于道德, 劉 名, 劉洪軍, 姜云榮, 官曙光

(1. 山東省海水養(yǎng)殖研究所, 山東 青島 266002; 2. 上海海洋大學(xué), 上海 201306; 3. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所, 山東 青島 266071)

黃海大頭鱈胚胎發(fā)育過程

于道德1, 劉 名1, 劉洪軍1, 姜云榮2,3, 官曙光1

(1. 山東省海水養(yǎng)殖研究所, 山東 青島 266002; 2. 上海海洋大學(xué), 上海 201306; 3. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所, 山東 青島 266071)

馴化野生大頭鱈(Gadus macrocephalusTilesius)作為親魚, 通過自然受精和人工授精兩種方法獲得受精卵, 自然受精卵通過虹吸法收集。受精卵孵化條件為水溫6～8℃, 鹽度32～33, pH7.8～8.2, 微充氣。在奧林巴斯SZ61解剖鏡下對大頭鱈的胚胎發(fā)育進(jìn)行了觀察, 并使用CCD圖像傳感器拍照, 描述了各發(fā)育時期的發(fā)育時序和形態(tài)特征。大頭鱈受精卵為圓球形端黃卵, 弱黏性, 無油球, 卵膜上具龜裂結(jié)構(gòu), 卵子直徑0.95～1.12mm,n=30, 卵黃均勻透明。類似于大部分硬骨魚類, 其胚胎發(fā)育可分為胚盤形成期、卵裂期、桑椹期、囊胚期、原腸期、神經(jīng)胚期、器官發(fā)生期、尾芽期、肌肉效應(yīng)期。在水溫6～8℃, 鹽度32～33的條件下, 受精卵歷時約336h完成胚胎發(fā)育過程, 孵化出膜。在大頭鱈胚胎發(fā)育過程中, 具有4個不同于其他硬骨魚類的地方:(1)發(fā)現(xiàn)早期分裂球具有不規(guī)則現(xiàn)象; (2)很多胚胎發(fā)育過程不出現(xiàn)柯氏囊, 有柯氏囊的胚胎僅占 10%左右, 且出現(xiàn)晚, 消失快; (3)胚胎孵化為仔魚與發(fā)育進(jìn)程關(guān)聯(lián)性不大, 孵化的仔魚有3種主要形態(tài); (4)胚胎各個時期都有較高死亡率, 以原腸期最為嚴(yán)重。

大頭鱈(Gadus macrocephalusTilesius);胚胎發(fā)育; 柯氏囊

大頭鱈(Gadus macrocephalusTilesius), 英文名太平洋鱈魚(Pacific cod), 屬鱸形目(Perciformes)、鱈科(Gadidae)、鱈屬(Acanthopagrus) , 與大西洋鱈魚(G. morhua)、格陵蘭鱈魚(G. ogac)共同組成鱈屬的3種魚類, 都分布于高緯度低溫區(qū)域。大頭鱈主要分布于北太平洋海域的大陸架, 除了白令海峽、日本海域外,還包括我國的黃海北部。其中大西洋鱈魚由于過度捕撈而導(dǎo)致資源崩潰, 目前已成為紅色瀕危物種;如不考慮合理開發(fā)和保護(hù), 大頭鱈可能面臨同樣風(fēng)險。尤其是黃海群體幾乎是隔離種群, 其遺傳多樣性水平較低[1]。近期調(diào)查結(jié)果顯示黃海大頭鱈年齡結(jié)構(gòu)仍然較為簡單, 且其分布范圍較窄, 資源易受外界環(huán)境變化的影響[2]。然而我國黃海大頭鱈資源量尚可,加上市場價格不高(大頭鱈在青島當(dāng)?shù)厮追Q大頭腥, 2013年春節(jié)期間的市場價格僅在6～10元/kg), 因而并未引起足夠重視?；谏鲜鲆蛩? 開展大頭鱈苗種人工繁育研究, 提前做好瀕?；蚺R近瀕危品種的人工繁育和養(yǎng)殖研究, 并為該魚的增殖放流做好前期工作是科研人員應(yīng)該首要考慮的問題。

