胡 騎，何于雯，信愛國，李華春

(云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院云南省熱帶亞熱帶動物病毒重點實驗室，云南昆明 650224)

口蹄疫(Food and mouth disease，F(xiàn)MD)是由小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)口蹄疫病毒屬(Aphthovirus)的FMD 病毒(FMDV)引起的偶蹄動物傳染病。FMDV 存在7 種相互無交叉保護性免疫應(yīng)答的不同血清型(O、A、C、SAT-1、SAT-2、SAT-3 和Asia1)[1-2]。FMDV 能夠在BHK-21、IB-RS-2、羔羊或牛睪丸細胞等多種細胞上復(fù)制。通常采用觀察FMDV 細胞病變效應(yīng)(CPE)和測定病毒組織半數(shù)感染量(TCID50)的方法來分析FMDV 的復(fù)制效率。隨著具有快速、敏感、特異性強的實時定量RT-PCR(qRT-PCR)技術(shù)在FMDV 基因表達水平的分析、病原體的定性和定量檢測等方面得到了廣泛的應(yīng)用[3-6]，通過建立qRT-PCR 方法分析FMDV 在細胞培養(yǎng)物中的復(fù)制動態(tài)，測定FMDV 即時增殖滴度，明確病毒的復(fù)制效率，是對上述傳統(tǒng)方法的有益補充。

本實驗針對FMDV 3D 基因，建立檢測FMDV的SYBR Green I qRT-PCR 方法，以BHK-21 細胞18S rRNA 為內(nèi)參基因，采用雙標準曲線法[7]分析FMDV 感染細胞總RNA 中FMDV 基因組當量(Genome equivalents per μg total RNA，GE/μg)，應(yīng)用該方法對亞洲1 型FMDV 兔化弱毒ZB(att)株和其體外拯救病毒vZB 株感染BHK-21 細胞后的病毒復(fù)制動態(tài)進行了測定，同時測定病毒一步生長曲線，進行比較分析。該方法為FMDV 的檢測和研究FMDV 增殖規(guī)律及致病性等相關(guān)研究提供了一種快速評價方法。

1 材料和方法

1.1 病毒株和細胞系 FMDV 亞洲1 型兔化弱毒ZB 株細胞適應(yīng)毒ZB(att)(DQ533483)、ZB(att)株感染性克隆pZBatt 體外拯救病毒vZB[8]以及用于FMDV qRT-PCR 特異性驗證的藍舌病病毒(BTV)、豬瘟病毒(CSFV)和豬繁殖障礙綜合征病毒(PPRSV)由云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院保存。BHK-21 傳代細胞系由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所于力研究員惠贈。

1.2 主要試劑 病毒總RNA 提取試劑TRIpure Reagent 購自北京艾德萊生物科技有限公司；cDNA合成試劑盒和熒光定量PCR 試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；2×Master Mix Taq 酶、DNA MarkerⅠ均購自北京艾德萊生物科技有限公司。

1.3 引物設(shè)計 采用文獻報道的位于FMDV 基因組高度保守區(qū)RNA 聚合酶基因(3D)內(nèi)的引物序列[9]和根據(jù)真核生物18S rRNA 序列(NR003278)設(shè)計引物，經(jīng)NCBI Blast 比對驗證，建立檢測FMDV 的qRT-PCR 方法。采用文獻報道的檢測亞洲1 型FMDV VP1 基因的上、下游引物As1DF 和P33 引物進行RT-PCR[10]。引物序列見表1。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)股份有限公司合成。

表1 RT-PCR 和qRT-PCR 引物Table 1 Primers of RT-PCR and qRT-PCR

1.4 病毒RNA的提取和c DNA的合成 將拯救病毒vZB(10-4.5TCID50/0.1 mL)200 μL，按RNA 提取試劑說明書方法提取基因組RNA，采用oligo dT18為反轉(zhuǎn)錄引物，合成cDNA 用于RT-PCR 和qRTPCR 試驗。

1.5 qRT-PCR方法的建立 以合成的cDNA 為模板，分別對FMDV 3D 基因和內(nèi)參18S rRNA 基因進行擴增，建立檢測FMDV 的實時熒光定量PCR。反應(yīng)總體積為20 μL，其中2×TranStart Green qPCR Mix 10 μL，上、下游引物(10 μM)各0.5 μL，模板cDNA 1 μL，ROX Reference Dye II 0.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃10 s，95 ℃5 s，60 ℃30 s 收集熒光，共擴增45 個循環(huán)；最后添加溶解曲線生成步驟。同時設(shè)立陰性對照和空白對照。

