張利杰，李江南，胡 亮，張 泉,2，王 巖,3，于會彬，黃 麗，李 曦，蔡雪輝，翁長江*

(1.中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室/動物病原監(jiān)測與流行病學研究創(chuàng)新團隊，黑龍江 哈爾濱 150001；2.長江大學 生命科學學院，湖北 荊州 434023；3.昆明理工大學 生命科學與技術學院，云南 昆明 650500)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是一種由PRRS 病毒(PRRSV)引起的高度傳染性疾病，主要臨床特征為母豬嚴重繁殖障礙及仔豬和育肥豬的呼吸道癥狀。PRRSV 基因組為單股正鏈RNA，全長約15 kb。基因組5' 端有一個帽子結構，3' 端有一個poly(A)序列，含10 個ORFs，共編碼14 種非結構蛋白NSP1α、NSP1β、NSP2-12(Nsp7 包括NSP7α 和NSP7β)，其中非結構蛋白NSP1α、NSP1β、NSP2、NSP4 和NSP11 具有蛋白酶活性[1]。已知NSP1、NSP2、NSP4 和NSP11 均可抑制宿主IFNβ 的產生，NSP1α可以抑制胞漿內NF-κB 抑制因子IκB 的磷酸化[2]；NSP1β 可以抑制干擾素調節(jié)因子3(IRF3)的磷酸化和入核[3]；NSP2 能夠抑制被磷酸化激活的IκB 的泛素化和IRF3 的磷酸化的發(fā)生[4]。NSP4 作為一種3C樣蛋白酶在病毒復制酶的表達與加工過程中起到核心作用[5]，并且能夠誘導宿主細胞的凋亡[6]，但其抑制IFNβ 啟動子激活的機制尚無相關報道。

RNA 病毒復制過程中產生的雙鏈RNA(dsRNA)可被RLRs(Retinoic acid inducible gene I-like helicases receptors)所識別，激活磷酸激酶TBK1 和IKKε，然后這些IKK(IκB kinase)相關激酶磷酸化IRF3，激活的IRF3 入核與IFNβ 啟動子區(qū)域的IRF3 結合位點作用啟動IFNβ 的轉錄[7-8]。NEMO(NF-κB essential modulator)作為IKK 復合物的一部分，嚴格調控核轉錄因NF-κB 的功能，并且對某些RNA 病毒感染后誘導的I 型干擾素(IFN-I)的產生也有重要的作用[9]。本研究采用高致病性PRRSV(HP-PRRSV)HuN4 株感染豬肺泡巨噬細胞(PAM)，我們發(fā)現(xiàn)PRRSV 的NSP4 蛋白具有切割NEMO 的功能，從而抑制IFN-I的產生，初步闡明了PRRSV NSP4 抑制IFNβ 產生的機制。

1 材料和方法

1.1 病毒株、菌株、細胞和重組質粒 HP-PRRSV HuN4 株、E.coli DH5α、HEK293 細胞和重組質粒pHA-NSP1α、pHA-NSP1β、pHA-NSP2-N'、pHANSP4、pFlag-NEMO 均由本實驗室構建或保存。PAM 由本實驗室從健康豬肺臟中分離；仙臺病毒(SeV)由武漢大學生命科學學院吳旻教授惠贈，報告基因質粒pIFN-β-Luc 和海腎熒光素酶pRL-TK 重組表達質粒由中國科學院武漢研究所唐宏研究員惠贈。

1.2 主要試劑 質粒提取試劑盒、DNA 膠回收試劑盒購自QIAGEN 公司；限制性內切酶、T4 DNA連接酶購自NEB 公司；兔抗Flag 和抗HA 單克隆抗體(MAb)、4',6'-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、Anti-FLAG MAb 偶聯(lián)的Protein A plus G Sepharose、羊抗鼠 IgG-HRP 和羊抗兔 IgG-HRP 均購自Sigma-Aldrich 公司；鼠抗Flag 和抗HA 多克隆抗體購自艾比馬特公司；FITC 標記羊抗鼠 IgG(FITC-IgG)和羊抗兔TRITC-IgG 均購自中杉金橋生物技術有限公司；ECL 發(fā)光檢測試劑盒購自Thermo公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自Promega 公司；鼠抗人的NEMO 抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司。

1.3 重組質粒的構建 根據PRRSV-HuN4 株的cDNA 序列設計引物(表1)，分別擴增NSP1α、NSP1β、NSP2 及NSP4 基因，擴增產物經酶切后克隆于pCAGGS-HA 載體中，命名為pHA-NSP1α、pHA-NSP1β、pHA-NSP2 及pHA-NSP4。并將豬源NEMO cDNA 克隆到pCAGGS-Flag 載體中，命名為pFlag-NEMO。

