徐艷陽(yáng)，李科靜，仇 洋，鄭 麗

（吉林大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130022）

大米黑曲霉的微波殺菌工藝優(yōu)化

徐艷陽(yáng)，李科靜，仇 洋，鄭 麗

（吉林大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130022）

為了探討微波處理對(duì)大米霉菌的殺滅效果，以黑曲霉為研究對(duì)象，應(yīng)用響應(yīng)面法對(duì)大米中黑曲霉的微波殺菌工藝進(jìn)行優(yōu)化研究，考查微波功率、微波時(shí)間和菌懸液體積對(duì)大米黑曲霉孢子減少對(duì)數(shù)周期的影響，并建立相應(yīng)的模型。結(jié)果表明最佳工藝條件為：微波功率231W、微波時(shí)間4min、菌懸液體積97mL，在此條件下黑曲霉孢子減少對(duì)數(shù)周期為4.8920±0.0882，實(shí)際值與理論值的相對(duì)誤差為4.37%。與水浴加熱法相比，微波法的殺菌效果是其殺菌效果的8.5倍。

大米，黑曲霉，微波，殺菌，響應(yīng)面法

稻谷是我國(guó)主要的糧食作物之一，年產(chǎn)量約1.85億t[1]，折合大米1.26億噸，約占糧食總產(chǎn)量的40%。我國(guó)每年因大米霉變?cè)斐傻膿p失約100萬(wàn)噸[2]，引起大米霉變的菌屬主要有青霉屬、曲霉屬、根霉屬和鐮刀霉屬，其中青霉屬和曲霉屬是優(yōu)勢(shì)菌屬，產(chǎn)生毒素的主要是曲霉屬和鐮刀霉屬[3-5]。黑曲霉是曲霉屬中一個(gè)常見(jiàn)菌種，在糧食中廣泛存在[6]。在高溫、高濕環(huán)境下儲(chǔ)藏，糧食中的霉菌就極容易大量生長(zhǎng)繁殖產(chǎn)酶生熱，且在代謝過(guò)程中還會(huì)產(chǎn)生毒素，嚴(yán)重危害人體的健康[7-8]。

微波是指頻率為300MHz~300GHz之間的電磁波，利用微波殺菌是近年來(lái)新興的殺菌方法之一，因其在殺菌過(guò)程中具有快速、高效、安全、環(huán)保等特點(diǎn)[9-10]，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和食品工業(yè)[11-13]。目前，國(guó)外學(xué)者Lee KY等[14]研究了微波誘導(dǎo)的氬等離子體對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺菌作用；Hamoud-Agha M M等[15]研究了大腸桿菌的微波失活；Fang Y P等[16]研究了低劑量的微波輻射對(duì)大米中寄生曲霉的殺菌作用 ；張 習(xí) 軍 等[17]研 究 了 微 波 處 理 對(duì) 大 米 的 加 工 、食用、儲(chǔ)藏等品質(zhì)的影響；胡堅(jiān)[5]對(duì)微波殺滅大米中寄生曲霉的機(jī)理進(jìn)行了探究，但對(duì)大米中黑曲霉的微波殺菌作用方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本文針對(duì)大米中黑曲霉進(jìn)行微波殺菌工藝研究，擬將微波殺菌應(yīng)用到大米防霉過(guò)程中，避免傳統(tǒng)的化學(xué)方法如藥劑熏蒸帶來(lái)的藥物殘留和污染問(wèn)題，以及物理方法如低溫氣調(diào)儲(chǔ)藏成本高等缺點(diǎn)，為糧食儲(chǔ)藏高質(zhì)量、高營(yíng)養(yǎng)、高效益、低損耗、低污染的目標(biāo)提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑曲霉 吉林大學(xué)食品微生物實(shí)驗(yàn)室從大米中分離、鑒定得到；磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵、苯酚、氯化鈉、無(wú)水乙醇、氯化鉀 北京化工廠；瓊脂 海南省瓊海長(zhǎng)坡瓊青瓊脂廠；蔗糖、硝酸鈉 西隴化工股份有限公司；硫酸鎂 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；甘油、吐溫-80 天津市華東試劑廠；所用試劑 均為分析純。

