顏成英，湯曉艷，王 敏，康大成，李朋穎，龔 艷

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，教育部肉品加工與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210095）

鼠傷寒沙門氏菌鞭毛蛋白提取及多抗制備

顏成英1，2，湯曉艷1，*，王 敏1，康大成1，李朋穎1，龔 艷1

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，教育部肉品加工與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210095）

鼠傷寒沙門氏菌是沙門氏菌屬常見(jiàn)致病菌，其鞭毛蛋白具有抗原性，可誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對(duì)該蛋白的抗體。實(shí)驗(yàn)采用直接提取法獲得鼠傷寒沙門氏菌鞭毛蛋白，并以該蛋白為抗原免疫小鼠，制備鞭毛蛋白多抗，使用間接ELISA方法測(cè)定多抗的效價(jià)和特異性。SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蛋白條帶單一，分子量大小為57ku，說(shuō)明提取的鞭毛蛋白是目標(biāo)蛋白且純度較高；間接ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，制備多抗的效價(jià)為1∶102400，除與豬霍亂沙門氏菌發(fā)生交叉反應(yīng)外，與其他6種沙門氏菌和6種常見(jiàn)非沙門氏菌屬的致病菌均不發(fā)生反應(yīng)，說(shuō)明該抗體的效價(jià)較高，特異性較好，可以用于與磁珠的偶聯(lián)，為免疫磁珠的制備打下基礎(chǔ)。

鼠傷寒沙門氏菌，鞭毛蛋白，多抗

鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）是沙門氏菌屬最常見(jiàn)的血清型，是造成食物中毒和人類腸胃炎的重要致病菌，也是導(dǎo)致雞肉及相關(guān)產(chǎn)品污染的主要原因[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)2010年由鼠傷寒沙門氏菌引起的食物中毒事件占沙門氏菌食物中毒事件總數(shù)的22.8%[2]。對(duì)于沙門氏菌的檢測(cè)，雖然傳統(tǒng)檢測(cè)方法準(zhǔn)確度較高，但是耗時(shí)、耗力[3]，為了滿足快速檢測(cè)的要求，國(guó)內(nèi)外學(xué)者發(fā)明并發(fā)展了以免疫學(xué)為基礎(chǔ)的[4]或以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的[5]快速檢測(cè)方法。因免疫學(xué)檢測(cè)方法無(wú)需特殊儀器，且具有反應(yīng)成本較低、易于操作、易于基層推廣等特點(diǎn)，在沙門氏菌的檢測(cè)中占有重要地位[6]。免疫磁性分離法（IMS）是免疫學(xué)方法之一，該方法是將特異性抗體偶聯(lián)在磁性顆粒表面制成免疫磁珠，免疫磁珠與樣品中的目標(biāo)細(xì)菌特異性結(jié)合，在外加磁場(chǎng)的作用下，達(dá)到將目標(biāo)細(xì)菌分離、濃縮的目的。近年來(lái)IMS技術(shù)已廣泛用于各種致病菌[7-8]、生物大分子的檢測(cè)[9]。IMS技術(shù)的核心材料是可與磁珠偶聯(lián)的抗體和可偶聯(lián)抗體的磁珠，本實(shí)驗(yàn)的目的在于首先獲得鼠傷寒沙門氏菌鞭毛蛋白，然后免疫BALB/c小鼠，最終獲得鞭毛蛋白多抗，同時(shí)檢驗(yàn)多抗的特異性和效價(jià)，為鼠傷寒沙門氏菌免疫磁珠的制備和將該免疫磁珠應(yīng)用于鼠傷寒沙門氏菌的檢測(cè)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鼠傷寒沙門氏菌等共14種菌株 中國(guó)微生物菌種保藏中心；BALB/c小鼠（6～8周） 北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心維通利華公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑 美國(guó)GIBCO BRL公司；牛血清蛋白（BSA） 北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；HRP標(biāo)記羊抗鼠抗體 上?？笊锛夹g(shù)有限公司；BCA試劑盒 美國(guó)Thermo Scientific公司；其他普通化學(xué)試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

D-1型自動(dòng)蒸汽滅菌鍋 北京恩發(fā)科技有限公司；SKY-1102c型恒溫?fù)u床 上海蘇坤儀器設(shè)備公司；全能臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Thermo公司；NanoDrop 2000C 型 紫 外 可 見(jiàn) 分 光 光 度 計(jì) 美 國(guó)Thermo Fisher公司；垂直電泳儀 美國(guó)BIO-RAD公司；CP80WX型冷凍超速離心機(jī) 日本Hitachi Koki公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 配制液體培養(yǎng)基 根據(jù)文獻(xiàn)[10]配制改進(jìn)液體培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基可促進(jìn)菌種的復(fù)蘇，也可誘導(dǎo)鞭毛的生長(zhǎng)。培養(yǎng)基具體配制方法如下，A溶液的配制：（NH4）2SO410.0g，Na2HPO430.0g，KH2PO415.0g，NaCl l5.0g，Na2SO40.055g溶 解 于1L雙 蒸 水 中 ，用 1mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH到7.2。B溶液的配制：MgCl20.25g，CaCl20.013g，F(xiàn)eCl3·7H2O 0.0006g，酵 母 浸 膏 0.125g，DL- 色氨酸、L-組氨酸、L-脯氨酸、L-蘇氨酸、L-精氨酸、DL-α-丙氨酸、L-蛋氨酸、甘氨酸各0.31g溶解于1L雙蒸水中，用1mol/L HCl調(diào)節(jié)pH到7.2。A、B液分別高壓蒸氣滅菌，100mL溶液A與400mL溶液B混合，再加入10mL 25%（w/v）無(wú)菌葡萄糖溶液。

