宇 佳，孫 璐，遲德富

（東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040）

基于核酸適配體與金納米粒子檢測水中Hg2+的研究

宇 佳，孫 璐，遲德富*

（東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040）

基于Hg2+與胸腺嘧啶（T）的T-T錯配結(jié)合的特性，構(gòu)建出一種快速便捷的可在高鹽溶液中誘導(dǎo)金納米粒子可控聚集的比色檢測Hg2+的方法。采用硼氫化鈉還原法制備金納米粒子，并應(yīng)用透射電子顯微鏡和紫外分光光度計對其進行表征。設(shè)計核酸適配體并修飾金納米粒子表面，增強金納米粒子的穩(wěn)定性，使其能夠拮抗高鹽誘導(dǎo)下的團聚行為，當存在Hg2+時，核酸適配體與Hg2+結(jié)合，使得金粒子去保護而聚集，產(chǎn)生了顏色的變化，從而通過比色法定量分析Hg2+的濃度。結(jié)果表明，以硼氫化鈉為還原劑可以得到穩(wěn)定性好且分布均勻的平均粒徑約為27nm的金納米粒子；伴隨Hg2+濃度的提高，體系顏色由紅色向藍色發(fā)生轉(zhuǎn)變；熒光光譜結(jié)果表明，伴隨Hg2+濃度的提高，熒光強度逐漸增強；說明金納米粒子逐步發(fā)生團聚；檢測體系對8種常見離子具有明顯的選擇檢測性能。

金納米粒子，汞離子，比色探針，飲用水安全

隨著工業(yè)的高速發(fā)展，水中重金屬的污染問題也隨之日益嚴重。在眾多重金屬離子污染中，汞離子（Hg2+）的危害最為嚴重[1]。Hg2+能夠進入人體內(nèi)并與體內(nèi)的各種酶蛋白上的S-H和S-S鍵牢固結(jié)合，使蛋白質(zhì)發(fā)生變性，嚴重影響人類的生命安全，因此，在飲用水中Hg2+的定性檢測和定量分析的研究具有重要的意義[2]。目前，測定重金屬離子的方法主要有原子光譜法[3]、紫外-可見分光光度法[4]、電化學(xué)分析法[5]等。這些方法大多需經(jīng)過復(fù)雜的預(yù)處理過程和昂貴的儀器設(shè)備，難以滿足快速分析的需求，因此急需研發(fā)一種高效便捷的檢測方法[6]。金納米粒子自身具有優(yōu)良的光學(xué)性且其溶液的顏色與個體粒徑及顆粒的間距有關(guān)。當顆粒間距明顯小于粒徑，金納米粒子就容易發(fā)生團聚，宏觀上溶液顏色由酒紅色變?yōu)樽仙蛩{色，利用這一性質(zhì)，在控制其粒徑大小的同時，結(jié)合表面修飾與改性等方法，就可以設(shè)計出針對于快速檢測金屬離子的金納米比色探針[7-10]。1997年，Science上報到了Mirkin研究組應(yīng)用金顆粒標記寡核苷酸并對靶標寡核苷酸進行檢測，開創(chuàng)了利用金納米顆粒比色檢測的新紀元[11]。2002年，Obare等在金粒子表面修飾上1，10-鄰二氮雜菲基團，從而實現(xiàn)了對溶液中Li+的特異性響應(yīng)。金粒子表面的配體通過與Li+發(fā)生配位作用形成復(fù)合物，進而導(dǎo)致金納米粒子的大規(guī)模聚集。通過分析共振峰位置移動與Li+濃度的關(guān)系，實現(xiàn)了對Li+的定量測量，其精度達到10~ 100mmol/L[12]。Lee等用寡聚雙鏈DNA修飾金納米粒子，利用DNA雙鏈隨溫度升高而變性的性質(zhì)，誘導(dǎo)金納米粒子的聚集，通過金納米粒子溶膠顏色的變化（變?yōu)樽霞t色）指示體系中的Hg2+，從而實現(xiàn)對Hg2+的特異性和選擇性的響應(yīng)[13]。2008年，劉曉剛課題組利用的胸腺嘧啶與汞離子發(fā)生配位的原理，采用DNA功能化納米金顆粒，并設(shè)計增加功能化DNA雙鏈中錯配胸腺嘧啶的數(shù)目，DNA鏈中錯配堿基的數(shù)目增多，使DNA鏈的鏈解溫度下降，通過系統(tǒng)的實驗，設(shè)計增加錯配胸腺嘧啶的數(shù)目達到8對時，該檢測方法可在常溫下進行，通過金納米溶膠顏色的變化，可視的檢測限為3μmol/L[14]。

