鄺筱珊，成曉維，游淑珠，王小玉，劉李登，馮家望

（珠海出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東珠海 519015）

食品過敏原大豆成分LAMP實(shí)時(shí)濁度檢測法的建立

鄺筱珊，成曉維，游淑珠，王小玉，劉李登，馮家望*

（珠海出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東珠海 519015）

根據(jù)過敏原大豆的保守內(nèi)源基因Lectin的序列，設(shè)計(jì)6條特異性LAMP引物，利用實(shí)時(shí)濁度儀對(duì)反應(yīng)體系中擴(kuò)增產(chǎn)物的實(shí)時(shí)監(jiān)控篩選出最佳引物，建立食品中過敏原大豆成分的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）檢測方法，并對(duì)該方法的特異性、靈敏度、穩(wěn)定性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果表明：該方法能夠特異性檢出食品中的過敏原大豆成分，特異性高，靈敏度達(dá)0.1%（w/w）。對(duì)含有大豆成分為10%、1%、0.1%、0%（w/w）的樣品分別進(jìn)行20次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，其穩(wěn)定性好，假陽性和假陰性率為0%。本實(shí)驗(yàn)建立的LAMP方法適用于特異性快速檢測食品中的過敏原大豆成分。

環(huán)節(jié)導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法（LAMP），實(shí)時(shí)濁度儀，過敏原，大豆，檢測

食物過敏是人的機(jī)體對(duì)外源物質(zhì)（過敏原）產(chǎn)生的一種常見變態(tài)反應(yīng)。在過去的20年里，食物過敏的發(fā)病率顯著上升，過敏原己成為食品安全隱患之一[1]。各國政府和國際組織非常重視這個(gè)問題，先后通過嚴(yán)密的科學(xué)調(diào)查和理發(fā)論證，相繼修改和出臺(tái)規(guī)范食品中過敏物質(zhì)標(biāo)識(shí)的法律方案，對(duì)食品標(biāo)簽上過敏原成分的標(biāo)注作出嚴(yán)格規(guī)定，尤其是歐美、日本等發(fā)達(dá)國家[2]。我國的國家標(biāo)準(zhǔn)GB7718-2011《預(yù)包裝食品標(biāo)簽通則》也推薦標(biāo)識(shí)大豆等常見致敏物質(zhì)。大豆作為含有豐富蛋白質(zhì)的豆科植物，由于其豐富的營養(yǎng)特性和功能屬性被廣泛應(yīng)用于配方食物、肉類和家禽類產(chǎn)品、面包點(diǎn)心、乳制品和各種可食用產(chǎn)品中。據(jù)報(bào)道，有90%的食物過敏情況都是由八大類食品造成的，而大豆就是其中之一[3]。大豆過敏患者在攝食大豆及其制品或者吸入大豆粉末時(shí)可能出現(xiàn)惡心、嘔吐、舌咽腫、嘴唇紅腫、口腔疼痛和一些腸道疾病等臨床癥狀，嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致休克甚至死亡[4]。關(guān)于食用大豆后過敏致死的事件已有報(bào)道[5]。

