劉凱雙，沈 雁，涂家生

（中國藥科大學藥劑學教研室，江蘇南京210009）

·實驗研究·

γ－聚谷氨酸－檸檬酸－順鉑復合物中順鉑含量測定方法的建立

劉凱雙，沈 雁，涂家生

（中國藥科大學藥劑學教研室，江蘇南京210009）

目的建立γ－聚谷氨酸－檸檬酸－順鉑復合物中順鉑含量測定的方法。方法采用高效液相色譜法測定γ－聚谷氨酸－檸檬酸－順鉑復合物中順鉑含量，色譜柱為C18柱（4.6 mm×300 mm，5μm），流動相為含150 mmol·L－1氯化鈉的磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.4），流速為0.65 mL·min－1，檢測波長為210 nm。結(jié)果 順鉑質(zhì)量濃度在4～200μg·mL－1范圍內(nèi)，其色譜峰面積與質(zhì)量濃度的線性關系良好（r＝0.999 7）。順鉑含量測定的加樣回收率平均值為99.78%，RSD小于2%。測得γ－聚谷氨酸－檸檬酸－順鉑復合物中順鉑含量約為26%～28%。結(jié)論 該法靈敏度高、專屬性強、可用于γ－聚谷氨酸－檸檬酸－順鉑復合物中順鉑的含量測定。

γ－聚谷氨酸；順鉑；高效液相色譜法；含量測定

順鉑（Cisplatin，CDDP）是臨床常用的廣譜抗癌藥物，但因其嚴重的腎毒性等副作用，限制了它的廣泛使用［1］。此外，順鉑在體內(nèi)很快和蛋白結(jié)合而失效，不能長時間維持有效的藥物濃度，且鉑半衰期長，體內(nèi)毒性大，影響其療效。我們應用可生物降解的γ－聚谷氨酸（γ－PGA）作為藥物載體，通過接枝檸檬酸提高順鉑載藥量，成功制備了一種半衰期長、毒性低、水溶性好、具有被動靶向和緩釋效果的順鉑類似物γ－聚谷氨酸－檸檬酸－順鉑復合物。

目前，文獻報道順鉑制劑中順鉑含量的測定方法主要有電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（ICP）法［2］、高效液相色譜法、原子吸收光譜法［3］和衍生化－紫外分光光度法［4，5］。為了對水溶性順鉑復合物制劑進行質(zhì)量控制，本文采用酸破壞的方法，將γ－聚谷氨酸－檸檬酸－順鉑復合物酸降解，破壞載體游離出順鉑后，用HPLC進行順鉑含量測定。本法樣品前處理簡單，操作簡便，結(jié)果準確可靠，可用于水溶性順鉑復合物中順鉑含量的測定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 日本島津高效液相色譜儀（泵：LC－20A；檢測器：SPD－20A）；LGJ－12真空冷凍干燥機（北京松源華興科技發(fā)展有限公司）；SHZ－28A型恒溫水浴振蕩器（太倉市華美生化儀器廠）；分析天平（伯拉莫貝林（上海）精密儀器有限公司）；pHS－3C型pH計（上海雷磁儀器廠）。

1.2 試藥 γ－聚谷氨酸－檸檬酸－順鉑復合物（自制，批號：20131007－1、20131007－2）；順鉑（CDDP，山東鉑源化工，批號：130601CI）；鹽酸（南京化學試劑有限公司，批號：11121530695）；磷酸二氫鉀（上海凌峰化學試劑有限公司，批號：20111208）；氯化鈉（西隴化工股份有限公司，批號：131017）；氫氧化鈉（西隴化工股份有限公司，批號：121006）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Hanbon Sci.＆Tech.Megres C18（4.6 mm×300 mm，5μm）；流動相：pH 7.4磷酸鹽緩沖溶液（含150 mmol·L－1NaCl）；流速：0.65 mL·min－1；檢測波長：210 nm；柱溫30℃；進樣量：20μL。

2.2 溶液配制

2.2.1 供試品溶液的制備 配制10 mg·mL－1的γ－聚谷氨酸－檸檬酸－順鉑復合物儲備液，取1 mL儲備液加入2 mL 0.1 mol·L－1HCl溶液，于37℃恒溫振蕩箱中破壞12 h，取出后加入2 mL 0.1 mol·L－1NaOH溶液中和鹽酸，用流動相定容至10 mL，搖勻，即得。

