凌 云, 萬(wàn)夕和, 王李寶, 黎 慧, 沈 輝, 陳玉生

(江蘇省海洋水產(chǎn)研究所, 江蘇 南通 226007)

南黃海沿岸灘涂文蛤中痕量硒的周年變化探討

凌 云, 萬(wàn)夕和, 王李寶, 黎 慧, 沈 輝, 陳玉生

(江蘇省海洋水產(chǎn)研究所, 江蘇 南通 226007)

采用 4∶1混合酸濕法消解, 氫化物發(fā)生原子熒光光譜法(HG-AFS)測(cè)定了南黃海沿岸灘涂文蛤生物體中微量元素硒的周年變化, 并用質(zhì)控樣和加標(biāo)回收保證結(jié)果的可靠性。結(jié)果顯示:硒的周年含量為0.2～0.5 mg/kg, 平均值為0.330 mg/kg, 文蛤體內(nèi)硒的含量呈一定規(guī)律性變化, 春、秋季高, 夏、冬季低。說(shuō)明文蛤中硒含量因不同季節(jié)而具有明顯差異, 其含量變化與海水溫度、餌料生物及文蛤生長(zhǎng)繁殖等因素有關(guān)。

原子熒光光譜法; 南黃海; 文蛤(Meretrix meretrixLinnaeus); 硒; 周年變化

文蛤(Meretrix meretrixLinnaeus)是常見(jiàn)的可食用雙殼貝類, 屬軟體動(dòng)物門(mén)(Mollusca)、雙殼綱(Bivalvia)、真瓣鰓目(Eulamellibranchia)、簾蛤科(Veneridae)、文蛤?qū)?Meretrix)[1]。文蛤?qū)儆趶V溫性貝類, 在我國(guó)沿海各省均有分布, 是我國(guó)海水養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟(jì)貝類之一。南黃海沿岸灘涂是文蛤的重要棲息地, 其產(chǎn)量占全國(guó) 50%以上。文蛤是蛤中上品, 被譽(yù)為“天下第一鮮”, 不但味道鮮美, 而且具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[2]。

硒(Se)是人體和動(dòng)物體必需的重要微量元素,是谷胱甘肽過(guò)氧化酶的重要組成成分, 它參與多種代謝, 具有抗氧化、增強(qiáng)免疫力、調(diào)節(jié)機(jī)體代謝以及降低有毒元素毒性等功能[3-5]。硒在一般生物樣品中含量較低, 并因種類不同而差異較大。動(dòng)物制品的硒含量比植物體高, 海洋生物中硒類的含量也比陸地生物多[6]。海洋生物是硒良好的食物來(lái)源, 硒的攝入不足會(huì)給人和動(dòng)物造成多種傷害, 影響生物體的正常功能, 損害機(jī)體免疫力, 造成多種疾病, 而過(guò)量的硒又會(huì)在體內(nèi)造成毒性傷害[7]。

目前, 測(cè)定Se含量的方法主要有2,3-二氨基萘熒光法、石墨爐原子吸收法、催化極譜法、高效液相色譜法和氫化物-原子熒光光譜法(HG-AFS)等[8-9]。HG-AFS法具有檢出限低, 操作簡(jiǎn)便, 基體干擾少,靈敏度高, 分析結(jié)果穩(wěn)定可靠, 且避免使用有機(jī)和有毒試劑等優(yōu)點(diǎn)[8], 故選用此法進(jìn)行測(cè)定。

已有學(xué)者開(kāi)展過(guò)硒在貝類體內(nèi)的分布特點(diǎn)[10]及存在形式[11]研究、各種海洋貝類中硒的含量測(cè)定分析[12-14]、采用新方法測(cè)定硒的含量[15]等方面研究, 但連續(xù)研究貝類中硒的含量變化未見(jiàn)報(bào)道, 本研究從南黃海沿岸灘涂養(yǎng)殖貝類文蛤入手, 研究了文蛤生物體內(nèi)硒含量的周年變化, 分析不同生物季節(jié)文蛤體內(nèi)硒含量差異, 并探討了相關(guān)影響原因, 為合理食用貝類、了解其生理周期代謝提供基礎(chǔ)研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及處理

樣品文蛤取自南黃海灘涂典型輻射沙脊群-腰沙,于每月農(nóng)歷十五大潮退潮后取樣, 取樣量至少1.5 kg,連續(xù)取樣1年(從2011年6月～2012年5月, 2012年1月未取樣), 樣品經(jīng)現(xiàn)場(chǎng)海水沖洗干凈, 采樣后放于海水中暫養(yǎng)排掉泥沙, –20 ℃冷凍保存?zhèn)溆?。采樣同時(shí)測(cè)定海水溫度, 取兩次平均值記錄。