1.2.2 鞭 毛 蛋 白 的 提 取 鞭 毛 蛋 白 的 提 取 參 考Ibrahim[11]介紹的方法，具體步驟是：將鼠傷寒沙門氏菌接種于含有500mL培養(yǎng)液的1000mL錐形瓶中，37℃，80r/min振蕩培養(yǎng)18h然后5000×g離心30min收集細(xì)菌，加入35mL滅菌生理鹽水溶解細(xì)菌沉淀，加入1mol/L的HCl調(diào)pH至2.0，室溫磁力攪拌30min，5000×g離心30min后棄沉淀，將上清進(jìn)一步100，000×g離 心 lh后 棄 沉 淀 ，收 集 上 清 液 ，緩 慢 加 入 1mol/L NaOH調(diào)pH至7.2，量取上清液的體積，緩慢加入（NH4）2SO4至 終 濃 度 為2.67mol/L，邊 加 邊 磁 力 攪 拌 ，使（NH4）2SO4完全溶解，混懸液4℃放置過(guò)夜，15，000×g 4℃離心15min，棄上清液，用約5mL滅菌蒸餾水使沉淀溶解完全。將溶解物轉(zhuǎn)移至預(yù)先處理過(guò)的透析袋，流水透析2h，之后將透析袋放入4L含20g活性炭的滅菌蒸餾水中，4℃條件下磁力攪拌18h，透析過(guò)的鞭毛蛋白小量分裝，20℃凍存。

1.2.3 鞭毛蛋白SDS-PAGE 用4%的濃縮膠（上層膠），10%的分離膠（下層膠）作為分離載體進(jìn)行電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，具體操作按照文獻(xiàn)[12]中的方法進(jìn)行。

1.2.4 鞭毛蛋白濃度的測(cè)定 使用BCA法檢測(cè)鞭毛蛋白濃度，具體操作方法按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.5 小鼠鞭毛蛋白抗血清的制備 參照文獻(xiàn)[13]免疫小鼠，多點(diǎn)皮下注射BALB/c小鼠，50μg/只。每隔2周加強(qiáng)免疫一次，從第三次免疫后開(kāi)始監(jiān)測(cè)血清，于加強(qiáng)免疫后7d眼眶采血，檢測(cè)抗血清效價(jià)。待效價(jià)穩(wěn)定后，斷頭采血，4℃靜止12h，離心后取上清液，加等量甘油，-20℃凍存。

1.2.6 抗體效價(jià)及特異性檢測(cè) 抗血清效價(jià)的檢測(cè)使用間接ELISA法[14]，鞭毛蛋白抗原稀釋104倍包被酶標(biāo)板，抗血清以1∶100為起始濃度做2倍比稀釋，未免疫小鼠血清為陰性對(duì)照，二抗辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG稀釋4000倍，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔OD450值，檢測(cè)孔/陰性對(duì)照孔的P/N值＞2．1判為陽(yáng)性。特異性檢測(cè)使用8種沙門氏菌和6種常見(jiàn)非沙門氏菌屬致病菌包被酶標(biāo)板，利用間接ELISA方法檢測(cè)抗體的特異性，未免血清（80000×稀釋）做陰性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 鞭毛蛋白的提取和檢測(cè)

鞭毛是致病菌發(fā)揮致病作用必需的毒力決定成分[15]，鞭 毛 蛋 白 可 以 通 過(guò) 直 接 提 取[16-17]和 原 核 表達(dá)[18-19]兩種方法獲得，本研究采用酸解法直接提取鞭毛蛋白。先將重懸后的菌體細(xì)胞調(diào)pH至2.0并在4℃條件下磁力攪拌30min使菌體與鞭毛充分分離，消除RNA等污染物對(duì)鞭毛提取的影響，然后再經(jīng)不同pH環(huán)境和不同離心速度處理后，得到富含鞭毛蛋白的溶 液 ，最 后 使 用（NH4）2SO4鹽 析 獲 得 目 標(biāo) 鞭 毛 蛋 白 。Ibrahim[11]和Strindelius等[20]均用此方法獲得了純度較高的目標(biāo)鞭毛蛋白。本實(shí)驗(yàn)SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果顯示，凝膠成像系統(tǒng)分析蛋白條帶主要在57.0ku處（見(jiàn)圖1），實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Ibrahim[11]一致。而王鶴等通過(guò)FliC基因原核表達(dá)方法獲得的鼠傷寒沙門氏菌鞭毛蛋白的 分 子 量 為56ku[19]，兩 種 方 法 獲 得 鞭 毛 蛋 白 的 分 子量不相同，可能是由于菌株一級(jí)結(jié)構(gòu)不同造成的[21]。

