劉衍志，陳 艷，高 翔，蘇艷杰，崔 燎

（廣東天然藥物研究與開發(fā)重點實驗室，廣東醫(yī)學院，廣東湛江524023）

·實驗研究·

塞來昔布對大鼠骨組織的影響

劉衍志，陳 艷，高 翔，蘇艷杰，崔 燎

（廣東天然藥物研究與開發(fā)重點實驗室，廣東醫(yī)學院，廣東湛江524023）

目的探討塞來昔布對大鼠骨組織的影響。方法16只3月齡雌性SD大鼠隨機分為兩組：正常對照組和塞來昔布給藥組，每組8只。塞來昔布組大鼠每天灌胃給予塞來昔布50 mg·kg－1，正常對照組給予等量生理鹽水。給藥時間為8周，每周記錄大鼠體重。實驗結(jié)束時取大鼠左側(cè)股骨用雙能X線骨密度儀（DXA）測定骨密度，用三點彎曲法測定股骨生物力學特性，然后再用離子發(fā)射光譜儀測定股骨中的Ca、P、Mg的含量。另取大鼠脛骨中段皮質(zhì)骨做不脫鈣骨磨片測定骨形態(tài)計量學參數(shù)。結(jié)果塞來昔布50 mg·kg－1用藥8周與對照組相比，明顯降低大鼠股骨骨密度，但是對皮質(zhì)骨骨量、骨形成率、礦化沉積率、股骨最大載荷和斷裂載荷等均未產(chǎn)生顯著性損害，也并未降低股骨中Ca、P、Mg的含量。結(jié)論塞來昔布用藥8周明顯降低股骨骨密度，但并未進一步損害皮質(zhì)骨骨量、骨形成、骨礦無機質(zhì)含量和骨生物力學特性。

塞來昔布；類風濕關(guān)節(jié)炎；骨組織；大鼠

目前臨床上已有報道類風濕關(guān)節(jié)炎在治療的過程中，患者的骨骼質(zhì)量會受到不同程度的損害［1，2］。這種損害主要來源于兩個方面，一個是類風濕關(guān)節(jié)炎本身，研究報道患者即使無藥物的干預，炎癥本身也會對骨骼產(chǎn)生一系列的影響［3，4］，另一個來源于治療類風濕關(guān)節(jié)炎所使用的藥物。塞來昔布（Celecoxib，Cel）是一種Cox－2選擇性抑制劑，是臨床常用的治療類風濕關(guān)節(jié)炎的藥物。以往的研究報道，長時間使用塞來昔布，在控制病情的同時也會對骨骼帶來一些負面的影響。然而，塞來昔布藥物的長期使用對骨質(zhì)量的影響并不明了。這是因為類風濕關(guān)節(jié)炎在治療的過程中，疾病本身對骨骼的影響很可能掩蓋藥物對骨骼的真實作用，反過來也一樣；而且在治療疾病的過程中，往往是多種藥物的聯(lián)合使用，這可能遮掩了單一藥物對骨骼的實際作用。為了更合理地在臨床上使用塞來昔布，減少其可能對骨骼產(chǎn)生的副作用，本研究以正常大鼠作為實驗對象，從骨形態(tài)計量學、骨密度、骨生物力學、骨成分等多方面，探討長期使用塞來昔布時，藥物自身對骨骼的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 雌性SD大鼠，廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK（GUANG DONG）2008－0002。

1.1.2 儀器與試藥 PRODIGY型骨密度儀（美國GE公司）；MTX 858 Mini Bionix型材料測試系統(tǒng)（美國MTSSystem公司）；IRIS／AP型ICP離子性發(fā)射光譜儀（美國IJA公司）；塞來昔布膠囊（西樂葆）（美國輝瑞制藥公司生產(chǎn)，批號：J20080059）。

1.2 方法 將16只正常健康的3月齡雌性SD大鼠隨機分為：正常對照組（Con）和塞來昔布給藥組（Cel），每組8只。大鼠適應性喂養(yǎng)兩周后，塞來昔布組每只大鼠用灌胃的方式給予塞來昔布50 mg·（kg·d）－1，正常對照組大鼠給予等量的生理鹽水灌胃。實驗計劃給藥8周，每周記錄大鼠體重。實驗結(jié)束后大鼠用3%戊巴比妥麻醉，心臟取血處死。動物處死前13 d和14 d在大鼠皮下注射四環(huán)素（50 mg· kg－1），另在處死前3 d和4 d在大鼠頸部皮下注射鈣黃綠素（10 mg·kg－1），進行大鼠體內(nèi)骨形成雙熒光標記。分離右側(cè)脛骨中段制作不脫鈣骨磨片，進行骨組織形態(tài)計量學分析。分離大鼠左側(cè)股骨，用骨密度儀（DXA）進行骨密度（BMD）掃描分析，隨后左股骨及另取第六腰椎椎體利用材料測試系統(tǒng)進行三點彎曲力學和腰椎壓縮生物力學檢測。將做完生物力學的左股骨收集，用6 mol·L－1鹽酸消化，得到濾液，以濾液－雙蒸水＝1∶200比例稀釋，然后用離子性發(fā)射光譜儀測定Ca、P、Mg等元素的含量，再依據(jù)標準品含量及樣品稀釋倍數(shù)計算股骨中Ca、P、Mg等元素的含量。