樣品制備: 冷凍文蛤樣品經(jīng)室溫解凍, 剖開(kāi)殼體, 取所有柔軟組織用自來(lái)水和純水沖洗干凈, 瀝水, 用勻漿機(jī)攪碎后, 混勻備用。

扇貝質(zhì)控樣(GBW10024)購(gòu)自中國(guó)計(jì)量科學(xué)院化學(xué)所。

1.2 儀器與試劑

AFS-9800型原子熒光光譜儀(北京海光儀器有限公司), 附帶硒空心陰極燈和純度為99.99%的氬氣作載氣; EH35APlus型數(shù)顯電熱板(北京萊伯泰科公司);

實(shí)驗(yàn)用水為超純水, 硝酸、高氯酸、鹽酸、氫氧化鉀、硼氫化鉀均為GR; 硒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(1000 mg/L): GBS04-1751-2004, 購(gòu)自國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心, 硒標(biāo)準(zhǔn)中間液質(zhì)量濃度為10 μg/mL, 硒標(biāo)準(zhǔn)工作液質(zhì)量濃度為100 μg/L; 100 g/L鐵氰化鉀溶液。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

分別吸取硒標(biāo)準(zhǔn)工作液 0.0, 0.1, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0 mL于20 mL比色管中, 定容至10 mL。再分別加入2.0 mL濃鹽酸, 1.0 mL鐵氰化鉀溶液, 混勻, 放置20 min。還原劑為1.5%硼氫化鉀, 載液為5%鹽酸。

本實(shí)驗(yàn)需要使用Ig M抗D血型定型試劑、單克隆抗體抗A抗血型定型試劑、不規(guī)則抗體篩選試劑、抗人球蛋白(抗IgG)檢測(cè)卡等,由上海血液生物醫(yī)藥公司、江蘇力博醫(yī)藥生物技術(shù)股份有限公司等提供。需要注意的是,在使用各種試劑時(shí)需要注意試劑的使用期限,還應(yīng)避免不同批次混用,防止對(duì)實(shí)驗(yàn)最終結(jié)果產(chǎn)生不良影響。

1.4 樣品前處理

采用濕法消解方法, 稱取處理好的文蛤樣品約2 g (精確至0.0001 g), 放入150 mL三角燒瓶中, 加10 mL HNO3+HClO4(4+1)混合酸, 搖勻, 冷消解過(guò)夜。次日于電熱板上低溫加熱消化, 當(dāng)溶液變?yōu)榍辶翢o(wú)色并伴有白煙時(shí), 繼續(xù)加熱至剩余體積2 mL左右, 冷卻至室溫。再加5 mL(1+1)鹽酸溶液, 繼續(xù)加熱至溶液變?yōu)榍辶翢o(wú)色并伴有白煙冒出。冷卻至室溫, 轉(zhuǎn)移至50 mL比色管中, 用純水定容, 搖勻后靜置。取10 mL文蛤消解液置于比色管中, 加入2 mL濃鹽酸、1 mL鐵氰化鉀溶液, 混勻待測(cè)。同時(shí)做空白試驗(yàn)。

1.5 儀器測(cè)定及計(jì)算

儀器條件設(shè)置: 負(fù)高壓: 300 V; 燈電流: 80 mA;原子化高度: 8 mm; 屏蔽氣流量: 900 mL/min; 載氣流量: 400 mL/min; 測(cè)量方式: 標(biāo)準(zhǔn)曲線法; 讀數(shù)方式: 峰面積; 延遲時(shí)間: 2 s; 讀數(shù)時(shí)間: 12 s。待儀器穩(wěn)定20 min后開(kāi)始測(cè)量。

試樣測(cè)定結(jié)果按以下公式計(jì)算:

式中,X為試樣中硒的含量, mg/kg;C為試樣消解液測(cè)定濃度, mg/L;C0為試樣空白消解液測(cè)定質(zhì)量濃度, mg/L;m為試樣質(zhì)量, g;V為試樣消解液總體積, mL。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS statistics19軟件進(jìn)行單因素方差分析和LSD多重比較, 以P<0.05作為顯著性水平。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和精密度

按儀器條件, 以5%HCl為載體, 1.5% KBH4為還原劑, 測(cè)得的Se元素的線性回歸方程為y=35.006x+ 8.3404, 相關(guān)系數(shù)R2為0.9990, 擬合度良好, 結(jié)果可靠, 見(jiàn)表1。

表1 硒標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定Tab.1 Standard curves of selenium