日本學(xué)者很早開始關(guān)注大頭鱈, 研究了其繁殖行為學(xué)[3]、運(yùn)動生理[4]等。國內(nèi)對大頭鱈也進(jìn)行了基礎(chǔ)生物學(xué)的研究, 包括攝食食性[5], 種群遺傳學(xué)[1],而相關(guān)人工繁育尚無報道, 盡管卞曉東[6]對大頭鱈的早期發(fā)育進(jìn)行了相關(guān)報道, 但由于實(shí)驗(yàn)是在日本進(jìn)行的, 且為日本群體, 故該項(xiàng)研究被認(rèn)為是國內(nèi)空白。作者對黃海大頭鱈的人工繁育進(jìn)行了探索, 就其胚胎發(fā)育過程進(jìn)行了翔實(shí)的描述, 以期為后續(xù)規(guī)?；斯し庇拈_展提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 親魚收集和馴化

2013年1月22日, 采用流刺網(wǎng)在青島近海捕獲大頭鱈54尾(體長40～60cm), 運(yùn)至日照東港區(qū)海福育苗場。于6m×6m×1.2m水泥池中暫養(yǎng), 氣泵充氣, 25W瓦白熾燈控光, 氟苯尼考3×10?6藥浴, 每2天換水一次,換水量1/3。水溫2.4℃, 鹽度28。暫養(yǎng)期間不投餌。

1.2 自然產(chǎn)卵與人工授精

2013年2月11日、2月27日, 大頭鱈自然產(chǎn)卵,當(dāng)時水溫為3～4℃; 分別于2月28日、3月7日和3月10日對發(fā)育成熟親魚各進(jìn)行了1次人工授精。大頭鱈生性平和, 無需麻醉, 便可進(jìn)行人工授精, 成熟較好的親魚, 在操作過程中, 其精液和卵子會自然從生殖孔流出, 僅需輕壓腹腔即可獲得大量精卵,采用濕法授精。2～3kg的雄魚, 精液量為100～280mL, 2～3kg雌魚懷卵量為700～1200mL。

1.3 受精卵及孵化條件

由于大頭鱈的卵子具有弱黏性, 無油球, 屬于沉性卵, 自然產(chǎn)的受精卵停氣后通過虹吸法用網(wǎng)袋收集, 利用孵化網(wǎng)箱放入恒溫水池進(jìn)行流水孵化,受精卵孵化條件為水溫 6℃±0.5℃, 鹽度 32～33, pH 7.8～8.2, 網(wǎng)箱外充氣。人工授精的卵子放入自制孵化網(wǎng)箱內(nèi)充氣孵化, 孵化條件與自然產(chǎn)的受精卵相同。孵化網(wǎng)箱規(guī)格為2.4m×1m×0.8m。

1.4 觀察方法

參照文獻(xiàn)報道, 在孵化前期, 3 h觀察一次, 原腸期后, 每天觀察3次。使用奧林巴斯SZ61解剖鏡觀察胚胎發(fā)育, 記錄發(fā)育各時期的形態(tài)特征;使用CCD圖像傳感器和SONY H-50相機(jī)拍照; 使用DN-2顯微圖像處理軟件, 結(jié)合目微尺、臺微尺測定卵徑, 每次觀察胚胎 3組, 每組至少 30枚。發(fā)育時間的確定按照受精卵 50%以上達(dá)到該時期界定。

2 結(jié)果

大頭鱈卵屬端黃卵, 為無油球的沉性卵, 由于具有弱黏性, 人工授精后, 在孵化網(wǎng)箱中會自然黏合在一起形成卵團(tuán), 但流水輕沖洗, 即可散開。卵膜具龜裂結(jié)構(gòu), 卵黃均勻無色。卵徑為0.95～1.12mm。大頭鱈受精卵行盤狀卵裂。在水溫6℃±0.5℃, 鹽度33的條件下, 受精后2h可以看到帽狀胚盤, 隨后胚盤繼續(xù)高隆; 受精后7 h開始第一次卵裂, 卵裂期共歷時24h。受精后35h胚盤細(xì)胞開始下包并內(nèi)卷, 胚胎發(fā)育進(jìn)入原腸胚階段, 此階段是胚體發(fā)育中變化最劇烈的時期, 但是胚體雛形出現(xiàn)的時序較晚, 且不清晰。70h達(dá)到原口關(guān)閉前期, 胚胎下包90%以上,少數(shù)具卵黃栓, 但僅個別胚胎出現(xiàn)克氏囊KV(Kupffer’s vesicle, KV), 胚體僅具雛形, 頭部明顯, 個別胚體清晰可見。110h原口完全閉合, 胚體形成, 頭部明顯, 眼泡形成, KV囊出現(xiàn)比例不足 10%出。原口關(guān)閉后, 胚胎進(jìn)入器官形成期。受精后192 h,胚體尾芽形成并開始脫離卵黃囊, 受精后210 h胚胎開始出現(xiàn)微弱心跳; 隨著胚體進(jìn)一步發(fā)育, 心跳加快, 并伴隨著肌體的間歇顫動。在受精后278h, 胚體發(fā)育進(jìn)入到最后的孵化時期, 孵化方式為頭部首先破膜。278～336h為孵化期, 不同時間孵化的仔魚在形態(tài)上有區(qū)別。其具體發(fā)育時序及發(fā)育特征見表 1及圖1。