圖1 鞭毛蛋白SDS-PAGE結(jié)果Fig.1 The SDS-PAGE result of flagellin

BCA法測(cè)得鞭毛提取物的蛋白濃度為3.51mg/mL，共5mL，故每500mL肉湯培養(yǎng)液提取鞭毛蛋白約17mg。

2.2 小鼠鞭毛蛋白抗血清效價(jià)測(cè)定

抗血清效價(jià)測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)抗原濃度一定時(shí)，隨著抗體稀釋度的增加，P/N值呈現(xiàn)先保持不變到逐漸降低的趨勢(shì)，以樣本孔OD450值與陰性對(duì)照孔OD450的比值大于2.1為陽(yáng)性，以陽(yáng)性孔的最大稀倍數(shù)為效價(jià)可知，制備的鞭毛蛋白多抗的效價(jià)是1∶102400。

表1 鞭毛蛋白多抗效價(jià)的測(cè)定Table 1 The valence detection of the antibody

2.3 抗血清特異性測(cè)定

間接ELISA法測(cè)定抗血清特異性結(jié)果見(jiàn)表2。從表中數(shù)據(jù)可知，制備的鞭毛蛋白多抗僅與鼠傷寒沙門氏菌和豬霍亂沙門氏菌反應(yīng)，與其他6株沙門氏菌、6株常見(jiàn)非沙門氏菌屬致病菌均不反應(yīng)，說(shuō)明多抗的特異性較好。

表2 鞭毛蛋白多抗特異性檢測(cè)Table 2 The specificity detection of the antibody

綜合抗血清的效價(jià)和特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，制備的抗血清效價(jià)高、特異性強(qiáng)，可用于免疫磁珠的制備。雖然抗血清與豬霍亂沙門氏菌存在交叉反應(yīng)，制備的免疫磁珠也可能富集豬霍亂沙門氏菌，但是該缺點(diǎn)可通過(guò)將免疫磁珠與ELISA、PCR等其他檢驗(yàn)技術(shù)聯(lián)用的方法進(jìn)行克服，使該方法具有更高的特異性、靈敏度和分離效率。

3 結(jié)論

采用直接提取方法獲得了鼠傷寒沙門氏菌的鞭毛蛋白，蛋白SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，蛋白條帶單一且分子量大小為57ku，說(shuō)明提取的鞭毛蛋白是目標(biāo)蛋白且純度較高；以該蛋白為抗原免疫小鼠制備得到鞭毛蛋白多抗，間接ELISA方法測(cè)定多抗的效價(jià)為1∶102400，且除與豬霍亂沙門氏菌發(fā)生交叉反應(yīng)外，與其他6種沙門氏菌和6種常見(jiàn)非沙門氏菌屬的致病菌均不發(fā)生反應(yīng)，說(shuō)明該抗體的效價(jià)較高，特異性較好，可以用于與磁珠的偶聯(lián)，為免疫磁珠的制備打下基礎(chǔ)。

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Extraction of flagellin from Salmonella typhimurium and preparation of its polyclonal antibody

YAN Cheng-ying1，2，TANG Xiao-yan1，*，WANG Min1，KANG Da-cheng1，LI Peng-ying1，GONG Yan1
（1.Key Laboratory of Agrifood Safety and Quality，Ministry of Agriculture，Institute of Quality Standards and Testing Technology for Agro-products，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China；2.Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control，Ministry of Education，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China）

Salmonella typhimurium is the most common pathogenic bacterium in salmonella and had flagellin of antigenicity which could induce immune system to produce antibody.Our research adopted direct extract method to get flagellin of salmonella，and used this protein as antigen to immune mice for flagellin polyclonal antibody.In this research，valence and specificity of antibody were tested through indirect ELISA testing.SDSPAGE experiment showed protein stripe was single and molecular weight was 57ku，which means extracted flagellin was the target protein and it’s of high purity.ELISA testing indicated that the valence of antibody was 1 ∶102400 and it had cross reaction with Salmonella choleraesuis only while it didn ’ t react with other 6 salmonella and 6 common pathogenic bacteria of non-salmonella.It stated this antibody had high valence and good specificity and could be used to couple with magnetic bead.

Salmonella typhimurium；flagellin；polyclonal antibody

TS251.7

A

1002-0306（2014）22-0176-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.030

2014－02－24

顏成英（1988-），女，在讀碩士研究生，研究方向：畜產(chǎn)品質(zhì)量與安全。

* 通訊作者：湯曉艷（1976-），女，博士，研究員，研究方向：畜產(chǎn)品質(zhì)量與安全標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)。

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD28B03）；國(guó)家自然青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31000799）；國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)（CARS-42）。