交替測(cè)定預(yù)處理空白和標(biāo)準(zhǔn)溶液, 取11次連續(xù)測(cè)量空白溶液的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差, 乘以標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率, 得出檢出限為0.255 μg/L。以質(zhì)量濃度為20 μg/L的硒標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行精密度的測(cè)定, 實(shí)驗(yàn)測(cè)得精密度為5%, 滿足精密度要求。

2.2 質(zhì)控樣含量及回收率測(cè)定

表2 質(zhì)控樣加標(biāo)回收率測(cè)定Tab.2 Measurement on recovery of the labeled quality control samples

質(zhì)控樣扇貝(GBW10024)稱樣量為0.5 g(精確至0.0001 g), 在上述實(shí)驗(yàn)條件下, 對(duì)扇貝中的硒進(jìn)行測(cè)定。連續(xù)3次測(cè)定扇貝中硒含量分別為1.208、1.310、1.241 mg/kg, 平均值為 1.253 mg/kg, 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為4.15%, 扇貝標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)上給出的硒含量值為 1.5 mg/kg±0.3 mg/kg, 測(cè)定結(jié)果在誤差允許范圍內(nèi)。則扇貝稱樣量為0.5 g時(shí), 含硒量為625.5 μg。

稱取0.5 g扇貝質(zhì)控樣9份, 分別加入3種不同濃度的 Se標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn), 平行 3次,按上述方法測(cè)其含量, 取其平均值, 由表 2結(jié)果可見(jiàn), 加標(biāo)回收率為97.3% ～114.4%?？梢?jiàn)采用該方法測(cè)硒具有很好的可行性和準(zhǔn)確性。

2.3 測(cè)定結(jié)果與分析

2.3.1 檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)

將一年內(nèi)不同月份的文蛤進(jìn)行總硒含量測(cè)定,測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。每份樣品進(jìn)行3次平行樣測(cè)定, 計(jì)算平均值及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差, 結(jié)果顯示RSD值≤10%,能滿足食品中硒的測(cè)定要求。一年內(nèi)文蛤硒含量的平均值為 0.330mg/kg,最高值出現(xiàn)在 5月份, 為0.447 mg/kg, 最低值出現(xiàn)在8月份, 為0.247 mg/kg。測(cè)定結(jié)果可以看出文蛤新鮮樣品中硒含量呈一定規(guī)律性變化, 5月份和11月份相對(duì)較高, 3月份和8月份相對(duì)較低, 呈現(xiàn)由高到低再到高的周期性變化趨勢(shì)。

表3 一周年內(nèi)文蛤生物體中硒含量測(cè)定結(jié)果Tab.3 Annual measurement on the selenium content in Meretrix meretrix (mg/kg)

2.3.2 不同季節(jié)硒含量的變化差異分析

一周年不同月份采集文蛤時(shí)記錄的海水溫度制成的海水表層溫度變化趨勢(shì)見(jiàn)圖1, 2011年8月海水溫度為最高, 2012年2月海水溫度為最低。將不同月份采集文蛤時(shí)海水溫度變化與文蛤中硒含量變化進(jìn)行相關(guān)性分析, 通過(guò)圖 1可以看出, 2011年 6月至2011年10月文蛤體中硒含量與海水溫度變化呈相反趨勢(shì), 在2011年11月至2012年5月, 海水溫度與文蛤體中硒含量呈相同趨勢(shì)。

圖1 不同月份海水溫度與文蛤硒含量的變化趨勢(shì)Fig. 1 Variation tendency of sea water temperature and the selenium content in Meretrix meretrix

將取樣文蛤按照生物季節(jié)劃分, 10～20 ℃左右的4月、5月、6月為春季, 20～30 ℃的7月到9月為夏季, 15～20 ℃的10到12月為秋季, 10 ℃以下的1月到 3月為冬季, 將文蛤生物體中硒的含量根據(jù)不同季節(jié)用SPSS軟件進(jìn)行單因素ANOVA分析和LSD多重比較(表 4), 結(jié)果表明文蛤生物體內(nèi)硒含量在季節(jié)間差異極顯著(P<0.01)。

將不同季節(jié)文蛤中硒的含量進(jìn)行LSD多重比較,可以得出春季文蛤中硒含量與夏季、冬季文蛤中硒含量差異極顯著(P<0.01), 與秋季文蛤中硒含量差異顯著(P<0.05); 夏季文蛤中硒含量和秋季、冬季比較相近, 差異不顯著(P>0.05), 秋季文蛤中硒含量和冬季差異不顯著(P>0.05)。