3 討論

3.1 低溫發(fā)育

作為低溫魚類, 大頭鱈的胚胎發(fā)育過程十分緩慢, 本研究結(jié)果就與國內(nèi)曾報道過的另一種低溫魚類條斑星鰈相似, 通過對比兩種魚類, 似乎可以從中看出一些低溫魚類胚胎發(fā)育的規(guī)律性(表2)。大頭鱈胚胎發(fā)育的主要特征包括細(xì)胞分裂速度慢, 尤其是原腸期持續(xù)近48h。也正是因?yàn)槠浒l(fā)育慢, 使得人們可以了解很多不同的過程。不同步卵裂現(xiàn)象提前,而且裂球均一程度差, 這一點(diǎn)與條斑星鰈類似[7]。而且這種不同步性在原口關(guān)閉期體現(xiàn)的更為明顯, 有的胚胎在該時期具有明顯的胚體形成, 頭部分化明顯, 而大部分在該時期很難分辨胚體所在位置, 需要不斷撥動受精卵翻轉(zhuǎn), 才可以粗略看到, 因此其細(xì)胞的下包和內(nèi)移的過程是分開的, 且速度不同,而對于暖水性魚類來說, 由于發(fā)育速度快無法表現(xiàn)而已。

3.2 黃海大頭鱈卵子的物理特性

黃海大頭鱈的卵子屬無油球、沉性卵, 與日本大頭鱈相同[3]。海洋魚類的卵子, 其油球的有無與卵子的浮性相關(guān), 因?yàn)橛颓虻谋举|(zhì)為脂肪, 比重輕于海水, 因此具有油球的卵子一般都是浮性卵[8-9]。較高鹽度(32～34)下, 無油球的條斑星鰈卵子也呈現(xiàn)漂浮狀態(tài)[7], 這與卵子最后成熟階段水化過程相關(guān)[10]。本實(shí)驗(yàn)3月7日進(jìn)行的人工授精試驗(yàn), 發(fā)現(xiàn)部分卵子具有浮性, 經(jīng)過一段時間檢測, 為正常發(fā)育的卵子, 但是比例很小, 不到1‰。原因可能是由于大頭鱈卵子具有弱黏性, 卵子相互黏成團(tuán), 間隙中存有氣泡導(dǎo)致比重降低的緣故。另外, 通過鹽度實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 無論多高的鹽度, 即便達(dá)到飽和程度(使用海水粗鹽調(diào)制), 大頭鱈的卵子都不具有上浮的特性, 可見大頭鱈卵子的密度很大, 主要是卵黃物質(zhì)致密, 通過圖 1 1-29, 1-30, 1-31可以看出卵黃的吸收造成卵黃囊形成缺刻, 而不同于其他硬骨魚類, 隨著發(fā)育的進(jìn)行卵黃囊縮小。作者可以推斷, 大頭鱈的受精卵在自然界應(yīng)該沉在海底進(jìn)行孵化, 其卵黃囊物質(zhì)是否含有特定的抗壓與耐寒成分還需要進(jìn)一步研究。

表1 大頭鱈的發(fā)育時序及發(fā)育特征Tab.1 Developmental duration and characteristics of Gadus macrocephalus Tilesius embryo