本研究針對Hg2+與胸腺嘧啶（T）T-T錯配的結(jié)合特異性[15]，設(shè)計出特異性螯合Hg2+的核酸適配體，用以修飾金納米粒子。當體系中出現(xiàn)Hg2+時，會與粒子表面核苷酸結(jié)合，使得金納米粒子迅速聚集，從而引起體系顏色發(fā)生變化，進而判斷樣品中Hg2+的濃度。本研究將為水環(huán)境污染中重金屬離子的檢測與治理提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

氯金酸、氯化汞、碳酸鉀、氯化鈉、硫酸銅、醋酸鋅和氯化鐵 均為分析純，購自于國藥集團化學(xué)試劑有限公司；硼氫化鈉 購自于上海振興化工一廠；其余化學(xué)試劑 均為分析純；水 為Millipore二次去離子水。

Tecnai G220 透 射 電 子 顯 微 鏡 Royal Dutch Philips Electronics Ltd；激光粒度儀（BT-9300H） 成都貝斯達儀器儀表廠；紫外-可見光分光光度計（UV2250） 北京桑翌科技發(fā)展有限公司。

1.2 核酸適配體的設(shè)計

根據(jù)Hg2+可與富含胸腺嘧啶的單鏈DNA特異性結(jié)合形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)這一特點，設(shè)計核酸適配體。由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成設(shè)計序列為5’-CGGTTGCACTTGTTTGTT-3’的核苷酸片段。用去離子水溶解稀釋到100μmol/L。實驗操作時的工作濃度為5μmol/L。

1.3 金納米粒子的制備與表征

參考Marie等[16]方法改進。在4℃預(yù)冷的20mL的雙蒸水中，加入0.5mL質(zhì)量分數(shù)為1%的氯金酸；再加入0.2mol/L的碳酸鉀溶液0.1mL；在攪拌的條件下，迅速分批次加入新鮮配制的硼氫化鈉水溶液（質(zhì)量濃度為0.5mg/mL）0.5mL，直至溶液出現(xiàn)酒紅色為止，磁力攪拌10min，4℃靜置保存。紫外-可見光吸收光譜：采用紫外-可見光分光光度計掃描金納米粒子的吸收光譜，最大波長應(yīng)在520nm左右。粒徑分布：置于超聲波清洗器上超聲振蕩使其分散成單個顆粒，然后用激光粒度分布儀檢測粒徑的大小及分布情況。透射電鏡：采用透射電子顯微鏡觀察金納米粒子探針的表觀形貌和粒度分布情況。

1.4 不同濃度Hg2+的快速比色檢測[17]

向離心管中分別加入10μL的5μmol/L核酸適配體和終濃度的為0、0.1、1.0、5、10、50、100、200、300μmol/L汞離子溶液，加滅菌水至整個體系為60μL，混勻，于20℃水浴中孵育30min。再依次加入100μL金膠，100μL的磷酸鹽緩沖溶液（pH7.3）。室溫反應(yīng)15min，觀察記錄顏色的變化，取各檢測體系約3mL于光程為1cm的熒光比色皿中，以432nm作為激發(fā)波長，掃描波長范圍400~480nm，測定不同汞離子濃度檢測體系的熒光強度的變化范圍。

1.5 比色探針的檢測選擇性研究

實驗設(shè)計A、B兩組進行，A組：向離心管中加入10μL的5μmol/L的DNA和0.5μmol/L的汞液，再向體系中分別添加濃度為汞離子濃度50倍的Fe3+、Cu2+、Na+、K+、Ca2+、Zn2+、Mg2+和Mn2+，加去離子水至總體積為60μL，B組：不加入汞液，其他與A組相同。對照組為不加其他金屬離子的反應(yīng)體系?；靹颍?0℃水浴中孵育30min。再依次加入100μL金膠和100μL的磷酸鹽緩沖溶液（pH7.3），室溫反應(yīng)15min，觀察記錄顏色變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 金納米粒子的性能表征