2.3.3 文蛤體中硒含量周年變化原因討論

文蛤常棲息在河口附近沿岸的潮間帶以及淺海區(qū)的細(xì)沙或泥沙灘中, 營(yíng)埋棲生活, 通過(guò)濾水作用攝取海洋中的浮游植物和有機(jī)碎屑為食。張安國(guó)等[1]研究了不同地理種群文蛤體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)成分差異, 認(rèn)為文蛤缺乏嚴(yán)格的選擇餌料能力, 其攝食的最主要種類是硅藻, 這有很大的地區(qū)性和季節(jié)性的變化, 不同地區(qū)和不同季節(jié), 水中餌料生物和底棲藻類繁殖情況不一。季節(jié)變化對(duì)文蛤攝食生理參數(shù)的影響主要表現(xiàn)為水溫和餌料濃度的影響。

硒在海洋環(huán)境中含量極少, 屬微量元素, Donald B等[16]、George L. Bowie等[17]研究認(rèn)為, 硒是海洋微藻的一種基本生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑, 是生物必需的微量元素, 極易被浮游植物所吸收, 并且可隨食物鏈傳遞,在生物體內(nèi)累積。楊逸萍等[18]通過(guò)研究海水和藻液中硒的含量, 得出海洋浮游植物對(duì)硒的富集系數(shù)高達(dá)104以上。毛文君等[10-11]研究了貝類中硒的分布特點(diǎn), 認(rèn)為貝類生物體的外套膜中硒含量最高。外套膜是貝類與外界溝通的唯一管道。由此推測(cè)文蛤體內(nèi)的硒是因攝食餌料微藻而獲取, 硒含量高低受攝取微藻含量多寡影響。

表4 不同季節(jié)文蛤生物體中硒含量的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差及單因子方差分析(ANOVA)結(jié)果Tab.4 The mean, standard deviations and results of one-way ANOVA for the selenium content in Meretrix meretrix in different seasons

文蛤是變溫動(dòng)物, 環(huán)境溫度對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育影響也很大。徐東等[19]、林小濤等[20]研究了海水溫度對(duì)貝類攝食生理的影響, 結(jié)果表明, 在一定適溫范圍內(nèi), 貝類的攝食率隨溫度升高而增大, 到達(dá)某一溫度達(dá)到最大, 其后溫度升高攝食率反而下降。探究其機(jī)理, Joergensen等[21]認(rèn)為溫度和貝類鰓絲纖毛的擺動(dòng)呈正相關(guān)性。當(dāng)溫度過(guò)低時(shí), 纖毛擺動(dòng)的強(qiáng)度與頻率下降, 使其攝食能下降; 隨著溫度升高使纖毛的擺動(dòng)頻率加快, 且高溫可以減少海水的黏滯性, 從而使其濾水能力增加, 使攝食能增加。徐東等[19]認(rèn)為適宜的溫度范圍內(nèi), 溫度升高使貝類的生命活動(dòng)加強(qiáng), 新陳代謝加快, 濾水率加快, 攝食率隨之增大;當(dāng)水溫超過(guò)一定的范圍, 環(huán)境條件變得不再適宜時(shí),貝類的生命活動(dòng)受到限制, 攝食率則下降。作者認(rèn)為兩者說(shuō)法都有一定道理, 貝類攝食受溫度影響存在被動(dòng)吸收和主動(dòng)運(yùn)輸兩方面的因素, 溫度影響著貝類本身的生理代謝狀態(tài)。

通過(guò)對(duì)文蛤體內(nèi)硒的周年測(cè)定可見(jiàn), 文蛤體內(nèi)硒含量呈一定規(guī)律性變化, 在春秋兩季比較高, 而在冬夏兩季相對(duì)較低。在前人的研究基礎(chǔ)上, 作者認(rèn)為硒含量的變化是因?yàn)槲缓Ｑ蟾∮卧孱愇? 通過(guò)食物鏈傳遞被貝類攝取, 參與了文蛤體內(nèi)生理代謝。不同季節(jié), 浮游藻類繁殖能力和數(shù)量隨溫度的變化而改變,文蛤餌料中硒的含量也隨之改變。在春秋兩季海水溫度相對(duì)適宜, 藻類繁殖旺盛, 餌料豐富, 文蛤攝食時(shí)間較長(zhǎng), 文蛤適合生長(zhǎng), 其體內(nèi)硒含量比較高。