3.3 成熟卵子與黏性

文獻(xiàn)報道, 大頭鱈的卵子具有弱黏性, 而且與其卵子的成熟度密切相關(guān)。作者在進(jìn)行 3次人工授精的過程中發(fā)現(xiàn): 成熟度最好的一次(3月7日, 受精率高達(dá) 92%), 輕壓腹部, 卵子自動流出, 在燒杯中呈現(xiàn)流動狀態(tài), 與混合其中的卵巢液可輕易倒入塑料盆中, 僅在燒杯壁黏有個別卵子, 其卵子表現(xiàn)為弱黏性。而在2月28日進(jìn)行的人工授精過程, 卵子黏性很大, 燒杯壁黏滿卵子, 流水沖洗也不易剝落,其卵子相互擠壓, 為不規(guī)則的圓形, 受精率僅 30%,發(fā)育至原腸期, 幾乎全部停止發(fā)育死亡。其究竟為未成熟或者是過熟還不得而知。在3月10日, 進(jìn)行人工授精與3月7日為同一條雌性親魚, 發(fā)現(xiàn)卵子仍為弱黏性, 但是受精率已經(jīng)降低至 1%以下, 卵子表現(xiàn)局部發(fā)白, 應(yīng)該為過熟的卵子(圖2)。

圖1 大頭鱈的胚胎發(fā)育Fig.1 Embryonic Development of Gadus macrocephalus

表2 大頭鱈與條斑星鰈胚胎發(fā)育比較Tab.2 Comparison of embryonic development between Gadus macrocephalus Tilesius and Verasper moseri

通過受精率來判斷, 第 1次人工授精中受精率為30%, 應(yīng)該為發(fā)育中尚未達(dá)到成熟的卵子, 而第3次肯定是過熟的卵子(因?yàn)槿∽酝粭l親魚)。由此可見, 人工授精時機(jī)的把握非常重要, 成熟的卵子在 3天內(nèi)會失去受精能力, 這與文獻(xiàn)報道的不一致。

圖2 大頭鱈3次人工授精結(jié)果對比Fig.2 Comparison of three times artificial insemination of Gadus macrocephalus

3.4 柯氏囊

為紀(jì)念Kupffer在1868年發(fā)現(xiàn)真骨魚類胚胎發(fā)育過程中會出現(xiàn)一個暫時性的囊泡, 而將其命名為柯氏囊(Kupffer’s vesicle)[11]。近年來研究證實(shí)了柯氏囊一個內(nèi)含單纖毛細(xì)胞(monociliated cells)的器官,并且與胚胎發(fā)育的不對稱性密切相關(guān)[12-13]。

硬骨魚類 KV囊的位置在其尾部的腹側(cè), 離尾芽還有一段距離, 因此出現(xiàn)的時機(jī)一般在原口關(guān)閉前或原口剛剛關(guān)閉的時期, 隨著胚胎的發(fā)育, 在尾芽游離前即消失。如條石鯛(Oplegnathus fasciatusTemmine)的 KV囊出現(xiàn)在原口關(guān)閉期, 尾芽游離立刻消失[14]。黑棘鯛(Acanthopagrus schlegelii(Bleeker, 1854))的KV囊在原口關(guān)閉前期出現(xiàn), 同樣在大頭鱈的柯氏囊似乎可有可無, 因?yàn)樵诤芏嗯咛r期幾乎看不到它的存在, 發(fā)現(xiàn)最多10%的胚胎具有KV。而且, 即使出現(xiàn)KV的個體, 其出現(xiàn)的時序也要晚于其他硬骨魚類, 一般硬骨魚類的 KV出現(xiàn)在原口關(guān)閉前期。由此可見, 這個暫時性的囊泡并非所有硬骨魚類都出現(xiàn), 而且其作用是否如上所述, 起始了胚胎發(fā)育的不對稱性還有待進(jìn)一步考證。在大頭鱈胚胎發(fā)育過程中大量出現(xiàn)的其他囊泡(圖1中的1-20, 1-23, 1-24)的存在是否替代了 KV及其功能呢？也需要進(jìn)一步證實(shí)。

