王 娟，李希平

（魯南制藥集團(tuán)股份有限公司，山東臨沂273400）

·工業(yè)藥學(xué)·

基因工程菌發(fā)酵表達(dá)rhG－CSF的條件優(yōu)化

王 娟，李希平

（魯南制藥集團(tuán)股份有限公司，山東臨沂273400）

目的通過優(yōu)化基因工程菌Escherichia coli BL21（DE3）Plys表達(dá)重組人粒細(xì)胞集落刺激因子（rhGCSF）蛋白的發(fā)酵工藝，提高蛋白產(chǎn)量。方法以100 L規(guī)模發(fā)酵為例，從不同的接種量（1%～10%）、加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)的不同OD600nm值，誘導(dǎo)表達(dá)后的不同溶氧可控制范圍（20%～80%）等方面進(jìn)行優(yōu)化。用SDS－PAGE對(duì)蛋白表達(dá)量進(jìn)行檢測。結(jié)果優(yōu)化后的方案為：采用5%的接種量，在OD600nm達(dá)到10～15時(shí)加入誘導(dǎo)劑IPTG，誘導(dǎo)起始后前20 min控制溶氧在80%以下，20 min后通過補(bǔ)加氨水控制pH在7.0左右，補(bǔ)料調(diào)節(jié)控制溶氧在20%～40%的范圍內(nèi)，誘導(dǎo)表達(dá)5 h后收集菌體。優(yōu)化后的發(fā)酵方案極大提高了蛋白表達(dá)量。結(jié)論rhG－CSF蛋白發(fā)酵方案的優(yōu)化對(duì)大規(guī)模生產(chǎn)具有重要的指導(dǎo)意義。

重組人粒細(xì)胞集落刺激因子；發(fā)酵；溶氧；基因工程菌

20世紀(jì)基因工程技術(shù)誕生以來，應(yīng)用最為廣泛的便是醫(yī)藥科學(xué)領(lǐng)域?；蚬こ碳夹g(shù)的快速發(fā)展，使人們能夠快速有效的獲取大量的生物活性物質(zhì)，能夠帶來巨大社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益［1］。利用基因重組技術(shù)生產(chǎn)的人粒細(xì)胞集落刺激因子（rhG－CSF）與天然產(chǎn)品相比，生物活性在體內(nèi)、外基本一致［2］。G－CSF是調(diào)節(jié)骨髓中粒系造血的主要細(xì)胞因子之一，可選擇性地作用于粒系造血細(xì)胞，促進(jìn)其增殖、分化，并可增加粒系終末分化細(xì)胞即分周血中性粒細(xì)胞的數(shù)目與功能，適用于癌癥化療、放療等原因?qū)е碌闹行粤＜?xì)胞減少癥［2～5］。但基因工程發(fā)酵在應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)的過程中，卻往往存在許多例如質(zhì)粒丟失嚴(yán)重，表達(dá)量低等問題。在大規(guī)模生產(chǎn)中必須避免這些不穩(wěn)定因素［6］。本文從控制發(fā)酵過程中的接種量，IPTG誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、pH、溶氧等簡易可控因素出發(fā)，篩選出維持rhG－CSF蛋白以100 L規(guī)模發(fā)酵表達(dá)的穩(wěn)定性方案。

1 材料與方法

1.1 材料 插入質(zhì)粒pET3a（轉(zhuǎn)入人源G－CSF基因）的基因工程菌E.coli BL21（DE3）PlysS購自重慶富進(jìn)生物醫(yī)藥有限公司；異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）購自Merk公司；Yeast extract、Tryptone購自O(shè)xoid公司；M9培養(yǎng)基及葡萄糖購自國藥公司。30 L－150 L 2聯(lián)體發(fā)酵罐購自上海高機(jī)生物公司。

1.2 方法 甘油菌株于Kan抗性LB平板劃線，37℃培養(yǎng)16～18 h，挑取規(guī)則的單菌落轉(zhuǎn)接入種子瓶37℃培養(yǎng)6～8 h至OD600nm到0.5～1.0之間。10%接種量轉(zhuǎn)入裝有100 LM9培養(yǎng)基的發(fā)酵罐，37℃恒溫通過恒速補(bǔ)料葡萄糖3 g·（L·h）－1培養(yǎng)5 h后，加1 mmol·L－1IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，并停止補(bǔ)加葡萄糖20 min，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)5 h后，下罐收集菌體，破碎，進(jìn)行純化，SDS－PAGE檢測蛋白表達(dá)和得率。

1.3 蛋白灰度分析 對(duì)SDS－PAGE電泳檢測后的蛋白凝膠進(jìn)行掃描，Bandscan分析，計(jì)算目的蛋白在總蛋白中所占百分比。

1.4 質(zhì)粒丟失率計(jì)算 發(fā)酵結(jié)束時(shí)的菌液稀釋涂布LB平板，37℃培養(yǎng)過夜，每個(gè)平板用牙簽挑取100個(gè)菌落，影印至含Kan抗性的LB平板和普通LB平板，37℃培養(yǎng)過夜，抗性板菌落對(duì)比普通板菌落計(jì)算得出質(zhì)粒丟失率。