文蛤的繁殖期因海區(qū)水溫不同各地早晚不一樣,一般在水溫20～30 ℃繁殖, 江蘇文蛤在6月到7月繁殖。繁殖前, 軟體積累大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì), 為產(chǎn)卵作好準(zhǔn)備, 此時(shí)軟體最肥, 文蛤體內(nèi)富集的硒含量也比較高,因此5月份文蛤體中硒含量為最高。繁殖期間軟體消瘦, 生長(zhǎng)緩慢, 繁殖后肥滿度降低, 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)損失, 體質(zhì)虛弱, 貝類生長(zhǎng)速度較慢, 硒含量逐漸降低,同時(shí)8月海水溫度較高, 酶蛋白易變性, 文蛤生長(zhǎng)代謝受到一定程度抑制, 因此表現(xiàn)為6月到8月份硒含量逐漸降低, 8月份文蛤體中硒含量為最低; 隨著 9月到11月海水溫度的逐漸下降到適宜范圍內(nèi), 藻類生長(zhǎng)旺盛, 文蛤由繁殖期轉(zhuǎn)為生長(zhǎng)期, 文蛤的生理代謝增強(qiáng), 硒含量逐漸增加; 到12月份時(shí)海水溫度降至 15 ℃以下, 文蛤的生長(zhǎng)代謝下降, 文蛤體內(nèi)硒含量則由高降低, 在次年2月、3月海水溫度低于10 ℃以下, 餌料相對(duì)少, 文蛤體內(nèi)酶活性受抑制, 文蛤生長(zhǎng)緩慢, 文蛤體內(nèi)硒含量處于較低狀態(tài); 而到4月份時(shí)海水溫度上升至 10 ℃以上, 海洋藻類逐漸豐富, 貝類攝食量增大, 體內(nèi)酶活性高, 生長(zhǎng)旺盛, 到5月份文蛤體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富, 為繁殖做準(zhǔn)備, 文蛤體中硒含量比較高。綜上所述, 可以推測(cè)文蛤體內(nèi)硒含量呈周期性變化的原因在于受到海水溫度、餌料生物環(huán)境因子及文蛤本身生理狀態(tài)(繁殖期、生長(zhǎng)期)的影響所致。

3 結(jié) 論

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)表明不同月份不同季節(jié)文蛤貝類中的硒含量呈現(xiàn)一定規(guī)律變化, 表現(xiàn)為春、秋兩季硒含量高, 夏、冬兩季硒含量低, 不同季節(jié)文蛤體中硒含量差異顯著。這提醒我們?cè)诓杉瘶悠窓z測(cè)營(yíng)養(yǎng)成分時(shí),要選擇合適的采集時(shí)間, 肥滿度比較高的季節(jié)即在其繁殖節(jié)前采集才能檢測(cè)其最高的含量。不同采集時(shí)間,采集地域跨度大, 對(duì)測(cè)定結(jié)果會(huì)有直接影響。

本研究初步探討了文蛤體中硒含量周年變化的形成原因, 認(rèn)為與海水溫度高低、餌料生物多寡以及貝類體內(nèi)的生理狀態(tài)(繁殖期、生長(zhǎng)期)等因素有關(guān),但其深層次的機(jī)理還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

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(本文編輯: 梁德海)

Annual variation of trace selenium content inMeretrix meretrixin the South Yellow Sea tidal flats

LING Yun, WAN Xi-he, WANG Li-bao, LI Hui, SHEN Hui, CHEN Yu-sheng
(Institute of Oceanology & Marine Fisheries, Nantong 226007, China)

Dec, 27, 2012

HG-AFS, South Yellow Sea,Meretrix meretrix, selenium, annual variation

The anniversary changes of trace element selenium inMeretrix meretrixin the South Yellow Sea tidal flats were measured by hydride generation atomic fluorescence spectrometry (HG - AFS) following a 4∶1 mixed acid to wet digestion and the reliability of the method with quality control samples and the recovery of standard were studied and verified. The results showed the content of selenium was between 0.2～0.5×10-6mg/kg with an average value of 0.330×10-6mg/kg. The selenium inMeretrixshowed regularity changes in different seasons. The content of selenium is higher in spring and autumn, and lower in summer and winter. The selenium inMeretrixhad obvious different content in different seasons, which was connected with seawater temperature, food organism andMeretrixgrow and breed and so on.

O657.32

A

1000-3096(2014)01-0039-05

10.11759/hykx20121227003

2012-12-27,

2013-08-06

國(guó)家海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(2013418007-1); 國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAC07B03); 江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項(xiàng)目(CX(13)3094)

凌云(1982-), 女, 江蘇南通人, 助研, 碩士研究生, 主要從事海洋生態(tài)學(xué)研究, 電話: 0513-85228274, E-mail: lingyun 20110520@163.com;萬(wàn)夕和, 通信作者, 研究員, 博士, E-mail: wxh1708@ 163.com