楊 超，張曉娜，張園華，廉傳江，文輝強，陳洪巖，韓凌霞*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室/實驗動物與比較醫(yī)學(xué)團隊，黑龍江 哈爾濱 150001；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，山西 太谷 030801)

自然殺傷(Natural killer，NK)細胞是一類大顆粒淋巴細胞，具有先天性免疫細胞和適應(yīng)性免疫細胞的特點[1]。因為未鑒定出雞NK 細胞的特異性表面標記--哺乳動物NK 細胞的表面標記不適用于雞NK 細胞，目前人們對雞NK 細胞知之甚少。根據(jù)雞胚免疫細胞的發(fā)育，14 日胚齡雞胚脾臟中沒有T細胞和B 細胞，是雞NK 細胞最富集的區(qū)域，脾臟中的淋巴細胞曾經(jīng)被命名為TCR0 細胞，后來被證明是雞NK 細胞[2]。

雞NK 細胞與多種禽病原體的致病性密切相關(guān)[3]。盡管國內(nèi)對NK 細胞的研究逐漸增多，但基本集中于人和小鼠[4]，對雞NK 細胞的系統(tǒng)研究比較少。本實驗室參考國外最新研究進展，在國內(nèi)首次建立了雞NK 細胞的分離純化方法，并通過形態(tài)學(xué)和免疫表型的研究證明成功分離培養(yǎng)及鑒定了雞NK 細胞，為系統(tǒng)研究雞NK 細胞奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 14 日胚齡SPF 雞胚由本所實驗動物中心提供。許可證編號為SCXK(黑)2011-007。

1.2 主要試劑和儀器 刀豆素A(ConA)購自Sigma公司，PE 標記的鼠抗雞CD3(CT-3)、CD4(CT-4)、MHC Class I(F21-2)及FITC 標記的鼠抗雞CD8a(CT-8)和Bu-1(AV20)等單克隆抗體(MAb)購自Southern Biotechnology 公司。雞淋巴細胞分離液購自天津市灝洋生物制品科技有限公司。IMDM 和雞血清等購自GIBCO 公司，雞重組白介素-2(rIL-2)購自Kingfisher 公司。30 ku 超濾管和FACS Aria 型流式細胞儀分別為MILLIPORE 和BD 公司產(chǎn)品。

1.3 條件培養(yǎng)基的制備 參照文獻[5]的方法，無菌取健康成年雞脾臟，300 目銅網(wǎng)研磨破碎，采用雞血淋巴細胞分離液分離獲得脾臟淋巴細胞，用PBS 洗3 遍，最后沉淀用IMDM 按濃度1×106/mL 重懸，在37 ℃5 % CO2培養(yǎng)2 h，按終濃度10 μg/mL加入ConA。培養(yǎng)48 h 收獲細胞培養(yǎng)物，250 r/min離心5 min，將上清轉(zhuǎn)移到30 ku 超濾管，3 000 r/min離心10 min，收獲下層液體，即為條件培養(yǎng)液。分裝，置-70 ℃?zhèn)浯妗?/p>

1.4 雞胚NK細胞的制備 無菌取30 枚14 日胚齡雞胚脾臟，以PBS 沖洗，采用5 mL 含0.25 %胰酶的IMDM 溶液中，4 ℃消化12～16 h。棄胰酶消化液，加入1 mL 37 ℃預(yù)熱的含0.25 %胰酶的IMDM繼續(xù)消化。過量PBS 終止消化。利用雞淋巴細胞分離液分離雞胚脾臟淋巴細胞，PBS 洗3 次。沉淀按1×106/mL 加入完全培養(yǎng)基(10 %條件培養(yǎng)基，8 %FBS，2 %雞血清，3 ng/mL rIL-2)。37 ℃5 % CO2培養(yǎng)48 h。收獲懸浮細胞，暫時命名為TCR0 細胞。

1.5 瑞氏吉姆薩染色 按照瑞氏吉姆薩染色說明書染色。取1.4 中制備的1×105個細胞，PBS 洗2次，用100 μL 固定液(甲醇∶冰乙酸=1∶3)重懸，固定15 min。每張載玻片滴加50 μL，自然風(fēng)干，蔡司光學(xué)顯微鏡(80×10 放大倍數(shù))下觀察記錄。

1.6 雞NK細胞免疫表型的流式細胞術(shù)分析 取1.4 中制備的雞NK 細胞，臺盼藍溶液染色，血細胞技術(shù)法計算活細胞濃度，調(diào)整細胞濃度至1×106個/mL。PBS 洗2 次。取300 μL 細胞，分別加入1 μL PE 標記的CT-3、CT-4 和F21-2，以及FITC 標記的AV20 和CT-8，單染，同時將未加任何抗體標記的雞NK 細胞作為陰性對照，相同處理。室溫孵育30 min，過量PBS 終止反應(yīng)，洗3 遍。最后加入300 μL PBS 重懸，立即通過FACS Aria 流式細胞儀檢測?；蚣尤?00 μL 1 %多聚甲醛重懸，4 ℃固定。利用BD FACS Calibur 軟件獲取數(shù)據(jù)，采用Flowjo分析。