目前，對(duì)食物過敏最有效最直接的治療手段是避免食用含有過敏原的食物，因此大豆過敏原檢測技術(shù)對(duì)大豆過敏患者的安全消費(fèi)意義重大。食物過敏原檢測方法既可以基于蛋白，也可以基于DNA[6-8]。前者包括電泳法[9]、色譜法、質(zhì)譜法和免疫學(xué)方法，如酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）[10]、放射過敏原吸收抑制實(shí)驗(yàn)[11]、免疫印跡[12]和免疫擴(kuò)散及各種試劑盒等；后者主要采用各種PCR方法，如實(shí)時(shí)熒光定量PCR、多重PCR等[13-15]。也有新型技術(shù)如生物傳感器[16]、生物芯片技術(shù)[17]等方法。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop mediated isothermal amplification，LAMP）是Notami等開發(fā)的一種簡單快速、特異性強(qiáng)的體外恒溫?cái)U(kuò)增方法[18]。該方法針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異的引物，利用鏈置換DNA聚合酶在恒溫條件保溫條件下完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，通過觀察副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀的濁度或者顯色反應(yīng)即可判定結(jié)果。無需昂貴的儀器設(shè)備，具有耗時(shí)、操作簡單的優(yōu)勢，更適合基層的推廣應(yīng)用。本研究采用LAMP實(shí)時(shí)濁度法對(duì)食品中過敏原大豆成分進(jìn)行檢測，為食品的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、加工、管理及過敏原成分的標(biāo)識(shí)提供可靠的技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆、四季豆、羽扇豆、鷹嘴豆、荷蘭豆、豌豆、扁豆、豇豆、蠶豆、紅豆、綠豆、燕麥、蕎麥、黑麥、小麥、大麥、花生、芝麻、雞肉、魚肉、牛肉、鵝肉、鴨肉、羊肉、豬肉、蝦肉、蟹肉、扇貝、胡蘿卜、芹菜、核桃 購于珠海超市或?qū)嶒?yàn)室自留樣；食品樣品 購于珠海超 市 ；DNA 提 取 試 劑 盒 Biosprint 15 DNA plant kit QIAGEN公司；Bst DNA polymerase large fragment New England Biolabs公 司 ；甜 菜 堿（Betaine） 10 × Thermol Buffer，Sigma公司；dNTPs 寶生物工程（大連）有限公司；LAMP引物 寶生物工程（大連）有限公司。

LA-320C型LAMP實(shí)時(shí)濁度儀 日本榮研化學(xué)株式會(huì)社；NanoDrop型紫外分光光度計(jì) 美國Thermo公司；PCR儀7500Fast型實(shí)時(shí)熒光定量 美國ABI公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 LAMP引物設(shè)計(jì) 60～65℃是雙鏈DNA復(fù)性及延伸的中間溫度，DNA在65℃左右處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，任何一條引物與雙鏈DNA的互補(bǔ)部位進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)延伸的時(shí)候，另一條鏈就會(huì)脫落變成單鏈。LAMP方法正是利用這一特點(diǎn)進(jìn)行反應(yīng)的。利用4條特異性引物依靠一種高活性鏈置換DNA聚合酶，使得鏈置換DNA的合成在不停的自我循環(huán)[19]。LAMP反應(yīng)階段，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，dNTP會(huì)釋放出焦磷酸根離子，焦磷酸根離子遇到Mg2+會(huì)生成焦磷酸鎂白色沉淀，而實(shí)時(shí)濁度儀每6s自動(dòng)對(duì)每個(gè)反應(yīng)管的濁度進(jìn)行測定，可實(shí)時(shí)監(jiān)控?cái)U(kuò)增反應(yīng)中沉淀物的增加。根據(jù)LAMP引物設(shè)計(jì)的原則，在NCBI網(wǎng)站中查找Lectin基因相關(guān)序列，利用DNAMAN軟件對(duì)查到的各序列進(jìn)行比對(duì)，使用在線設(shè)計(jì)軟件Primer Explorer version4和LAMP Designer軟件設(shè)計(jì)特異引物，設(shè)計(jì)多套LAMP引物。利用實(shí)時(shí)濁度儀對(duì)反應(yīng)體系中擴(kuò)增產(chǎn)物的實(shí)時(shí)監(jiān)控篩選出最佳引物。共6條分別為內(nèi)引物FIP包含F(xiàn)1c（與Fl區(qū)域互補(bǔ)）和F2序列，內(nèi)引物BIP包含B1c（與B1區(qū)域互補(bǔ)）和B2序列，外引物為F3和B3序列，本研究在內(nèi)外引物的基礎(chǔ)上引入環(huán)引物FLP和BLP。引入環(huán)引物后，當(dāng)?shù)谝浑A段的啞鈴狀莖環(huán)結(jié)構(gòu)形成，環(huán)引物能與其結(jié)合并引導(dǎo)擴(kuò)增。即引入環(huán)引物后，自主擴(kuò)增增加了兩個(gè)位點(diǎn)，加快擴(kuò)增進(jìn)程，大大縮短了反應(yīng)時(shí)間。引物序列見表1。