2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

3 結(jié)果

從第3周開始給藥后，在整個實驗給藥期間，塞來昔布組大鼠體重與對照組體重相比，無顯著性差異，僅在第7周后略有下降，結(jié)果見圖1。

圖1 塞來昔布用藥8周對大鼠體重的影響

與對照組相比，塞來昔布組股骨骨密度明顯下降（P＜0.05），結(jié)果見圖2。

圖2 塞來昔布用藥8周對大鼠股骨骨密度的影響注：與對照組相比，*P＜0.05

塞來昔布組與對照組相比，大鼠脛骨中段骨骨髓面積百分數(shù)（%Ma.Ar）和皮質(zhì)骨面積百分數(shù)（% Ct.Ar）均無顯著性差異，結(jié)果見圖3。

圖3 塞來昔布用藥8周對大鼠脛骨中段骨骨形態(tài)計量學靜態(tài)數(shù)據(jù)的影響

塞來昔布組大鼠脛骨中段骨骨組織計量學動態(tài)參數(shù)熒光周長百分率、礦化沉積率、骨形成率與對照組相比均無顯著性差異，結(jié)果見表1。

與對照組相比，塞來昔布組及地塞米松組，股骨中Ca、P、Mg含量均無明顯改變，結(jié)果見圖4。

塞來昔布組與對照組相比，彈性載荷和最大載荷無明顯改變，骨生物力學參數(shù)無顯著性差異，結(jié)果見圖5。

表1 塞來昔布用藥8周對大鼠脛骨中段骨骨形態(tài)計量學動態(tài)數(shù)據(jù)的影響（±s）

表1 塞來昔布用藥8周對大鼠脛骨中段骨骨形態(tài)計量學動態(tài)數(shù)據(jù)的影響（±s）

注：L.Pm代表皮質(zhì)骨外圈骨熒光周長，%L.Pm代表皮質(zhì)骨外圈骨熒光周長百分率，MAR代表礦化沉積率，BFR代表骨形成率，E－L.Pm代表皮質(zhì)骨內(nèi)圈骨熒光周長，E－%L.Pm代表皮質(zhì)骨內(nèi)圈骨熒光周長百分率

組別 L.Pm（mm） %L.Pm（%） MAR（μm·d－1）BFR［μm·（d·100）－1］E－L.Pm（mm） E－%L.Pm（%）3 0.34±0.12 9.31±3.34 0.29±0.18 7.57±4.52塞來昔布給藥組 4.38±2.56 51.23±30.65 1.02±0.45 40.48±25.0正常對照組 3.52±0.87 40.76±9.57 0.89±0.34 38.51±22.32

圖4 塞來昔布用藥8周對大鼠股骨骨礦物質(zhì)含量的影響

圖5 塞來昔布用藥8周對大鼠股骨三點彎曲力學參數(shù)的影響

4 討論

本研究結(jié)果表明，塞來昔布給藥8周對大鼠的體重沒有明顯的影響，與對照組相比無顯著性差異。在實驗過程中，塞來昔布組大鼠的胃口和行為均未觀察到異常。但在股骨骨密度的檢測中發(fā)現(xiàn)，大鼠股骨骨密度較正常組明顯降低，有統(tǒng)計學差異。提示，長期使用塞來昔布會對骨骼產(chǎn)生負面影響。以往有臨床數(shù)據(jù)顯示，患者長期使用塞來昔布可能損傷正常的骨骼功能，導致骨密度下降。臨床觀察與我們的實驗結(jié)果一致［5］。我們進一步從骨形態(tài)計量學方面檢測了大鼠皮質(zhì)骨的靜態(tài)和動態(tài)指標，發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)骨骨量并未減少，骨形成的相關(guān)指標也與對照組無顯著性差異，提示塞來昔布并未抑制骨形成。這與以往一些文獻報道一致，雖然本實驗與文獻報道用的不是相同的模型［6］。然而，同樣也有報道顯示，Cox－2選擇性抑制劑在體內(nèi)抑制骨轉(zhuǎn)換導致成骨抑制以及對成骨細胞和破骨細胞的功能有潛在的干擾［7，8］。Muller等［9］進一步報道只有一小部分NSAIDs抑制作用可見于成骨分化階段，據(jù)推測，NSAIDs對骨細胞或者骨前體細胞的影響可能是通過抑制前列腺素的合成介導的，因為前列腺素2具有刺激骨形成的作用，針對這個有爭議的結(jié)果，有報道給出了更好的解釋，處在炎癥狀態(tài)還是非炎癥狀態(tài)，塞來昔布對骨形成產(chǎn)生的結(jié)果可能不同，Yoon等［10］實驗發(fā)現(xiàn)NSAIDs對炎癥狀態(tài)和非炎癥狀態(tài)下的骨髓基質(zhì)干細胞的成骨分化會產(chǎn)生不同的結(jié)果，在炎癥狀態(tài)下使用高濃度Cox－2抑制劑，骨髓基質(zhì)干細胞的成骨分化會受到抑制，而在非炎癥狀態(tài)下則不會。