MM721AAU-PW美的微波爐 美的微波電器制造有限公司；JA3003A電子精密天平 上海精天電子儀器有限公司；LD4-2A低速離心機(jī) 北京雷勃爾離心機(jī)有限公司；DSX-280A不銹鋼手提式高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；DHP060恒溫培養(yǎng)箱 上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司；DMXY數(shù)碼生物顯微鏡 浙江寧波舜寧儀器有限公司；SW-CJ-1DF潔凈工作臺(tái) 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；QL-901試管振蕩器 金壇市醫(yī)療儀器廠；SHA-C水浴恒溫振蕩器 江蘇金壇市恒豐儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黑曲霉孢子菌懸液的制備 將斜面保藏的黑曲霉轉(zhuǎn)接至平板中，28℃進(jìn)行純培養(yǎng)3~5d后，用一定量的洗脫液（體積分?jǐn)?shù)0.05%吐溫-80、pH為7.0~ 7.2的磷酸鹽緩沖液）將孢子洗至裝有玻璃珠的錐形瓶中，搖勻、用紗布過(guò)濾除去菌絲體，4000r/min離心15min后，用0.85%生理鹽水將菌懸液濃度調(diào)至106CFU/mL備用。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)指標(biāo) 黑曲霉微波殺菌效果采用孢子減少對(duì)數(shù)周期（Y）表示：

式中，N為經(jīng)微波處理后的菌落數(shù)（CFU/mL），N0為初始的菌落數(shù)（CFU/mL），黑曲霉菌落計(jì)數(shù)按照GB4789.15-2010。

1.3 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 微波功率對(duì)大米黑曲霉孢子減少對(duì)數(shù)周期的影響 量取5份100mL黑曲霉孢子菌懸液，在119、231、385、539、700W條件下微波4min后，測(cè)其菌落數(shù)，計(jì)算孢子減少對(duì)數(shù)周期。

1.3.2 微波時(shí)間對(duì)大米黑曲霉孢子減少對(duì)數(shù)周期的影響 量取5份100mL黑曲霉孢子菌懸液，在119W功率下，分別處理2、4、6、8、10min后，測(cè)其菌落數(shù)，計(jì)算孢子減少對(duì)數(shù)周期。

1.3.3 菌懸液體積對(duì)大米黑曲霉孢子減少對(duì)數(shù)周期的影響 在119W功率下，菌懸液體積分別為50、100、150、200、250mL微波4min后，測(cè)其菌落數(shù)，計(jì)算孢子減少對(duì)數(shù)周期。

1.3.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以微波功率、微波時(shí)間、菌懸液體積作為考察因素，黑曲霉孢子減少對(duì)數(shù)周期為指標(biāo)，采用Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化研究，各因素水平設(shè)計(jì)及編碼見(jiàn)表1。

1.4 水浴加熱法殺菌對(duì)比實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 微波殺菌法 量取3份97mL菌懸液，在微波時(shí)間4min、微波功率231W條件下進(jìn)行處理后，測(cè)其菌落數(shù)，計(jì)算3次處理黑曲霉孢子減少對(duì)數(shù)周期的平均值。

1.4.2 水浴加熱法 將水浴溫度升至87℃，取3個(gè)裝有97mL菌懸液的錐形瓶，水浴加熱4min后，計(jì)算3次處理的平均值。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，采用Excel2007軟件計(jì)算平均 值 、標(biāo) 準(zhǔn) 偏 差 及 繪 圖 ，采 用 SPSS17.0和 Design-Expert 8.05軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

表1 實(shí)驗(yàn)因素水平編碼表Table 1 Coded variables and levels of facters

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 微波功率對(duì)大米黑曲霉孢子減少對(duì)數(shù)周期的影響 在菌懸液體積、微波時(shí)間相同的條件下，考察不同的微波功率對(duì)黑曲霉孢子減少對(duì)數(shù)周期的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 微波功率對(duì)大米黑曲霉孢子減少對(duì)數(shù)周期的影響Fig.1 Effects of microwave power on log-periodic reduction of spores of Aspergillus niger from rice

由圖1可知，微波功率與黑曲霉孢子減少對(duì)數(shù)周期呈正相關(guān)趨勢(shì)，通過(guò)方差分析，微波功率對(duì)黑曲霉孢子減少對(duì)數(shù)周期的影響顯著（p＜0.05）。經(jīng)LSD多重差異比較分析，385、539、700W之間差異不顯著（p＞0.05），當(dāng)微波功率為385W時(shí)，菌懸液在殺菌過(guò)程中開(kāi)始出現(xiàn)沸騰和沖出現(xiàn)象。因此從實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可實(shí)施性角度考慮，微波功率選231W較佳。