1.2.2 樣品DNA提取 將待測樣品用潔凈研缽或粉碎裝置充分研磨混勻，食品樣品的取樣部位盡可能覆蓋其各種原料成分。稱取1g樣品進(jìn)行DNA提取，DNA提取步驟按試劑盒的說明書進(jìn)行，所提取的DNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測濃度并稀釋至100ng/μL，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 LAMP擴(kuò)增反應(yīng) 反應(yīng)總體積為25μL，包括10× Thermol Buffer 2.5μL、內(nèi)引物FIP和BIP（40μmol/L）各1.0μL、外引物F3和B3（10mol/L）各0.5μL、FLP和BLP（20μmol/L）各 1.0μL、dNTPs（10mmol/L）4.0μL、甜 菜堿（5mol/L）5.0μL、硫 酸 鎂（150mmol/L）1.0μL、Bst DNA聚合酶（8U/μL）1.0μL、模板DNA（約100ng/μL ）2.0μL，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25.0μL，充分混勻。實(shí)時(shí)濁度儀63℃恒溫反應(yīng)1h，最后80℃滅活5min結(jié)束反應(yīng)。

1.2.4 特異性實(shí)驗(yàn) 利用建立的LAMP實(shí)時(shí)濁度法，分別以大豆、四季豆、羽扇豆、鷹嘴豆、荷蘭豆、豌豆、扁豆、豇豆、蠶豆、紅豆、綠豆、燕麥、蕎麥、黑麥、小麥、大麥、花生、芝麻、雞肉、魚肉、牛肉、鵝肉、鴨肉、羊肉、豬肉、蝦肉、蟹肉、扇貝、胡蘿卜、芹菜、核桃的DNA作為LAMP反應(yīng)模板，以ddH2O為空白對(duì)照，進(jìn)行LAMP反應(yīng)，以評(píng)價(jià)該方法的特異性。

1.2.5 靈敏度實(shí)驗(yàn) 用研磨機(jī)將大豆和小麥磨成粉末狀，并60℃烘干6h。用小麥粉配成大豆粉含量為10%、5%、1%、0.5% 、0.1% 、0.05% 和0.01%（W/W）的混合樣品，以小麥粉為陰性對(duì)照，用于過敏原大豆成分的重量比靈敏度測試。

1.2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 利用建立的LAMP實(shí)時(shí)濁度法，對(duì)大豆含量為10%、1%、0.1%、0%（w/w）4個(gè)不同濃度的樣品分別進(jìn)行20次重復(fù)擴(kuò)增，以評(píng)價(jià)該方法的穩(wěn)定性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用實(shí)時(shí)濁度儀的LA-320CE軟件分析擴(kuò)增反應(yīng)，橫坐標(biāo)為擴(kuò)增時(shí)間，縱坐標(biāo)為濁度值，產(chǎn)生濁度曲線表明發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)，并篩選濁度出峰時(shí)間早，峰值較高的引物為反應(yīng)引物。

表1 LAMP引物序列Table 1 LAMP primers sequence

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP引物篩選結(jié)果

用大豆DNA作為陽性模板進(jìn)行引物的初步篩選，在所設(shè)計(jì)的多套引物中，選擇發(fā)生了擴(kuò)增反應(yīng)，且出峰時(shí)間較早，峰高值較高的一套引物。該套引物出峰時(shí)間為45min左右，峰高為0.16（見圖1）。對(duì)該套引物引入環(huán)引物進(jìn)行優(yōu)化，引入環(huán)引物后，出峰時(shí)間提前至22min左右（見圖2）。

圖2 引入環(huán)引物的LAMP引物實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Result of LAMP primers with ring

2.2 特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

利用建立的LAMP實(shí)時(shí)濁度法，對(duì)31種成分進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，除大豆出現(xiàn)了陽性擴(kuò)增外，其余30種成分均未發(fā)生擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)表明該LAMP引物具有特異性（見圖3）。

2.3 靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

利用建立的LAMP實(shí)時(shí)濁度法，對(duì)大豆含量為10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%（w/w）的樣品進(jìn)行檢測，含量為10%、5%、1%、0.5%、0.1%的樣品均發(fā)生了擴(kuò)增反應(yīng)，含量為0.05%、0.01%及陰性對(duì)照小麥粉樣品未發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)（見圖4），實(shí)驗(yàn)表明，該方法檢測大豆過敏原成分的靈敏度為0.1%（w/w）。

