郭承軍，張會(huì)敏

（1.山東省運(yùn)動(dòng)康復(fù)研究中心，山東濟(jì)南250102；2.山東省中醫(yī)藥研究院，山東濟(jì)南250014）

金銀花體外抗流感病毒細(xì)胞代謝成分研究

郭承軍1，張會(huì)敏2

（1.山東省運(yùn)動(dòng)康復(fù)研究中心，山東濟(jì)南250102；2.山東省中醫(yī)藥研究院，山東濟(jì)南250014）

目的考察金銀花藥物成分經(jīng)正常細(xì)胞及感染流感病毒細(xì)胞代謝后，金銀花主要成分的變化情況。方法應(yīng)用中藥指紋圖譜技術(shù)，將得到的色譜圖導(dǎo)入指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)進(jìn)行分析，比較各組間的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜主要特征色譜峰，找出與金銀花抗流感作用相關(guān)的差異色譜峰。結(jié)果以培養(yǎng)基空白組為對(duì)照，正常細(xì)胞給藥組、病毒細(xì)胞給藥組各主要特征峰的峰面積表現(xiàn)出整體下降趨勢(shì)。8號(hào)峰面積明顯下降，2號(hào)峰、7號(hào)峰與c號(hào)峰與培養(yǎng)基空白組及金銀花對(duì)照藥材比較，相對(duì)峰面積成倍增加。結(jié)論2、7、8、c號(hào)峰對(duì)應(yīng)的化合物可能與金銀花抗流感病毒活性密切相關(guān)。

金銀花；抗病毒；細(xì)胞代謝

流感病毒具有病毒典型特征：自身無(wú)完整的酶系統(tǒng)，無(wú)法自我復(fù)制，必須借助宿主細(xì)胞的酶系統(tǒng)才能完成整個(gè)生命周期。具有抗流感病毒作用的藥物通過(guò)阻斷病毒繁殖過(guò)程的吸附、穿入、復(fù)制、成熟中的某一環(huán)節(jié)，繼而殺滅病毒或抑制病毒復(fù)制，從而達(dá)到抗病毒的目的［1］。多年來(lái)，本課題組一直致力于中藥抗流感病毒的體內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)研究，本文應(yīng)用指紋圖譜技術(shù)，考察金銀花藥物成分經(jīng)正常細(xì)胞及感染流感病毒細(xì)胞代謝后，金銀花主要成分的變化情況，為金銀花抗流感病毒的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)理的闡明提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1 儀器 Agilent1100 LC高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司，二極管陣列DAD檢測(cè)器）；Venusil XBP－C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色譜柱；CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國(guó)FOMAS公司）；－80℃冰箱（美國(guó)FOMAS公司）；恒溫培養(yǎng)箱；倒置顯微鏡；凈化工作臺(tái)等。

1.2 試劑 乙腈（色譜純，天津四友生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司），甲醇（色譜純，天津四友生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司），其他所用試劑為分析純。綠原酸對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所；批號(hào)：110753－200413），DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液（美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品，含10%新生牛血清），DMEM細(xì)胞維持液（美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品，含2%新生牛血清），pH 7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS），0.25%胰酶。

1.3 實(shí)驗(yàn)材料 金銀花（產(chǎn)地：山東平邑）；流感病毒甲型（1995.AII：32094），引自中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所毒種室；MDCK（狗腎細(xì)胞系，為流感病毒宿主細(xì)胞株），引自中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所流感病毒研究室。

2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及方法

2.1 提取物的制備 金銀花提取物由本實(shí)驗(yàn)制備，病毒增殖、病毒對(duì)細(xì)胞的毒力測(cè)定、藥物細(xì)胞毒性試驗(yàn)等試驗(yàn)方法參見(jiàn)本項(xiàng)目組已發(fā)表論文［2］。

