期表達。人們開始尋求新的替代基因載體以避免傳統(tǒng)病毒載體的缺陷［19］。

PB染色體的卓越性能為研究提供了一個新的選擇。其在人類細胞中的轉座效率比同為轉座子的SB更高，且不存在過量抑制現象［3］。潘雪珂等［20］利用PB轉座子介導了外源性Rb基因轉染視網膜母細胞瘤細胞，并觀察到轉染細胞與對照組的細胞活性與計數有統(tǒng)計學上的差異。Hideyuki等［21］在人類肝細胞系中使用PB進行了轉錄，并得到了長期基因表達。

相關的研究證明PB不僅可以用于癌癥研究，也可以用于制備更安全的干細胞。加拿大與英國的一個聯(lián)合研究組選擇了一種PB轉座子，其可攜帶基因在遺傳密碼中游走。PB轉座系統(tǒng)可以作為載體搭載4種轉錄因子，而這4種轉錄因子(c-Myc、Klf4、Oct4、Sox2)可誘導普通皮膚細胞的去分化及重編程，使其轉變?yōu)閕PS細胞，而且在成功構建誘導干細胞后還可再次使用PB轉座系統(tǒng)消除誘導細胞重編程的4種植外源基因。這是首次在整個過程中將皮膚細胞轉化為在形態(tài)和功能上與胚胎干細胞相似的iPS細胞而不使用病毒［21］。雖然在用于臨床之前，該技術仍需進一步的研究，但該技術的實現仍然是醫(yī)學研究的一個重大的進步，并可以作為進一步的干細胞分化研究的基礎。

4 結 語

目前的實驗結果已成為脊椎動物乃至哺乳動物中構建一個可以用于多功能遺傳分析的高效轉座系統(tǒng)關鍵的進展。PB系統(tǒng)的進一步研究和應用將對人類生物學的發(fā)展和疾病的研究有所裨益。隨著PB轉座系統(tǒng)廣泛的得到應用，該技術將進一步推動哺乳動物基因功能檢測的進程。由于PB轉座子作為載體的限制性較少，該技術作為人類基因編碼研究的新工具有著廣闊的應用前景。

［1］Dulbecco R.A Turning Point in Cancer Research:Sequencing theHuman Genome［J］.Science，1986，231(4742):1055-1056.

［2］Adele K，Ilmari P.Sizematter:versatile use of PiggyBac transposons as a genetic manipulation tool［J］.Mol Cell Biochem，2011，354(1-2):301-309.

［3］Zhou W，Gong C，Xue R，et al.Germline Transformation of the Silkworm Bombyx mori L.by Sperm-Mediated Gene Transfer［J］.Biol Reprod，2012，87(6):359-370.

［4］王建軍，王常春，韓召軍，等.piggyBac轉座子及其在轉基因昆蟲中的應用［J］.2009，46(5):665-672.

［5］Wilson MH，Coates CJ，George AL Jr.PiggyBac Transposon-mediated Gene Transfer in Human Cells［J］.Mol Ther，2007，15(1):139-145.

［6］Rad R，Rad L，Wang W.PiggyBac Transposon Mutagenesis:A Tool for Cancer Gene Discovery in Mice［J］.Science，2010，330(6007):1104-1107.

［7］馬元武，王冬梅，廉 虹，等.PiggyBac轉座酶轉基因小鼠模型的建立［J］.中國實驗動物學報，2012，20(3):60-64.

［8］馬元武，張連峰.轉座子PiggyBac在哺乳動物中的應用［J］.中國比較醫(yī)學雜志，2012，22(1):69-73.

［9］馬元武，廉 虹，王冬梅，等.一種包含轉座子Sleeping Beauty和PiggyBac的新型多功能載體的構建［J］.中國生物化學與分子生物學報，2012，28(2):182-189.

［10］顏海燕，鐘伯雄，汪方煒，等.昆蟲轉基因載體——piggyBac轉座子［J］.蠶業(yè)科學，2000，11(26):98-101.

［11］Dubois E，Bischerour J，Marmignon A，et al.Transposon Invasion of the Paramecium Germline Genome Countered by a Domesticated PiggyBac Transposase and the NHEJ Pathway［J］.Int J Evol Biol，2012，7(41):537-543.

［12］Gray LT，Fong KK，Pavelitz T，et al.Tethering of the Conserved piggyBac Transposase Fusion Protein CSB-PGBD3 to Chromosomal AP-1 Proteins Regulates Expression of Nearby Genes in Humans［J］.PLoS Genet，2012，8(9):2972-2980.

［13］Liu X，Li N，Hu X，et al.Zhang R，Efficient production of transgenic chickens based on piggyBac［J］.Transgenic Res，2012，8(24):1012-1022.

［14］Su H，Liu X，Yan W，et al.Piggy Bactransposon-mediated transgenesis in the apicomplexan parasite Eimeria tenella［J］.PLoS One，2012，7(6):4075-4086.

［15］Rostovskaya M，Fu J，Obst M，et al.Transposon-mediated BAC transgenesis in human ES cells［J］.Nucleic Acids Res，2012，40(19):1150-1158.

［16］Kettlun C，Galvan DL，George AL Jr，et al.Manipulating piggy-Bac Transposon Chromosomal Integration Site Selection in Human Cells［J］.Mol Ther，2011，19(9):1636-1644.

［17］Lobo N，Li X，Fraser MJ Jr.Transposition of the piggyBac element in embryos of Drosophila melanogaster，Aedes aegypti and Trichoplusia ni［J］.Mol Gen Genet，1999，261(4-5):803-810.

［18］Ding S，WU X，Li G，et al.Efficient Transposition of the piggy-Bac(PB)Transposon in Mammalian Cells and Mice［J］.Cell，2005，122(3):473-483.

［19］Claudia K，Daniel LG，Alfred L，et al.Manipulating piggyBac Transposon Chromosomal Integration Site Selection in Human Cells［J］.Mol Ther，2011，19(9):1636-1644.

［20］潘雪珂，陳 朝，田思佳，等.Piggybac轉座子調節(jié)pP-ggy-Bac-Rb質粒的構建［J］.中國組織工程研究，2012，16(20):3755-3758.

［21］Hideyuki N，Yuriko H，Shigeru K.PiggyBac Transposon-mediated Long-term Gene Expression in Mice［J］.Mol Ther，2010，18(4):707-714.