1.4 病毒感染試驗 將新分離的PAM 細胞接種于6 孔板中，每孔約2×105。細胞培養(yǎng)12 h 后用不同感染復數(shù)(MOI)HP-PRRSV HuN4 感染，24 h 后收集細胞樣品進行western blot 檢測。

1.5 免疫共沉淀(Co-IP)試驗 將重組質粒pHANSP4 和pFlag-NEMO 各2 μg 單獨或共轉染HEK293細胞，轉染后36 h 裂解細胞并收集細胞裂解液，取出部分細胞裂解液用于檢測目的蛋白的表達。剩余部分加入Anti-FLAG MAb(M2)的Protein A plus G瓊脂糖珠，4 ℃旋轉孵育過夜[10]。

表1 實驗所用的引物Table 1 Primers used in this study

1.6 Western blot檢測 蛋白樣品經SDS-PAGE 電泳，轉膜后用5 %脫脂乳室溫封閉，分別以兔源抗HA 或Flag MAb(1∶1 000)為一抗，以羊抗兔IgG-HRP(1∶2 000)作為二抗，使用ECL 發(fā)光試劑盒檢測[10]。

1.7 激光共聚焦檢測試驗 將pFlag-NEMO 和pHA-NSP4 共轉染HEK293 細胞36 h 后，經4 %甲醛固定20 min、0.3%Triton X-100 透膜10 min、10%的FBS 血清封閉30 min；鼠源抗Flag MAb 抗體和兔源抗HA MAb 抗體(1∶100)室溫孵育1 h；熒光二抗TRITC-IgG(1∶100)和FITC-IgG(1∶100)孵育1 h；最后用終濃度為1 mM DAPI 避光孵育20 min，激光共聚焦顯微鏡下觀察[10]。

1.8 報告基因檢測試驗 將HEK293 細胞(5×104)接種于24 孔板，18 h～20 h 后轉染。每組樣品設三個平行實驗組，加入空載體以保證每組轉染質?？偭肯嗤Ｃ靠邹D染200 ng pIFNβ-luc 和800 ng pHANSP4 或其突變體和(或)500 ng pFlag-NEMO，同時加入10 ng pRL-TK 以檢測轉染效率。根據實驗需要，細胞轉染24 h 后感染SeV，12h 后進行熒光活性檢測。

2 結果

2.1 PRRSV NSP4切割宿主蛋白NEMO 為了研究PRRSV 是否通過切割NEMO 抑制IFN-I 的產生，我們將HP-PRRSV HuN4 株分別以0、0.01、0.1 和1.0 MOI 梯度感染PAM 細胞，感染后24 h 收集樣品通過Western blot 鑒定內源性NF-κB 信號通路關鍵調節(jié)蛋白NEMO 的表達情況。結果顯示，HP-PRRSV 感染PAM 導致宿主蛋白NEMO 被切割，產生一條大小約40 ku 的蛋白條帶，并且隨著病毒感染劑量的升高切割NEMO 效果愈加明顯(圖1A)。已知PRRSV 編碼4 個具有蛋白酶活性的蛋白NSP1α、NSP1β、NSP2 和NSP4，為了進一步確定切割NEMO 的蛋白酶，我們將重組質粒pHA-NSP1α、pHA-NSP1β、pHA-NSP2、pHA-NSP4 分別與pFlag-NEMO 共轉染至HEK293 細胞，轉染后36 h收集蛋白樣品進行western blot 鑒定，試驗結果顯示，PRRSV 編碼的蛋白酶NSP4 具有切割NEMO 功能，而NSP1α、NSP1β 和NSP2 并不能切割NEMO(圖1B)。

圖1 PRRSV NSP4 切割宿主蛋白NEMOFig.1 PRRSV NSP4 cleaved NEMO

2.2 PRRSV NSP4與蛋白NEMO相互作用的檢測PRRSV NSP4 能夠切割蛋白NEMO，我們推測NSP4與NEMO 在細胞內可能存在相互作用和具有共定位現(xiàn)象。將pHA-NSP4 和pFlag-NEMO 單獨或共轉染HEK293 細胞。Co-IP 和激光共聚焦試驗結果顯示，PRRSV NSP4 與NEMO 存在特異性的相互作用(圖2A)，兩者在胞質中具有共定位現(xiàn)象(圖2B)。這些結果表明PRRSV NSP4 可能通過與NEMO 相互作用并切割NEMO，最終抑制IFNβ 的產生。