本實驗利用ICP檢測股骨中的骨礦物質(zhì)Ca、P、Mg的含量試圖解釋骨密度下降，但并未發(fā)現(xiàn)股骨中礦物質(zhì)的顯著減少。提示塞來昔布的使用使骨密度降低的原因并不在于骨礦無機物質(zhì)方面。在本課題組另外進行的塞來昔布使用12周對正常大鼠骨質(zhì)量的影響實驗中，發(fā)現(xiàn)塞來昔布組大鼠血清中抗酒石酸酸性磷酸酶明顯增高，使用骨形態(tài)計量學對大鼠脛骨上段松質(zhì)骨的破骨細胞分析結(jié)果顯示（數(shù)據(jù)未列出），塞來昔布組大鼠骨吸收明顯加強，破骨細胞數(shù)量增多，破骨細胞周長百分數(shù)明顯增加。這提示塞來昔布的使用造成骨密度的降低源于破骨細胞活性的增加，骨吸收加強所導致。那么骨密度的降低對大鼠骨生物力學是否會產(chǎn)生顯著影響？本實驗利用測完骨密度大鼠的左側(cè)股骨以及新分離的第六腰椎椎體，進一步探討大鼠的骨生物力學參數(shù)性能，與對照組相比，大鼠股骨彈性載荷，最大載荷和斷裂載荷均未見顯著性降低，但腰椎最大壓縮載荷有下降趨勢。這說明塞來昔布造成的骨密度降低可能是單純的破骨細胞活性增強，但是骨吸收增強的幅度尚沒有實質(zhì)性改變皮質(zhì)骨的大小和厚度，且在成骨活動和骨成分并未發(fā)生明顯退化的情況下，塞來昔布8周的使用，雖然減少了骨密度，但還不足以造成大鼠骨骼明顯的力學性能下降。

5 結(jié)論

本實驗通過采用骨形態(tài)計量學，骨密度，骨生物力學，骨礦物質(zhì)含量等多方面檢測表明長期使用高劑量的塞來昔布會引起骨密度的降低，骨折風險增加，但塞來昔布8周的使用尚不足以引起正常大鼠明顯的骨量、骨礦物質(zhì)含量和骨生物力學的降低。

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Effects of celecoxib on bone in SD rats

LIU Yan-zhi，CHEN Yan，GAO Xiang，SU Yan-jie，CUILiao
（Guangdong Key Laboratory for Research and Development of Natural Drug，Guangdong Medical College，Zhanjiang 524023，China）

ObjectiveTo determine the effects of celecoxib on bone tissue in SD rats.MethodsSixteen 12－weeks－old female SD ratswere randomly allocated into 2 groups with 8 rats in each group：intact control（saline，daily，oral gavage）and celecoxib（50 mg·kg－1，daily，oral gavage）.Ratswere administered by celecoxib for 8 weeks and were weighted weekly.The left femur of the rats was used to scan by DXA forbonemineral density（BMD），determined by three bending test for bonemechanical properties and analyzed by ICP for the content of Ca，P，Mg in the femur.The cortex bone of middle tibiaswere processed for bone histomorphometry analysis.ResultsCelecoxib decreased femur BMD significantly while did not deteriorate cortex bonemass，bone formation and biomechanic properties significantly at a dose of 50 mg·kg－1daily for 8 weeks in rats.ConclusionThe results indicated that celecoxib had impairmenton BMD.Buthad no further deterioration on cortex bonemass，bone formation，bonemineral composition and biomechanic properties.

Celecoxib；RA；Bone tissue；Rat

R965

：A

2095－5375（2014）07－0373－004

國家自然科學基金（No.81273518）；廣東省科技計劃項目（No.2012B060300027）；廣東醫(yī)學院青年基金（No.XQ1310）

劉衍志，男，研究方向：骨質(zhì)疏松的機制及防治，E－mail：liuyanzhi02＠163.com

崔燎，女，博士研究生，教授，研究方向：骨質(zhì)疏松的機制及防治、骨細胞生物學及分化調(diào)控、腫瘤藥理學，Tel：0759－2388305，E－mail：cuiliao＠163.com