2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

利用建立的LAMP實(shí)時(shí)濁度法，對(duì)大豆含量為10%、1%、0.1%、0%（w/w）的4個(gè)樣品分別進(jìn)行20次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，假陽性率和假陰性率為0%，表明本實(shí)驗(yàn)建立的LAMP實(shí)時(shí)濁度法對(duì)過敏原大豆成分的檢測具有良好的穩(wěn)定性。

圖3 LAMP實(shí)時(shí)濁度法特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Results of specificity test by real-time turbidimeterbased LAMP

2.5 實(shí)際樣品檢測

從超市收集大豆加工產(chǎn)品38份以及不含大豆成分的樣品22份。用本實(shí)驗(yàn)建立的LAMP實(shí)時(shí)濁度法對(duì)這60個(gè)樣品進(jìn)行檢測，并與熒光PCR法的結(jié)果進(jìn)行比較，評(píng)價(jià)該方法的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。實(shí)時(shí)熒光PCR法根據(jù)SN/T 1961.19-2013進(jìn)行。

圖4 LAMP實(shí)時(shí)濁度法靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Results of sensitivity test by real-time turbidimeterbased LAMP

表2 實(shí)際樣品檢測Table 2 Test results of commercial samples

表3 實(shí)際樣品檢測Table 3 Test results of commercial samples

在實(shí)際樣品檢測中，熒光PCR法的Ct值及LAMP實(shí)時(shí)濁度法的峰值拐點(diǎn)時(shí)間與樣品中過敏原大豆成分的含量成正比關(guān)系。上述樣品的檢測中，熒光PCR法的Ct值出現(xiàn)在50~70min，而LAMP實(shí)時(shí)濁度法的峰值拐點(diǎn)則出現(xiàn)在18~30min，LAMP實(shí)時(shí)濁度法的檢測時(shí)間明顯比熒光PCR法的檢測時(shí)間短。并且在實(shí)際應(yīng)用中，LAMP法僅需在簡單的恒溫設(shè)備中進(jìn)行，以肉眼觀察反應(yīng)管中產(chǎn)生的白色沉淀判斷結(jié)果，操作簡便，成本低，更適合基層實(shí)驗(yàn)室甚至現(xiàn)場實(shí)驗(yàn)。

3 結(jié)論

本研究建立了食品中過敏原大豆成分的LAMP實(shí)時(shí)濁度檢測方法，引入環(huán)引物的LAMP引物使擴(kuò)增反應(yīng)從1h內(nèi)進(jìn)一步縮短至30min內(nèi)。該方法的靈敏度為0.1%（w/w）。對(duì)4個(gè)不同質(zhì)量濃度的大豆樣品分別進(jìn)行20次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，假陽性率及假陰性率為0%。對(duì)31種成分的測試中僅有大豆成分出現(xiàn)陽性擴(kuò)增，其他成分均無出現(xiàn)擴(kuò)增。對(duì)60個(gè)實(shí)際樣品的檢測結(jié)果與熒光PCR法的結(jié)果一致，并與預(yù)期相符，表明該方法具有良好的穩(wěn)定性和特異性，適用于食品中過敏原大豆成分的快速檢測。

[1]孟偉帥，關(guān)榮發(fā)，任駿恩，等.食品過敏原檢測技術(shù)的研究[J]. 廣東化工，2010，37（4）：167-168.

[2]王文枝，溫?zé)ū?，靳淑敏，?世界各國食品過敏原種類及標(biāo)識(shí)情況概述[J]. 食品工業(yè)科技，2011，32（4）：419-422.

[3]王蒙，張汆，賈小麗，等.食物中常見過敏原及其過敏特性[J]. 中國食物與營養(yǎng)，2008（11）：62-64.

[4]方旭前，朱友林，邱麗娟.大豆過敏原與低過敏原種質(zhì)創(chuàng)新[J]. 遺傳，2006，28（8）：1043-1050.

[5]Foucard T，Malmheden-Yman I.A study severe food reactions in Sweden is soy protein an underestimated cause of food anaphylaxis[J].Allergy，1999，53（3）：251-265.