采用雙標準曲線法對細胞懸液中的FMDV RNA進行相對定量，檢測標準品為質(zhì)粒pT-FMDV-3D(稀釋梯度為10-2～10-7)，18S rRNA 標準品為質(zhì)粒pT-18r(稀釋梯度為10-2～10-7)。將兩者進行梯度稀釋，分別繪制標準曲線。各實驗組樣品的Ct 值與標準曲線對比，計算檢測樣品的濃度。經(jīng)內(nèi)參基因18S rRNA歸一化處理后，計算細胞懸液總RNA 的FMDV F值(GE/μg)。歸一化值=目的基因濃度/內(nèi)參基因濃度，F(xiàn) 值=(待測組樣品目的基因濃度/待測組樣品內(nèi)參基因濃度)/(對照組樣品目的基因濃度/對照組樣品內(nèi)參基因濃度)。結(jié)果采用Excel 和Graphpad prism 5 軟件進行統(tǒng)計分析和繪圖。

1.6 qRT-PCR方法敏感性、特異性及重復(fù)性試驗10 倍倍比稀釋vZB(10-4.5TCID50/0.1 mL)，取200 μL提取總RNA，進行SYBR Green I qRT-PCR 試驗，確定病毒檢測的最低稀釋度，同時以檢測亞洲1 型FMDV VP1 基因的上、下游引物As1DF 和P33 進行常規(guī)的RT-PCR 擴增[10]，比較分析該方法的敏感性。提取BTV、CSFV、PRRSV 的RNA，進行qRT-PCR檢測，驗證其特異性。將同一批次的標準品質(zhì)粒模板和陽性樣品ZB(att)進行梯度稀釋，提取RNA，采用建立的qRT-PCR 檢測，每個濃度重復(fù)3 次，隔天再重復(fù)3 次，求平均值、標準差和變異系數(shù)。

1.7 樣品的檢測 將拯救病毒vZB(10-4.5TCID50/0.1 mL)和親本病毒ZB(att)(10-4.83TCID50/0.1 mL)稀釋成100×TCID50/0.1 mL，各取0.2 mL 分別接種12孔板中長滿單層BHK-21 細胞，每個稀釋度接種3孔。在接種后第4 h，8 h，12 h，16 h 和24 h 分別收獲病毒，測定其TCID50，繪制一步生長曲線；同時利用所建立的qRT-PCR 方法檢測同一時間收獲病毒的RNA 相對含量，經(jīng)3 次重復(fù)試驗取其幾何平均數(shù)進行分析，比較驗證兩種方法的符合率。

2 結(jié)果

2.1 標準質(zhì)粒的構(gòu)建 采用oligo dT18 為反轉(zhuǎn)錄引物，以vZB 培養(yǎng)病毒懸液提取總RNA 為模板，合成cDNA。采用引物18S-F 和18S-R 擴增細胞內(nèi)參對照基因，采用引物3D-F 和3D-R 擴增FMDV 高度保守區(qū)3D 基因，分別獲得101 bp 和107 bp PCR 產(chǎn)物(圖1)。將上述PCR 產(chǎn)物分別克隆至pMD18-T中，獲得重組質(zhì)粒pT-FMDV-3D 和pT-18S 作為檢測FMDV 基因組的定量質(zhì)粒標準品。

圖1 FMDV 3D 基因片段和細胞18S rRNA 片段的PCR 擴增產(chǎn)物Fig.1 Amplification of FMDV 3D gene and 18S rRNA fragments by RT-PCR

2.2 標準曲線的建立 分別將pT-FMDV-3D(383 ng/μL)和pT-18S(388 ng/μL)10 倍倍比稀釋，各取6 個不同稀釋度(10-2～10-7)作為模板進行熒光定量PCR擴增，生成擴增動力曲線和標準曲線(圖2)。FMDV 3D 基因的標準曲線方程為：Ct=-3.61×log(conc)+4.21，熔解溫度為83.6 ℃；18S rRNA 標準曲線方程為：Ct=-3.54×log(conc)+1.19，熔解溫度為80.7 ℃。

圖2 SYBR Green I qRT-PCR 檢測FMDV-3D 和18S rRNA 的標準曲線Fig.2 Standard curve of the qRT-PCR for FMDV-3D and 18S rRNA

2.3 敏感性試驗 將10 倍倍比稀釋的病毒vZB(10-4.5TCID50/0.1 mL)，各取200 μL，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后進行qRT-PCR 檢測，結(jié)果顯示能夠最低檢測到101.5×TCID50/0.1 mL 樣品，倍比稀釋在100～10-3呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，敏感性比常規(guī)的RT-PCR 高10 倍，其敏感性試驗的擴增動力曲線及常規(guī)RT-PCR 檢測見圖3。

圖3 不同稀釋度FMDV vZB 株的qRT-PCR 檢測和常規(guī)RT-PCR 檢測結(jié)果Fig.3 The detection of FMDV vZB strain by the qRT-PCR and traditional RT-PCR at different dilutions

2.4 特異性試驗 提取BTV、CSFV 和PRRSV 的RNA，利用建立的檢測FMDV 的qRT-PCR 進行特異性檢測，同時設(shè)無模板對照。結(jié)果表明，僅FMDV 陽性標準品出現(xiàn)陽性信號，其他病毒樣品和未加模板對照的檢測結(jié)果均為陰性(圖略)。