2.2.2 對照品溶液的制備 配制400μg·mL－1的順鉑儲備液，精密移取儲備液0.1、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL置10 mL容量瓶中，用流動相稀釋定容得濃度為4、40、80、120、160、200μg·mL－1的溶液。

2.3 系統(tǒng)適應性試驗 取6份“2.2.2”項下相同濃度的順鉑儲備液，進樣，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，按順鉑計算的理論塔板數(shù)大于3 000。

分別取順鉑溶液、供試品溶液、流動相，按“2.1”項下色譜條件，進樣，記錄色譜圖（見圖1）。

由圖1可見，順鉑的保留時間約為5.660 min。流動相不干擾順鉑的測定，γ－聚谷氨酸－檸檬酸－順鉑酸破壞樣品中降解產(chǎn)物與順鉑主峰的分離度為2.096，降解產(chǎn)物對順鉑測定無干擾?？梢?，該方法專屬性良好。

2.4 線性關系考察 取順鉑20 mg，精密稱定，置50 mL棕色容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為400μg·mL－1的順鉑儲備液。分別精密量取順鉑儲備液0.1、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0mL，分置6個10mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，按“2.1”項下色譜條件進行測定。以進樣濃度（μg·mL－1）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程：Y＝23 763X＋23 796（r＝0.999 7）。結(jié)果表明，順鉑在4～200μg·mL－1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關系。

圖1 γ－聚谷氨酸－檸檬酸－順鉑復合物含量測定方法的專屬性考察

2.5 精密度 取“2.2.2”項下的順鉑儲備液20 μL，進樣，按“2.1”項下的色譜條件測定，連續(xù)進樣6次，記錄器色譜峰面積。結(jié)果顯示，進樣6次所得順鉑峰峰面積的RSD分別為0.20%，結(jié)果表明該方法重復性良好。

2.6 檢測限與定量限 分別取“2.2.2”項下制備的順鉑儲備液，加流動相配制成不同質(zhì)量濃度的溶液，進樣，記錄色譜圖。結(jié)果測得，信噪比（S／N）為3時，順鉑的檢測限為0.02μg·mL－1；S／N為10時，順鉑的定量限為0.40μg·mL－1。

2.7 加樣回收率 取γ－聚谷氨酸－檸檬酸－順鉑復合物200 mg，置10 mL棕色容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，作為復合物儲備液。取2.5 mL儲備液置25 mL棕色容量瓶中，加入7.5 mL 0.1 mol ·L－1HCl，于37℃恒溫振蕩器中振蕩12 h，加入7.5 mL 0.1 mol·L－1NaOH中和酸，用流動相定容至刻度，作為酸破壞復合物儲備液。分別精密量取酸破壞復合物儲備液1.0 mL置9個10 mL容量瓶中，每3份一組，共3組。向各組樣品中分別加入“2.2.2”項下制備的順鉑儲備液2.0、2.5、3.0 mL，用流動相稀釋定容至刻度，搖勻，即得順鉑質(zhì)量濃度分別為80、100、120μg·mL－1的供試品溶液，進樣檢測。結(jié)果顯示（見表1），低、中、高3個質(zhì)量濃度供試品溶液的順鉑平均加樣回收率分別為98.67%、100.28%和100.40%，RSD分別為0.19%、0.26%和1.27%（n＝3），總平均回收率為99.78%，在98～102%范圍內(nèi)，RSD均小于2.0%，符合方法學要求。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝3）

2.8 樣品測定 取2個不同批次（批號分別為20131007－1、20131007－2）自制γ－聚谷氨酸－檸檬酸－順鉑復合物，分別依法制備供試品溶液，注入液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖，采用外標法計算γ－聚谷氨酸－檸檬酸－順鉑復合物中順鉑含量分別為26.18%和28.54%。