2.1.2 微波時(shí)間對(duì)大米黑曲霉孢子減少對(duì)數(shù)周期的影響 在菌懸液體積、微波功率相同的條件下，考察不同的微波時(shí)間對(duì)黑曲霉孢子減少對(duì)數(shù)周期的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可知，隨著微波時(shí)間的增長(zhǎng)，黑曲霉孢子減少對(duì)數(shù)周期逐漸增大，通過(guò)方差分析，微波時(shí)間對(duì)黑曲霉孢子減少對(duì)數(shù)周期的影響顯著（p＜0.05）。當(dāng)微波時(shí)間為6min時(shí)，菌懸液開(kāi)始出現(xiàn)沸騰現(xiàn)象并有液體沖出，菌懸液體積減少約10mL。因此，從實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性考慮，選4min為較佳微波時(shí)間。

2.1.3 菌懸液體積對(duì)大米黑曲霉孢子減少對(duì)數(shù)周期的影響 在微波時(shí)間、功率相同的條件下，考察不同的菌懸液體積對(duì)大米黑曲霉孢子減少對(duì)數(shù)周期的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可知，菌懸液體積與黑曲霉孢子減少對(duì)數(shù)周期呈負(fù)相關(guān)趨勢(shì)，通過(guò)方差分析，菌懸液體積對(duì)黑曲霉孢子減少對(duì)數(shù)周期的影響顯著（p＜0.05）。經(jīng)LSD多重差異比較分析，50與100mL、200與250mL之間差異不顯著（p＞0.05）；100、150、200mL之間差異顯著（p＜0.05），當(dāng)菌懸液體積為50mL時(shí)，菌懸液在殺菌過(guò)程中出現(xiàn)沸騰和液體沖出現(xiàn)象。因此，選100mL為較佳菌懸液體積。

圖2 微波時(shí)間對(duì)大米黑曲霉孢子減少對(duì)數(shù)周期的影響Fig.2 Effects of microwave time on log-periodic reduction of spores of Aspergillus niger from rice

圖3 菌懸液體積對(duì)大米黑曲霉孢子減少對(duì)數(shù)周期的影響Fig.3 Effects of mould suspension volume on log-periodic reduction of spores of Aspergillus niger from rice

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化與分析

2.2.1 回歸方程的建立及顯著性檢驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，用Design-Expert 8.05軟件對(duì)各因素及水平進(jìn)行設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2和表3。

應(yīng)用Design-Expert 8.05軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到黑曲霉孢子減少對(duì)數(shù)周期（Y）與微波功率（A）、微波時(shí)間（B）、菌懸液體積（C）的二次回歸方程為：

Y=+5.10+0.40A-0.28B+0.43C-1.45AB+1.83AC+ 2.27BC-1.98A2-1.42B2-1.10C2

由表3可知，決定系數(shù)R2=0.9953，說(shuō)明該模型擬合程度較好，p＜0.0001表明該模型有非常高的顯著性，失擬項(xiàng)p=0.1602＞0.05不顯著，表明該模型不失擬，可以用于大米黑曲霉微波殺菌工藝優(yōu)化的研究；從回歸方程中一次項(xiàng)的方差分析中可知，微波功率、微波時(shí)間和菌懸液體積對(duì)黑曲霉孢子減少對(duì)數(shù)周期的影響為極顯著；從交互項(xiàng)方差分析中得出微波時(shí)間和菌懸液體積的交互作用、微波功率和微波時(shí)間、微波功率和菌懸液體積交互作用極顯著。

表2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of experiments

表3 二次回歸方程的方差分析Table 3 ANOVA for quadratic regression equation

2.2.2 響應(yīng)面分析 根據(jù)回歸方程來(lái)繪制交互作用較為明顯的響應(yīng)面立體分析圖，結(jié)果見(jiàn)圖4~圖6。

由圖4可知，隨著微波功率的增加，黑曲霉孢子減少對(duì)數(shù)周期先增后減；隨著微波時(shí)間的延長(zhǎng)，黑曲霉孢子減少對(duì)數(shù)周期先增后減，且因微波功率曲面較陡，所以微波功率對(duì)黑曲霉孢子減少對(duì)數(shù)周期的影響較微波時(shí)間顯著。等高線的形狀反映出兩因素交互作用的強(qiáng)弱，橢圓形表示交互作用顯著，圓形表示交互作用不顯著，由圖4中等高線圖可以看出，微波時(shí)間和微波功率的交互作用顯著。

圖4 微波功率與微波時(shí)間對(duì)大米黑曲霉孢子減少對(duì)數(shù)周期影響的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface plots of effects of microwave power and microwave time on log-periodic reduction of spores of Aspergillus niger from rice

圖5 微波功率與菌懸液體積對(duì)大米黑曲霉孢子減少對(duì)數(shù)周期影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plots of effects of microwave power and mould suspension volume on log-periodic reduction of spores of Aspergillus niger from rice