1.5 優(yōu)化方法［2～10］實(shí)驗(yàn)分別從誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、接種量、誘導(dǎo)起始期及誘導(dǎo)后的參數(shù)控制等方面多次進(jìn)行100 L規(guī)模的實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。

2 結(jié)果

2.1 誘導(dǎo)表達(dá)的時(shí)機(jī)選擇 以接種培養(yǎng)后菌懸液的OD600nm為標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)定5～10、10～15、15～20三個(gè)范圍確定最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在OD600nm為10～15時(shí)，加入IPTG開始誘導(dǎo)，最后的蛋白表達(dá)水平最高，SDS－PAGE蛋白電泳凝膠的Bandscan分析顯示，蛋白灰度百分比可高達(dá)43.0 %（見表1）。而若當(dāng)OD600nm達(dá)5～10或15～20時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，最后的蛋白灰度百分比僅分別達(dá)37.6%及14.3%。

圖1 SDS－PAGE檢測rhG－CSF在E.coli BL21（DE3）PLysS中的表達(dá)水平

表1 目的蛋白灰度對(duì)比（%）

2.2 接種量優(yōu)化 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以1%、3%、5%、8%和10%的接種量對(duì)比，進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明采用1%和3%接種量時(shí)，達(dá)到OD600nm10～15需要6～8 h，而采用5%～10%接種量時(shí)達(dá)到最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)所需要的時(shí)間為4～5.5 h；而且蛋白分析數(shù)據(jù)顯示在5%接種量時(shí)，細(xì)菌最后表達(dá)目的蛋白的比例最高，其蛋白灰度百分比為43.2%（見圖1、表1）。因此最終確定5%接種量為最佳。

2.3 誘導(dǎo)期優(yōu)化 IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的過程中，為避免補(bǔ)加葡萄糖對(duì)蛋白表達(dá)的抑制作用，在誘導(dǎo)期間停止補(bǔ)加葡萄糖20 min。在此期間我們通過調(diào)整轉(zhuǎn)速以及通入氧氣的量，改變發(fā)酵液溶氧量進(jìn)行優(yōu)化。最后的質(zhì)粒穩(wěn)定性（按國家藥典檢測方法獲取質(zhì)粒的丟失率）測定結(jié)果表明誘導(dǎo)期維持溶氧在80%以下為更佳（見表2）。

表2 不同溶氧質(zhì)粒丟失率

誘導(dǎo)后，采取補(bǔ)料培養(yǎng)的生長方式。我們對(duì)補(bǔ)料速度進(jìn)行了優(yōu)化。根據(jù)罐體溶氧以及pH的變化，調(diào)控補(bǔ)料速度；在發(fā)酵罐維持恒定轉(zhuǎn)速（200 rpm）和恒定通氣量（0.3 m3·h－1）時(shí)，通過補(bǔ)加氨水的方式控制菌液pH在7.0左右，調(diào)控補(bǔ)料速度以維持溶氧分別在20%～40%、40%～60%及60%～80%的范圍。誘導(dǎo)5 h后收集菌液，SDSPAGE電泳檢測蛋白的表達(dá)并且對(duì)包涵體收率進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和結(jié)果表明溶氧控制在20%～40%之間，目的蛋白的表達(dá)效果最好（圖2、表3、4）。

表3 不同溶氧范圍包涵體收率

圖2 SDS－PAGE檢測rhG－CSF在E.coli BL21（DE3）PLysS中的表達(dá)水平

表4 目的蛋白灰度對(duì)比（%）

3 討論

利用基因重組技術(shù)進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)人粒細(xì)胞集落刺激因子rhG－CSF已經(jīng)備受關(guān)注，我們通過多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到較優(yōu)的發(fā)酵條件，實(shí)現(xiàn)了rhG－CSF蛋白的高效穩(wěn)定表達(dá)，同時(shí)為向更大規(guī)模的生產(chǎn)提供了可靠的數(shù)據(jù)方案，具有重要的理論及應(yīng)用價(jià)值。

在蛋白的發(fā)酵生產(chǎn)工藝中，接種量及蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)產(chǎn)量具有重要的影響，以我們的發(fā)酵為例，100 L培養(yǎng)基的接種量為10%，雖然縮短了誘導(dǎo)前的培養(yǎng)時(shí)間，也從而縮短整個(gè)發(fā)酵周期，但如此操作，菌種在前期生長過程中會(huì)產(chǎn)生許多不利于菌體生長和蛋白表達(dá)的因子，反而抑制了菌種后期目的蛋白的表達(dá)；以接種后補(bǔ)料培養(yǎng)時(shí)間作為標(biāo)準(zhǔn)確定蛋白誘導(dǎo)起始時(shí)間，由于多種不確定的影響因素，可重復(fù)性、參考性較差，故本論文優(yōu)化過程中以O(shè)D600nm為標(biāo)準(zhǔn)，大大增強(qiáng)其參考價(jià)值。