紫外-可見光光譜能與金納米粒子大小、形狀與分散狀態(tài)等信息呈現(xiàn)出完全不同的響應(yīng)，通過分析其譜圖，可以得到有關(guān)顆粒粒度和結(jié)構(gòu)等重要信息。根據(jù)理論，納米金顆粒的特征等離子體吸收峰在510~550nm處，并且隨著粒子尺寸的增加吸收峰的位置發(fā)生紅移，此吸收峰的位置和形狀與顆粒高分散和締合態(tài)的存在有關(guān)[18-19]。

圖1 金納米粒子的紫外-可見光吸收光譜Fig.1 UV-vis absorption spectra of AuNPs

由圖1可知，采用硼氫化鈉還原法所制備的金納米粒子在約527nm處具有明顯的吸收峰，且所制備的金溶膠顏色為酒紅色。采用透射電子掃描電鏡對所制備的金納米粒子的表觀形貌進行表征，結(jié)果見圖2。硼氫化鈉還原法制得的金納米粒子粒徑分布均勻，具有良好的單分散性能，整體呈規(guī)則的球型，沒有發(fā)現(xiàn)團聚的現(xiàn)象，利用激光粒度儀測定粒徑分布，得出金納米粒子平均粒徑大小約為27nm。

圖2 金納米粒子的透射電鏡圖片（200，000×）Fig.2 TEM image of chitosan-stabilized AuNPs with the scale bar（200，000×）

2.2 Hg2+的比色檢測研究

基于金納米粒子的汞離子快速檢測原理為胸腺嘧啶（T）與Hg2+形成“T-Hg2+-T”結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)單鏈DNA折疊或兩個單鏈形成雙鏈，進而使金納米失去保護在鹽誘導(dǎo)下聚集，通過納米金溶液的顏色變化檢測Hg2+。但是金納米粒子在檢測的過程中容易被樣品中其他種類離子所影響，造成不必要的顆粒聚集，從而影響檢測體系的靈敏度和準確度[20]。針對此類問題，本研究設(shè)計了含T-T錯配的鑷子型核酸適配體并用其修飾金納米粒子，使得金納米粒子能在高鹽中穩(wěn)定存在，實現(xiàn)了對Hg2+的快速光度法檢測。采用金納米粒子與核酸適配體復(fù)合構(gòu)建的金納米比色探針，快速比色檢測不同濃度的汞離子，結(jié)果見表1。

表1 基于金納米粒子和核酸適配體的汞離子比色檢測Table 1 Colorimetric detection of mercury ions based on gold particles and aptamers

由表1可知，伴隨著樣品中Hg2+的濃度的提高，顏色逐漸變化，由酒紅色向藍灰色轉(zhuǎn)變；當汞離子濃度達到300μmol/L時，顏色變化最為顯著；當汞離子濃度為0.1μmol/L時，與對照的顏色基本沒有區(qū)別；當汞離子濃度大于50μmol/L時，顏色變化開始明顯。由結(jié)果可知，此體系可以用于比色測定，通過目測就能判斷汞離子的殘留，本研究可用于飲用水或者其他食品中痕量的汞離子的快速檢測。

為了能夠準確的確定不同濃度汞離子與金納米粒子的反應(yīng)程度，用以構(gòu)建實時精確的檢測模型，采用熒光光譜法對檢測體系進測定，結(jié)果見圖3。

圖3 不同濃度汞離子檢測體系的熒光光譜圖Fig.3 Fluorescence spectra of the solution at the different concentrations of Hg2+