2.3 PRRSV NSP4對NEMO的切割依賴于其蛋白酶活性 已有研究表明PRRSV NSP4 含有3 個酶活性位點，分別為His39、Asp64和Ser118，3 個位點中的任何一個位點突變均能導致3C 蛋白酶活性喪失[11]。為了驗證NSP4 對NENO 的切割是否依賴于其3C 樣蛋白酶活性，將PRRSV NSP4 64 位的D 突變?yōu)锳(NSP4-D64A)后與NEMO 共轉染于HEK293 細胞，通過western blot 檢測NEMO 的切割情況。試驗結果表明，野生型NSP4(NSP4-WT)能夠切割宿主蛋白NEMO 而酶活性缺失體NSP4-D64A 則不能(圖3)，證明PRRSV NSP4 對NEMO 的切割作用完全依賴于其3C 樣蛋白酶活性。

圖2 PRRSV NSP4 與宿主蛋白NEMO 相互作用及共定位Fig.2 Identification of the interaction and colocalization between PRRSV NSP4 and NEMO

2.4 PRRSV NSP4對IFNβ 抑制作用依賴于其蛋白酶活性 利用雙熒光素酶報告基因試驗檢測過表達NSP4 對SeV 誘導的IFNβ 基因啟動子活性的影響。結果顯示，過表達NSP4 顯著抑制SeV 誘導的IFNβ報告基因活性，而NSP4-D64A 則沒有影響(圖4A)。由于病毒誘導IFNβ 的產生依賴于NEMO，因此可以通過檢測NSP4 對NEMO 誘導的IFNβ-luc 活性的影響。檢測結果表明，過表達NSP4 能夠顯著抑制NEMO 誘導的IFNβ 的產生，并且這種抑制效應依賴于NSP4 的蛋白酶活性(圖4B)。

圖3 PRRSV NSP4 切割NEMO 依賴于其酶活性Fig.3 Cleavage of NEMO depended on protease activity of PRRSV NSP4

圖4 PRRSV NSP4 抑制IFNβ 依賴于其蛋白酶活性Fig.4 PRRSV NSP4 inhibited the activation of IFNβ promoter dependently on its protease activity

3 討論

天然免疫反應是宿主抵制病毒感染的第一道防線。病毒在與宿主共進化過程中獲得了免疫逃逸機制以應對機體的強烈天然免疫反應。病毒逃逸機制包括干擾IFN 受體信號傳導或抑制各種抗病毒效應因子的激活，抑制IFN-I(IFNα 和IFNβ)的合成等。病毒基因組編碼的蛋白酶通過切割天然免疫反應分子抑制IFNβ 的產生成為近來的研究熱點。最新的研究表明，小RNA 病毒科的EV71(Enterovirus 71)病毒2A 蛋白酶和3C 蛋白酶分別通過切割天然免疫信號通路接頭分子MAVS 和轉錄因子IRF7 抑制細胞內IFN 的表達[12-13]。小RNA 病毒科病毒口蹄疫病毒3C 蛋白酶通過切割宿主蛋白NEMO 破壞天然免疫信號的傳導[14]。

由于PRRSV 和HP-PRRSV 的流行，對養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重經濟損失。PRRSV 感染細胞后顯著抑制IFN-I 的表達，其非結構蛋白NSP4 也具有強烈的抑制作用。Zhao 等研究表明NEMO 缺陷型(Ikbkg-/-)小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)在受到SeV 刺激時，IRF3的磷酸化和IFNβ 的產生受到抑制[9]，表明NEMO是病毒介導干擾素產生的關鍵分子。本研究發(fā)現(xiàn)HP-PRRSV HuN4 感染PAM 細胞后能切割天然免疫分子NEMO，同時證實該切割作用是由蛋白酶NSP4 介導，而NSP4 酶活性缺失體D64A 沒有介導NEMO 切割的能力。此外，證明NSP4 與NEMO 具有特異性相互作用，兩者在胞質中共定位。與NSP4對NEMO 的切割效應相對應的是，野生型NSP4 過表達能夠顯著抑制NEMO 介導的IFNβ 啟動子的激活，NSP4 酶活性缺失體卻無此效應，表明NSP4 抑制IFNβ 產生作用與其活性相關，這也表明NSP4 的抑制機制可能與其切割NEMO 的關聯(lián)性，初步闡明了PRRSV 抑制宿主天然免疫反應的一種新機制。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)PRRSV 蛋白酶NSP4 切割關鍵天然免疫分子NEMO 破壞宿主細胞抗病毒狀態(tài)的建立，揭示了一種PRRSV 病毒蛋白酶介導的逃避宿主天然免疫防御屏障的新策略。

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