分別采用ICP－MS、原子吸收和紫外法測定20131007－1批次自制γ－聚谷氨酸－檸檬酸－順鉑復合物中順鉑含量，測定結(jié)果見表2。

γ－聚谷氨酸－檸檬酸－順鉑復合物是以γ－聚谷氨酸－檸檬酸酯為載體，制備載藥復合物。在酸性環(huán)境下，酯鍵與酰胺鍵發(fā)生降解反應，γ－聚谷氨酸－檸檬酸酯可被破壞，且在大量Cl－存在下，Cl－與γ－聚谷氨酸－檸檬酸－順鉑復合物中的羧基發(fā)生競爭交換反應，使順鉑從復合物中游離出來，從而測定順鉑含量。本方法適用于以化學鍵合方法載順鉑的前體藥物中順鉑含量的測定，是順鉑制劑中順鉑含量測定的又一可行方法。

表2 ICP－MS、原子吸收和紫外法測定結(jié)果

3 討論

筆者嘗試用不同方法測定γ－聚谷氨酸－檸檬酸－順鉑復合物中順鉑含量，其中采用ICP－MS與原子吸收分光光度法測定時，樣品前處理過程繁瑣；衍生化－紫外分光光度法測定時，無法完全將水溶性復合物中順鉑衍生化，導致測定結(jié)果偏低；高效液相色譜直接測定時，由于順鉑與載體發(fā)生絡合反應，無法直接測定γ－聚谷氨酸－檸檬酸－順鉑復合物中順鉑含量。采用酸破壞－HPLC法將復合物進行破壞后測定，既可在鹽酸環(huán)境下使順鉑穩(wěn)定，又建立了一種水溶性順鉑復合物制劑中順鉑含量的測定方法。該方法簡便可行，重復性好，可用于測定水溶性γ－聚谷氨酸－檸檬酸－順鉑復合物中順鉑的含量，為順鉑前藥中順鉑含量測定提供了新的方法，具有潛在的應用價值。

［1］汪明明，崔速南.抗癌新藥順鉑的研究進展［J］.癌癥，1986，5（1）：110－114.

［2］Xiao H1，Zhou D，Liu S，et al.A complex of cyclohexane－1，2－diaminoplatinum with an amphiphilic biodegradable polymer with pendant carboxyl groups［J］.Acta Biomaterialia，2012，8（5）：1859－1868.

［3］王亞敏，石庭森.石墨爐原子吸收法測定靶向制劑順鉑殼聚糖微球藥物的含量［J］.藥品檢驗，1995，30（10）：618－620.

［4］Masayuki Yokoyama，Teruo Okano，Yasuhisa Sakurai，et al.Introduction of cisplatin into polymeric micelle［J］.Journal of Controlled Release，1996，39（2－3）：351－356.

［5］田潔，逄秀娟，吳冬冬，等.順鉑固體脂質(zhì)納米粒的制備及其在大鼠體內(nèi)的分布［J］.中國藥劑學雜志，2008，6（4）：141－149.

Establishment of the content determ ination of cisplatin inγ－polyglutam ic acid－citric acid－cisp latin conjugate

LIU Kai-shuang，SHEN Yan，TU Jia-sheng
（Department of Pharmaceutics，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China）

ObjectiveTo establish amethod for determining the content of cisplatin inγ－polyglutamic acid－citric acid－cisplatin conjugate.MethodsThe external standard method was used.The content of cisplatin inγ－polyglutamic acid－citric acid－cisplatin conjugate was determined by acid destroy－HPLCmethod，in which C18column（4.6 mm×300 mm，5μm）was used，PBS（pH 7.4）was used as the mobile phase at a flow rate of 0.65 mL·min－1，and the detective wavelength was 210 nm.ResultsThe chromatographic peak area and concentration of cisplatin showed a good linear relationship at the range of 4～200μg·mL－1（r＝0.999 7）.The average recovery of cisplatin was99.78%，the RSD was less than 2%.The content of cisplatin inγ－polyglutamic acid－citric acid－cisplatin conjugate was 26%～28%.ConclusionThe method was sensitive，specific，convenient and reliable.It can be used for the content determination of cisplatin inγ－polyglutamic acid－citric acid－cisplatin conjugate.

γ－polyglutamic；Cisplatin；HPLCmethod；Determination

R927.2

：A

2095－5375（2014）03－0129－003

國家自然科學基金資助項目（No.812001182）；中央高?；鹋嘤椖浚∟o.JKPZ2013006）

劉凱雙，女，研究方向：藥物新劑型與新技術，E－mail：kerain1109＠163.com

涂家生，男，教授，研究方向：藥物新劑型與新技術，Tel：13605159819，E－mail：jiashengtu＠cpu.edu.cn