2 結(jié)果

2.1 雞NK細胞的形態(tài)學(xué)鑒定 利用流式細胞儀檢測培養(yǎng)的TCR0 細胞。流式前向角(Forward scatter,FSC)和側(cè)向角(Side scatter，SSC)分析顯示，TCR0細胞中85.1 %的細胞大小均一，胞內(nèi)顆粒分布一致(圖1)。瑞氏吉姆薩染色表明，分離的TCR0 細胞為大顆粒淋巴細胞，其中細胞核位于一側(cè)，嗜酸性顆粒位于細胞內(nèi)另一側(cè)，符合NK 細胞特征(圖2)。

2.2 雞NK細胞免疫表型鑒定 采用流式細胞術(shù)和表型MAb 對TCR0 細胞染色。結(jié)果顯示，TCR0 中，MHC I 高表達，占97.4 %，表明分離的細胞狀態(tài)良好，表型完整；CD8a 低表達，占30.8 %；而T 細胞表面標記CD3 染色為陰性；B 細胞的標記CD4和Bu-1 染色均為陰性(圖3)。實驗結(jié)果表明，分離培養(yǎng)的TCR0 細胞狀態(tài)良好，符合雞NK 細胞標記特征。

圖1 流式細胞術(shù)FSC &SSC 分析TCR0 細胞Fig.1 The FAS &SSC analysis of cultured chicken NK cells

圖2 TCR0 細胞的瑞氏吉姆薩染色Fig.2 The Wright-Giemsa staining of the isolated cells

圖3 TCR0 的免疫表型特征鑒定Fig.3 The immunophenotypic analysis of the TCR0 cells by Cytometry

3 討論

流式前向角散射與被測細胞大小相關(guān)，而側(cè)向角與胞內(nèi)顆粒型相關(guān)。在本實驗中，前向角和側(cè)向角分析顯示，在TCR0 細胞中，高達85.1 %的細胞大小均一，顆粒型一致。表明冷胰酶法分離雞胚脾臟細胞和培養(yǎng)純化方法可行。瑞氏吉姆薩染色染色顯示TCR0 細胞的形態(tài)學(xué)符合NK 細胞特征[6]。

本實驗結(jié)合國外的免疫表型研究進展對收獲的雞NK 細胞進行了免疫表型分析。Gobel 等研究顯示雞NK 細胞表面不表達CD3，10%低表達CD8α[7]。Zhang 等研究表明純化的雞NK 細胞微量表達Bu-1[8]，Jeason 等研究顯示雞NK 細胞不表達CD4[9]，本實驗結(jié)果與上述研究結(jié)果基本相符。

總之，本實驗通過對雞NK 細胞形態(tài)學(xué)和免疫表型2 個方面的鑒定，證明已成功建立了雞NK 細胞的分離培養(yǎng)方法，為深入研究雞NK 細胞奠定了基礎(chǔ)。

[1]楊超，韓凌霞，陳洪巖.自然殺傷細胞受體與功能的研究進展[J].實驗動物科學(xué)，2013(05)：55-58.

[2]Pat B R,Chen C I H.Development of cytoplasmic CD3+/T cell receptor negative cells in the peripheral lymphoid tissues of chickens[J].Eur J Immunol,1990,20(6):1345-1350.

[3]Jansen C A,de Geus E D,van Haarlem D A,et al.Differential lung NK cell responses in avian influenza virus infected chickens correlate with pathogenicity[J].Scientific reports,2013,3:1-10.

[4]黃湛.CD226～+NK 細胞參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病進程[D].合肥：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)，2011.

[5]Gobel T W.Isolation and analysis of natural killer cells in chickens[M].Natural Killer Cell Protocols.Springer,2000:337-345.

[6]Campell K S.Natural killer cell protocols:cellular &molecular methods[M].Methods in Molecular Biology,2 ed,Humana Press,2011.

[7]Gobel T W,Chen C L H,Shrimpf J,et al.Characterization of avian natural killer cells and their intracellular CD3 protein complex[J].Eur J Immunol,1994,24(7):1685-1691.

[8]Zhang Lei,Katselis G S,Moore R E,et al.MHC class I target recognition,immunophenotypes and proteomic profiles of natural killer cells within the spleens of day-14 chick embryos[J].Devel Comp Immunol,2012,37(3):446-456.

[9]Jansen C A,van de Haar P M,van Haarlem D,et al.Identification of new populations of chicken natural killer(NK)cells[J].Devel Comp Immunol,2010,34(7):759-767.