[6]POMS R E，KLEIN C L，ANKLAM E.Methods for allergen analysis in food：a review[J].Food Additions and Contaminants，2004，21（1）：1-31.

[7]馮彥娟，袁娟麗，佟平，等.大豆過敏原檢測方法研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué)，2012，33（23）：365-369.

[8]鄭義成，華萍，楊安樹，等.食物中過敏原檢測技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué)，2010，31（21）：417-421.

[9]LOPEZ-TAPIA J，GARCIA-RISCO M R，MSNSO M A，et al. Detection of the presence of soya protein in milk powder by sodium dodecyl sulfate capillary electrophoresis[J].J Chromatogr A，1999，836（1）：153-60.

[10]MA Xi， SUN Peng ， HE Pengli， et al.Development of monoclonal antibodies and a competitive ELISA detection method for glycinin，an allergen in soybean[J].Food Chemistry，2010，121：546-551.

[11]PASCHKE A，ZUNKER K，WIGOTZKI M，et al.Determination of the IgE-binding activity of soy lecithin and refined and nonrefined soybean oils[J].Journal of Chromatography B，2001，756：249-254.

[12]IWABUCHI S，YAMAUCHI F.Determination of glycinin and β-conglycinin in soybean proteins by immunological methods [J].JAgric Food Chem，1987，35（2）：200-205.

[13]SOARES S，MAFRA I，AMARAL J S，et al.A PCR assay to detect trace amounts of soybean in meat sausages[J].International Journal of Food Science and Technology，2010，45（12）：2581-2588.

[14]TIAN Fang，WANG Xiumin，TENG Da，et al.Optimization of a multiplex PCR assay for detecting transgenic soybean components in feed products[J].Appl Biochem Biotechnol，2011，165：1225-1234.

[15]BAUER T，KIRSCHBAUM K，PANTER S，et al.Sensitivedetection of soy（Glycine max） by real-time polymerase chain reaction targeting the mitochondrial atpA gene[J].J AOAC Int，2011，94（6）：1863-1873.

[16]WANG Wei，HAN Jianxun，WU Yajun，et al.Simultaneous detection of eight food allergens using optical thin-film biosensor chips[J].J Agric Food Chem，2011，59：6889-6894.

[17]KIM T E ，PARK S W ，CHO N Y ，et al.Quantitative measurement ofserum allergen-specific IgE on protein chip[J]. Exp Mol Med，2002，34（2）：152-158.

[18]Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J].Nucleic Acids Research ，2000，28（12）：e63.

[19]黃思佳，解庭波，嚴(yán)家新.環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的原理及應(yīng)用[J]. 中國生物制學(xué)雜志，2011，24（12）：1511-1513.

Development of a real-time turbidimeter-based LAMP method for detection of allergen soybean in food

KUANG Xiao-shan，CHENG Xiao-wei，YOU Shu-zhu，WANG Xiao-yu，LIU Li-deng，F(xiàn)ENG Jia-wang*
（The Inspection Technical Center of Zhuhai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Zhuhai 519015，China）

According to the endogenous gene of allergen soybean Lectin ， six specific LAMP primers were designed.A loop-mediated isothermal amplification（LAMP） method for detecting allergen soybean in food was established.Real-time monitoring of the LAMP reaction was achieved by a turbidimeter.Specificity ，sensitivity，stability and repeatability of this method were tested.The results showed that the method could specifically detect the soybean in food，and the detection sensitivity of the method was 0.1% （w/w）.With the soybean sample of 10%，1%，0.1%，0%（w/w） concentration as templates，stability and repeatability testing was conducted，false negative rate was 0%.The results showed that the LAMP method is suitable for specifically detecting allergen soybean in food.

loop-mediated isothermal amplification（LAMP）；real-time turbidimeter；allergen；soybean；detection

Q78

A

1002-0306（2014）22-0065-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.005

2014－02－10

鄺筱珊（1982-），女，碩士研究生，工程師，研究方向：食品安全檢測。

* 通訊作者：馮家望（1965-），男，碩士研究生，研究員，研究方向：食品安全檢測。

國家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2011IK255）。