圖6 微波時(shí)間與菌懸液體積對(duì)大米黑曲霉孢子減少對(duì)數(shù)周期影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plots of effects of microwave time and mould suspension volume on log-periodic reduction of spores of Aspergillus niger from rice

由圖5可知，隨著微波功率的增加，黑曲霉孢子減少對(duì)數(shù)周期先增后減；隨著菌懸液體積的增多，黑曲霉孢子減少對(duì)數(shù)先增后減，且菌懸液體積曲面較陡，菌懸液體積較微波功率影響顯著。等高線圖呈橢圓形，所以菌懸液體積和微波功率的交互作用顯著。

從圖6看出，隨著菌懸液體積的增多，黑曲霉孢子減少對(duì)數(shù)周期逐漸減小，隨著微波時(shí)間的延長(zhǎng)，黑曲霉孢子減少對(duì)數(shù)周期呈逐漸增大的趨勢(shì)，因菌懸液體積曲面較陡，菌懸液體積較微波時(shí)間影響顯著。由圖6中等高線圖呈橢圓形可知，菌懸液體積和微波時(shí)間的交互作用顯著。

通過(guò)響應(yīng)面分析可知，影響微波殺菌的因素大小順序?yàn)椋壕鷳乙后w積＞微波功率＞微波時(shí)間。當(dāng)微波功率264W、微波時(shí)間3.39min、菌懸液體積96.94mL時(shí)，黑曲霉孢子減少對(duì)數(shù)周期達(dá)到理論最大值5.1153。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

實(shí)際設(shè)備的功率最大可達(dá)231W，所以考慮到實(shí)際操作性，對(duì)理論值進(jìn)行修正：微波功率231W、微波時(shí)間4min、菌懸液體積97mL此時(shí)大米黑曲霉孢子減少對(duì)數(shù)周期為4.8920±0.0882，與理論值相差4.37%，表明用響應(yīng)面法優(yōu)化得到大米中黑曲霉微波殺菌的工藝條件是可靠的。

2.4 對(duì)比實(shí)驗(yàn)

微波殺菌法和水浴加熱法對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果值見(jiàn)表4。

表4 微波殺菌法和水浴加熱法對(duì)比實(shí)驗(yàn)（n=3）Table 4 Comparative experiment of microwave treatment andwater-bath heating treatment（n=3）

水浴加熱處理后的黑曲霉孢子減少對(duì)數(shù)周期為0.5764±0.0043；微波法處理后的黑曲霉孢子減少對(duì)數(shù)周期為4.8920±0.0882。因此，微波法的殺菌效果是水浴加熱法的8.5倍。

3 結(jié)論

采用三因素三水平響應(yīng)面法對(duì)大米中黑曲霉微波殺菌工藝進(jìn)行優(yōu)化研究，獲得微波殺菌的最佳條件為：微波功率231W、微波時(shí)間4min、菌懸液體積97mL。通過(guò)三次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)得黑曲霉孢子減少對(duì)數(shù)周期為4.8920±0.0882，實(shí)際測(cè)定值與理論預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為+4.37%。與水浴加熱法相比，微波法的殺菌效果是其8.5倍。

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Process optimization of microwave sterilization for Aspergillus niger from rice

XU Yan-yang，LI Ke-jing，QIU Yang，ZHENG Li
（College of Biological and Agricultural Engineering，Jilin University，Changchun 130022，China）

In order to explore the killing effects of microwave treatment on molds from rice ，response surface methodology was used to optimize process of microwave sterilization Aspergillus niger from rice.Effect of microwave power， microwave time ，and mould suspension volume on log-periodic reduction of spores of Aspergillus niger from rice were investigated，and corresponding regression equation was established.Results showed that optimum sterilization conditions were as follows：microwave power of 231W，microwave time of 4min，and mould suspension volume of 97mL.Under these conditions，log-periodic reduction of spores of Aspergillus niger was 4.8920±0.0882 ，relative error between determined and predicted value of log-periodic reduction of spores was 4.37%.Compared with water-bath heating treatment，effect of microwave sterilization was 8.5 times as much.

rice；Aspergillus niger；microwave；sterilization；response surface methodology

TS210

B

1002-0306（2014）22-0245-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.045

2014－02－13

徐艷陽(yáng)（1972-），女，博士，副教授，主要從事食品營(yíng)養(yǎng)與安全方面的研究。

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（20120717）；吉林大學(xué)本科教學(xué)改革研究項(xiàng)目（2013138）；吉林大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目（450060487501）。