另外，基因工程菌的部分菌株在誘導(dǎo)表達(dá)前會(huì)有一定的本底表達(dá)［11］，而表達(dá)產(chǎn)物大部分對(duì)菌株都是有害的，這不利于菌株后期的生長及蛋白的表達(dá)。在100 L實(shí)際發(fā)酵表達(dá)中，由于生長條件如攪拌、通氣等的變化，也會(huì)影響誘導(dǎo)前的本底表達(dá)。我們在發(fā)酵過程中采用的是恒定補(bǔ)料的培養(yǎng)方式，補(bǔ)料培養(yǎng)基是以一定的C／N配制而成的，碳源的主要成分是葡萄糖，氮源則是酵母提取物與蛋白胨按照比例混合而成。通過在種子中增加相應(yīng)的葡萄糖，發(fā)酵中通過pH以及溶氧的參數(shù)反饋，在菌體起始生長階段以稍過量的葡萄糖補(bǔ)料抑制本底表達(dá)，但是如果補(bǔ)料速度過快，葡萄糖濃度過高會(huì)造成過量的乙酸形成，導(dǎo)致pH迅速下降，溶氧迅速下降，抑制蛋白表達(dá)；故在誘導(dǎo)起始時(shí)需通過間歇停止補(bǔ)糖解除對(duì)蛋白表達(dá)的抑制作用；另外如果補(bǔ)料停止，攪拌和通氣卻仍然維持，就會(huì)造成碳源不足，pH、溶氧上升并維持在高位100 %以上，菌體生長趨于利用氮源，亦不利于質(zhì)粒的穩(wěn)定及目的蛋白的表達(dá)和積累［12］。

發(fā)酵過程中，為了維持罐體內(nèi)的溶氧范圍同時(shí)避免罐體壓力泄露造成染菌，一般維持罐內(nèi)壓力在0.05～0.1 MPa之間。但是這同時(shí)增加了罐體內(nèi)其他氣體的分壓，例如CO2，高溶解CO2不利于后期的表達(dá)［13］。因此在誘導(dǎo)前維持較高的罐壓，可以避免接種后延滯期染菌，同時(shí)較高溶解CO2抑制菌株的本底表達(dá)；而誘導(dǎo)過程中，將罐壓降至0.02 MPa左右，結(jié)合其他因素的控制可提高目的蛋白的表達(dá)。

據(jù)鄭劍等［14］的研究，用甘油做培養(yǎng)基能夠避免葡萄糖對(duì)細(xì)菌蛋白表達(dá)的抑制作用，提高總體菌體量，并增加所有蛋白的表達(dá)。而乳糖可起到相應(yīng)的誘導(dǎo)作用又可促進(jìn)后期菌體的生長及目的蛋白的表達(dá)，也可作為一種備選碳源。此外，可溶性表達(dá)也是蛋白表達(dá)的一個(gè)重要研究方向［15］。

總之，rhG－CSF蛋白的發(fā)酵工藝還有很大優(yōu)化的潛能，還有許多問題值得思考。

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Optim ization of the fermentation of rhG－CSF using recom bined strain

WANG Juan，LIXi-ping
（Lunan Pharmaceutical Group Corporation，Linyi273400，China）

ObjectiveTo improve the rhG－CSF protein from the recombined strain Escherichia coli BL21（DE3）Plys，the batch fermentation conditions was optimesed.MethodsWe determined the influence of the parameters at some crucial control points，including different inoculation amount（1%～10%），the OD600nmof fermentation culturewhen adding inducer IPTG and the different concentrations of dissolved oxygen（DO）（20%～80%）on the final protein expression in 100 L batch level fermentation.A SDS－PAGEwas used to analyze the protein expression.ResultsThe optimized fermentation condition was as follow：inoculum quantity 5%，IPTG should be added when the OD600nmof culture reaches10～15，at the beginning of inducing the expression of object protein，the DO concentration was controlled under 80%；After inducing 20 min，the pH ofmedium was kept at around 7.0 by adding ammonia，the DO concentration was keptat20%～40%；The bacteria was collected after inducing 5 hours.The production of rhG－CSFwas higher after optimizing the fermentation conditions.ConclusionThe optimized fermentation conditions for rhG－CSF production in E.coli BL21（DE3）Plys provided import direction for its large scale preparation.

rhG－CSF；Fermentation；Dissolved oxygen；Genetic engineered stains

Q812

：A

2095－5375（2014）07－0428－003

王娟，女，研究方向：基因工程菌的發(fā)酵表達(dá)與工業(yè)化，E－mail：tuky2003＠163.com