3.5 孵化時期

作為低溫孵化期長的魚類, 其孵化周期也長,這個很容易理解。但是對于其孵化出來的發(fā)育時期,卻很少有差別。在真鯛、牙鲆等魚類中, 孵化周期也超過 6h, 但是初孵仔魚的形態(tài), 尤其是體色模式規(guī)律性很強(qiáng), 發(fā)育時期也大體一致。而大頭鱈的孵化周期近60h, 初孵仔魚形態(tài)也差異很大, 如圖1中1-29,孵化前Ⅱ期的仔魚, 軀干部并沒有形成色素帶, 眼球晶體的色素沉積也不完善, 在燒杯中的游動能力很差, 幾乎不能正常游動, 這如果歸結(jié)于其他因素導(dǎo)致的不正常孵化, 也欠缺理論支持, 這樣的仔魚隨著發(fā)育, 同樣可以繼續(xù)存活。什么因素導(dǎo)致其提前孵化或孵化時機(jī)究竟是由什么控制, 還需要進(jìn)一步探索。

3.6 胚胎高死亡率

在大頭鱈胚胎發(fā)育過程中, 從卵裂開始, 就陸續(xù)出現(xiàn)大量死亡胚胎。本實(shí)驗(yàn)最后一次人工授精孵化水溫在6℃, 海水鹽度等理化因子沒有任何問題。從二細(xì)胞計算, 受精率高達(dá) 92%, 但是到了原口關(guān)閉期, 僅存活 54%左右, 并存在大量畸形發(fā)育的胚胎。臨近孵化前期, 僅存20%正常的胚胎, 最終的孵化率在15.8%。在胚胎發(fā)育過程中的高死亡率并無具體的敏感期, 其外界影響因素也不清楚。在收集到的自然受精的胚胎中, 孵化率更是低至 5%以下, 這種胚胎期的高死亡率是否與遺傳機(jī)制相關(guān), 而雌雄個體較高的絕對繁殖力似乎是彌補(bǔ)其胚胎高死亡率的進(jìn)化對策之一, 卞曉東[6]在日本的實(shí)驗(yàn)證實(shí)4～6℃是其孵化的最適溫度。這是否與需要低溫孵化, 而作者的孵化溫度過高導(dǎo)致的高死亡率還要進(jìn)一步證實(shí),尤其是在3月11日遭遇高溫天氣(車間無降溫設(shè)備),池水溫度達(dá)到8℃, 也可能是其高死亡率的外界誘因之一。

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(本文編輯: 梁德海)

The Embryonic Development ofGadus macrocephalusTilesius

YU Dao-de1, LIU Ming1, LIU Hong-jun1, JIANG Yun-rong2,3,GUAN Shu-guang1
(1.Mariculture Institute of Shandong Province, Qingdao 266002, China; 2. Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 3. Yellow sea fisheries research institute chinese recedemy of fishery sciences, Qingdao266071, China)

Jun., 28, 2013

Gadus macrocephalusTilesius; embryonic development; Kupffer’s vesicle

The fertilized eggs of wild broodstock,Gadus macrocephalusTilesius wereacquired through two methods, natural fertilization and artificial insemination. The naturallyfertilized eggs collected by flooding assay. The fertilized eggs were incubated in filtered sea water at 6～8℃, salinity 32～33, pH7.8～8.2, with subtle aerated. The ontogenetic embryos were observed using a Olympus SZ-61 microscope.The total development time of every stage was noted and calculated and the characteristic images were taken using a charge-coupled device(CCD). The fertilized eggs were globular, single oil globule and the egg diameter was 0.95～1.12mm(n=30). The embryonic developmentexperienced 336h including blastodisc stage, cleavage stage, blastula stage, gastrula stage, neurula stage, organogenesis stage, tail bud stage, heart beating stage and hatching stage.We found there were significant differences betweenGadus macrocephalusTilesiusand other teleost in some stages:1) unregular blastomeres in early cleavage; 2) devoid of Kupffer’s vesicle in most embryos during development, only 10% embryos could be observed and occurred later and disappeared earlier than other teleost; 3) the newly-hatched larvae were not related with certain developing stage, and there were three major ontogenetic patterns when the larvae hatched; 4) it has a high death rate during all the development stages, especially in gastrula stage.

S917.4; Q959.4

A

1000-3096(2014)03-0080-07

10.11759/hykx20110506001

2013-06-28;

2013-10-10

山東省科技發(fā)展計劃項(xiàng)目(2013GHY11509)

于道德(1978-), 男, 博士, 山東青島人, 主要從事魚類學(xué)研究, 電話: 0532-82655167, E-mail: 18660297029@163.com; 官曙光, 通信作者, 碩士, 主要從事魚類學(xué)研究, 電話: 13156263778