2.5 重復(fù)性試驗 將標準質(zhì)粒pT-FMDV-3D 和pT-18S 進行10 倍連續(xù)梯度稀釋，經(jīng)過預(yù)試驗選擇10-2～10-7作為濃度梯度，用相同的熒光定量PCR 反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，分3 個試驗批次做FMDV-3D和18S rRNA 基因的標準曲線，每個濃度梯度做3次重復(fù)。結(jié)果顯示3 批陽性樣品和陰性樣品重復(fù)擴增3 次的變異系數(shù)均小于2.8 %，表明所建立的qRT-PCR 檢測方法具有較高的可重復(fù)性(表2)。

表2 SYBR GreenⅠqRT-PCR 的組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗結(jié)果Table 2 Intra-assay and inter-assay reproducibility test of the qRT-PCR

2.6 FMDV一步生長曲線 病毒一步生長曲線結(jié)果表明，vZB 和ZB(att)在BHK-21 細胞中的復(fù)制能力相近，4 h 測定病毒TCID50分別為10-2.00TCID50/0.1 mL和10-2.17TCID50/0.1 mL，病毒滴度達到峰值所需的時間均在16 h 以后，24 h CPE 均達100 %，vZB 和ZB(att)的毒價分別為10-5.17TCID50/0.1 mL 和10-5.33TCID50/0.1 mL(圖4)。

圖4 ZB(att)和vZB 的一步生長曲線Fig.4 One-step growth curves of the ZB(att)and vZB

2.7 qRT-PCR檢測細胞總RNA中FMDV基因組當量 分別提取拯救病毒vZB 和親本毒ZB(att)在接種BHK-21 細胞后不同時間點分別收獲細胞的總RNA，對FMDV RNA 進行定量分析。結(jié)果顯示ZB(att)和vZB 在4 h 測定細胞懸液內(nèi)病毒RNA 水平分別為101.08GE/μg 和101.02GE/μg；至24 h，細胞均產(chǎn)生100 % CPE，病毒RNA 水平分別為102.81GE/μg和102.80GE/μg(圖5)。同一時間點方差分析(p>0.05)，差異不顯著，兩株病毒在BHK-21 細胞內(nèi)復(fù)制效率相似。該結(jié)果與病毒一步生長曲線結(jié)果相比較，兩種方法均表明vZB 和親本毒ZB(att)在BHK-21 細胞中復(fù)制效率相似。

3 討論

圖5 接毒后不同時間細胞懸液內(nèi)ZB(att)和vZB 病毒RNA 水平的變化Fig.5 Cell suspension ZB(att)and vZB RNA levels at different time points post infection

本研究以FMDV 細胞培養(yǎng)物中的18S rRNA 作為內(nèi)參基因，建立了檢測FMDV 的qRT-PCR 方法，用于細胞培養(yǎng)物中FMDV RNA 的相對定量分析。該方法的內(nèi)參基因的選擇，最初參考文獻報道的GAPDH 為內(nèi)參基因建立相對定量表達法測定FMDV 在體外復(fù)制[6]，顯示GAPDH 基因溶解曲線有小雜峰(圖略)，后改用18S rRNA 作為內(nèi)參，獲得了溶解曲線為單一峰的特異性擴增曲線。但分別以GAPDH 和18S rRNA 為內(nèi)參基因，對同一處理的樣品，重復(fù)測定3 次，分析FMDV RNA 水平，其結(jié)果是一致的。對實驗數(shù)據(jù)分析，常規(guī)采用2-ΔΔCT法分析表達差異，要求內(nèi)參基因和目標基因擴增效率一致。本實驗采用雙標準曲線法進行分析，雖然每次試驗都分別用標準品做內(nèi)參基因18S rRNA 和目的基因FMDV 3D 的標準曲線，并同時擴增各個樣本中目的基因和內(nèi)參基因，但該方法分析簡單，實驗條件容易優(yōu)化，從各自標準曲線上可以直接測得樣本中初始量，將目的基因表達量進行歸一化處理以消除初始RNA 的差異帶來的表達水平差異[7,11]，先計算每個樣本的歸一化值，再計算細胞懸液總RNA的病毒基因組當量F 值，結(jié)果采用柱形圖表示[12]。該方法特異性強，重復(fù)性好，比常規(guī)RT-PCR 靈敏10 倍。本實驗初步應(yīng)用該方法對亞洲1 型FMDV 兔化弱毒ZB(att)株和其基因工程拯救病毒vZB 株在BHK-21 細胞上的復(fù)制效率進行了測定和分析，其結(jié)果顯示體外拯救病毒與其親本病毒的復(fù)制動態(tài)相似，結(jié)果與TCID50測定的病毒一步生長曲線一致。這結(jié)果與王海偉等和李平花等建立的Asia 1 型FMDV 的感染性克隆分子拯救病毒與親本病毒的毒力比較也基本一致[13-14]。該方法對FMDV 的快速檢測和分析FMDV 突變株的病毒復(fù)制效率差異提供了一種快速評價方法。

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