采用熒光光譜法精確測定不同濃度汞離子與金納米比色探針的反應(yīng)過程。由圖3可知，反應(yīng)體系中汞離子的濃度與熒光強度具有相關(guān)性，伴隨著汞離子濃度的增加，熒光強度也逐漸提高。說明汞離子的在體系中誘導(dǎo)了金納米粒子的聚集，出現(xiàn)了熒光增強效應(yīng)。其中，當汞離子濃度為0.1μmol/L時，熒光強度與對照樣品的熒光強度基本一致，當汞離子濃度大于50μmol/L時，熒光強度增加明顯，由200μmol/L增加到300μmol/L時，熒光強度達到最大。此結(jié)果與表1中顏色變化規(guī)律基本一致。

2.3 選擇性研究

比色檢測體系的一個重要指標就是檢測選擇性，現(xiàn)實樣品中往往存在有其他種類的金屬離子，此類離子會在一定程度上干擾檢測體系。本研究選擇300μmol/L汞離子濃度作為參照標準，選擇8種樣品中常見的金屬離子用作干擾研究，常見金屬離子為Fe3+、Cu2+、Na+、K+、Ca2+、Zn2+、Mg2+、Mn2+，每種金屬離子的濃度為汞離子濃度的50倍，即1.5mmol/L。

由表2A組結(jié)果可知，當相同的反應(yīng)體系中加入不同的金屬離子后，只有汞離子的反應(yīng)體系的顏色發(fā)生了變化，變?yōu)樗{灰色，此結(jié)果與表1基本一致，而其余離子的反應(yīng)體系顏色沒有發(fā)生明顯的改變，初步說明基于特異性核酸適配體的金納米比色探針具有較強的檢測選擇性。由表2B組可知，當汞離子與8種不同金屬離子分別同時出現(xiàn)在檢測體系中時，反應(yīng)顏色基本一致，沒有發(fā)生明顯變化，說明本研究所設(shè)計的檢測體系具有選擇性。

表2 汞離子比色檢測選擇性能Table 2 Selectivity of colorimetric detection of mercury ion

3 結(jié)論

本文將納米金和DNA相結(jié)合，設(shè)計了一種基于鹽誘導(dǎo)納米金聚集的比色檢測Hg2+的方法。設(shè)計的鑷子型dsDNA能夠有效地保護金納米粒子，且其結(jié)構(gòu)非常有利于“T-Hg2+-T”的形成。將這種鑷子型DNA與納米金相結(jié)合對Hg2+進行檢測，可實現(xiàn)對Hg2+的快速檢測。本方法具有良好的靈敏性和特異性，為對重金屬離子的檢測及環(huán)境污染分析技術(shù)的改進提供理論參考依據(jù)。

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Colorimetric biosensing of Mercury（II） ion using the novel aptamer modified gold nanoparticles as a probe

YU Jia，SUN Lu，CHI De-fu*
（College of Forestry，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China）

A simple and rapid colorimetric method was developed for the detection of Hg2+based on the specific thymine T-Hg2+-T structure and gold nanoparticles （AuNPs） in the presence of a given high concentration of salt.The gold nanoparticles were prepared by the NaBH4reduction method.Transmission electron microscopy，laser particles size analyzer，and UV-vis spectroscopy were used to characterize the samples.The aptamer was designed to attach to AuNPs and effectively prevent AuNPs from salt induced aggregation.While the presence of Hg2+ions，the AuNPs were less well-protected thus aggregated at the salt concentration ，resulting into a color change.It could be colorimetric quantitative analysis of the concentration of Hg2+.The results showed that the product with good stability and good distribution could be obtained with taking sodium borohydride as reductant AuNPs had a mean diameter of 27nm.It was observed that the aptamer-stabilized AuNPs solution showed a color change from red-to-blue when Hg2+was added into the solution.The aptamer-AuNPs exhibited strong fluorescence emission ， while upon addition Hg2+， the solution showed a dramatic increase of the fluorescence intensity as a result of the aggregation behavior of the AuNPs.The paper based sensor showed high selectivity for 8 kinds of metal ions.

gold nanoparticles；mercury（II）；colorimetric probe；drinking water safety

O561.3

A

1002-0306（2014）22-0053-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.002

2014－01－15

宇佳（1978-），女，助理研究員，主要從事生物分析方面的研究。

* 通 訊 作 者 ：遲德 富（1962-），男，教授 ，主要 從事 保護 生物 學(xué) 方面 的研究。

國家科技支撐計劃課題（2012BAD19B07）。