2.2 MDCK細(xì)胞代謝后供試品的制備 將已長(zhǎng)成單層MDCK細(xì)胞的培養(yǎng)瓶，分成正常細(xì)胞給藥組、空白組，病毒細(xì)胞給藥組、空白組，共4組，每組3個(gè)。每瓶加入DMEM細(xì)胞維持液100mL，病毒細(xì)胞給藥組、空白組分別加入流感病毒甲型貯備液15 mL，正常細(xì)胞給藥組、病毒細(xì)胞給藥組分別加入金銀花提取物0.5 mL，混勻，即得。

培養(yǎng)基空白對(duì)照組：取3個(gè)與上述規(guī)格相同但未接種細(xì)胞的無(wú)菌培養(yǎng)瓶，每瓶加入DMEM細(xì)胞維持液100 mL，金銀花提取物0.5 mL，混勻，即得。

將各培養(yǎng)瓶置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，取出，倒置顯微鏡下觀察：病毒細(xì)胞空白組細(xì)胞脹大、胞內(nèi)容物增多，破碎，出現(xiàn)大面積的空腔，細(xì)胞病變率超過(guò)90%；正常細(xì)胞空白組細(xì)胞生長(zhǎng)良好、排列整齊，其他各組細(xì)胞形態(tài)基本保持完好。

取各培養(yǎng)基液、破碎細(xì)胞液，分別于攪拌下緩慢加入5倍量的甲醇，冷藏放置4 h，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，用0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.3 對(duì)照品、對(duì)照藥材溶液的制備 綠原酸對(duì)照品溶液精密稱取綠原酸對(duì)照品適量，加甲醇制成約40 μg·mL－1的溶液，即得。

金銀花對(duì)照藥材溶液 取金銀花對(duì)照藥材提取物0.5 mL，加甲醇至5 mL，搖勻，冷藏放置4 h，用0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.4 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈－0.4%磷酸－水為流動(dòng)相，按表1進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為238 nm；柱溫：30℃；流速：1 mL·min－1。理論板數(shù)按綠原酸峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。

表1 梯度洗脫條件

2.5 測(cè)定及圖譜處理 照高效液相色譜法［《中國(guó)藥典》2010年版（一部）附錄ⅥD］，依法測(cè)定。將得到的色譜圖導(dǎo)入指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)進(jìn)行分析，比較各組間的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜主要特征色譜峰，找出與金銀花抗流感作用相關(guān)的差異色譜峰。

3 結(jié)果

3.1 培養(yǎng)基中金銀花代謝成分指紋圖譜 同組內(nèi)不同供試品的藥物成分指紋圖譜相似均能達(dá)到0.9以上。不同組之間的相關(guān)成分峰對(duì)位匹配如圖1。經(jīng)比較分析剔除正常細(xì)胞空白組干擾色譜峰之后，金銀花相關(guān)成分峰的色譜峰數(shù)據(jù)如表2。

圖1 各組培養(yǎng)基金銀花相關(guān)成分峰對(duì)位匹配圖

表2 各組培養(yǎng)基中金銀花相關(guān)成分峰數(shù)據(jù)表

續(xù)表2：

3.2 細(xì)胞內(nèi)金銀花代謝成分指紋圖譜 從各組細(xì)胞內(nèi)指紋圖譜檢測(cè)的結(jié)果可以看出，金銀花指紋圖譜所能顯示出的化學(xué)成分進(jìn)入細(xì)胞的極少。不同組之間細(xì)胞內(nèi)金銀花代謝成分指紋圖譜匹配，如圖2。相關(guān)色譜峰數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。

圖2 各組細(xì)胞內(nèi)金銀花相關(guān)成分峰對(duì)位匹配圖

表3 各組細(xì)胞內(nèi)相關(guān)成分峰數(shù)據(jù)表

4 小結(jié)與討論

4.1 本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明：正常細(xì)胞空白組培養(yǎng)基及細(xì)胞內(nèi)所含成分對(duì)金銀花指紋圖譜分析無(wú)明顯干擾。以培養(yǎng)基空白組為對(duì)照，正常細(xì)胞給藥組、病毒細(xì)胞給藥組各主要特征峰的峰面積表現(xiàn)出整體下降趨勢(shì)。8號(hào)峰是金銀花藥材指紋圖譜中的主要的特征峰之一，在空白培養(yǎng)基組中即明顯下降，說(shuō)明其降低與培養(yǎng)基密切相關(guān)，雖然正常細(xì)胞給藥組仍可檢出，但病毒細(xì)胞給藥組未能檢出，說(shuō)明此成分與流感病毒有一定關(guān)系；另外9號(hào)峰、10號(hào)峰在培養(yǎng)基空白組可檢出，而正常細(xì)胞給藥組和病毒細(xì)胞給藥組未檢出，分析9、10號(hào)峰對(duì)應(yīng)的成分與細(xì)胞代謝有關(guān)，而與抗流感病毒活性關(guān)系不大；2號(hào)峰、7號(hào)峰與c號(hào)峰與培養(yǎng)基空白組及金銀花對(duì)照藥材比較，相對(duì)峰面積成倍增加，這幾個(gè)化合物可能與金銀花抗流感病毒活性密切相關(guān)。

4.2 細(xì)胞內(nèi)金銀花代謝成分指紋圖譜結(jié)果顯示：1號(hào)峰為MDCK細(xì)胞自身含有的成分，2號(hào)、3號(hào)、5號(hào)峰分別為金銀花指紋圖譜中的第3、4（S）、7號(hào)共有特征指紋峰，有少量轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，可發(fā)揮細(xì)胞內(nèi)的抗病毒作用，但病毒細(xì)胞組未檢出此3個(gè)化合物峰，卻在25 min左右檢出一未知峰，是否屬于病毒或由病毒感染后的細(xì)胞生成的新次生代謝產(chǎn)物，值得進(jìn)一步研究。

［1］王雪，楊巧麗，史玉柱，等.中藥抗流感病毒作用及機(jī)制的研究概況［J］.中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2012，9（33）：27－29.

［2］石俊英，郭承軍.金銀花體外抗流感病毒有效部位研究［J］.山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，34（2）：178－180.

Study on the com ponents of cellmetabolism of Flos Lonicerae anti－influenza virus in vitro

GUO Cheng-jun1，ZHANG Hui-min2
（1.Athlete Rehabilitation Center of Shandong Province，Jinan 250102，China；2.Shandong Academy of TCM，Jinan 250014，China）

ObjectiveTo investigate themain composition changes of Fols lonicerae through themetabolism of normal cells and cells infectedby influenza virus.MethodsApplied with the fingerprint technology，and imported the obtained chromatograms into fingerprint similarity evaluation system component，and analyzed.Compared the main characteristic peaks of the standard fingerprints among groups to find out the different chromatographic peaks related to the effect of Flos lonicerae anti－influenza.ResultsThe blank group as control，themain characteristic peaks area of the normal cells group and cells group infected by virus showed a general downward trend.Compared with blank group and the controlmedicine Flos Lonicerae，No.8 peak area decreased significantly，No.2，No.7 peak and peak c，relative peak area multiplied.ConclusionThe compounds of2，7，8，c peaks correspondingmay be closely related to the anti－influenza virus activity of Flos lonicerae.

Flos lonicerae；Antiviral；Cellmetabolism

R285

：A

2095－5375（2014）07－0376－003

山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（No.2011－162）；山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.Y2007C177）

郭承軍，男，博士研究生，副主任中藥師，研究方向：運(yùn)動(dòng)損傷治療的中藥新藥，E－mail：guochj28＠126.com

張會(huì)敏，女，博士研究生，助理研究員，研究方向：中藥化學(xué)、中藥炮制及中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，Tel：0531－82949830，E－mail：huiminzhang＠163.com