董宏偉，劉萬卉

（煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院，山東煙臺(tái)264005）

RP－HPLC法測定葛藤分散片中葛根素與大豆苷的含量

董宏偉，劉萬卉

（煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院，山東煙臺(tái)264005）

目的建立同時(shí)測定葛藤分散片中葛根素與大豆苷含量的反相高效液相色譜法。方法采用Agilent Zarbax Eclipse C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇－水（20∶80，V／V），流速1.0 mL·min－1，檢測波長250 nm，柱溫35℃，進(jìn)樣量10μL。結(jié)果葛根素和大豆苷在各自的線性范圍內(nèi)（葛根素：9.04～72.32μg· mL－1；大豆苷：9.12～72.96μg·mL－1），峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系（r值均大于0.999）。葛根素和大豆苷的最低定量限分別為0.45和0.46μg·mL－1，加樣回收率分別為100.2%和101.7%，R SD分別為0.7%和0.9%（n＝9）。結(jié)論本方法簡便、準(zhǔn)確、靈敏、重現(xiàn)性好，專屬性強(qiáng)，可用于葛藤分散片中葛根素和大豆苷的質(zhì)量控制。

葛藤分散片；葛根素；大豆苷；高效液相色譜法

葛藤與葛根的總黃酮含量相近，葛藤中大豆苷含量較葛根素高。隨著市場需求的擴(kuò)大，葛根的過度挖掘?qū)Νh(huán)境造成了不可逆轉(zhuǎn)的危害，因此開展葛藤總黃酮的開發(fā)研究不僅具有較大的經(jīng)濟(jì)效益，更有保護(hù)資源和水土流失的環(huán)保及社會(huì)意義。

葛藤為豆科植物野葛Pueraria Lobata（Wild）ohwi的地上部分干燥莖，其藥用價(jià)值近年來受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注，其主要含有大豆苷元（Daidzein）、葛根素（Puerarin）等異黃酮成分。葛根素有擴(kuò)張心腦血管，降低心肌氧耗，改善心肌收縮功能和促進(jìn)微循環(huán)的作用［1］，對(duì)葛根素的測定方法主要有紫外可見分光光度法、薄層色譜法、高效液相色譜法和毛細(xì)管電泳法等［2］。本試驗(yàn)采用RP－HPLC以等度洗脫的方法，同時(shí)測定葛藤分散片中葛根素和大豆苷的含量，樣品中葛根素和大豆苷與其他物質(zhì)的分離度較好。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Agilent1100液相色譜儀，單元泵，VWD檢測器，Agilent色譜工作站，7725i手動(dòng)進(jìn)樣閥；SK2200H超聲清洗儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；十萬分之一電子分析天平（奧豪斯儀器上海有限公司）。

1.2 試劑 葛根素對(duì)照品（批號(hào)：110752－200511）、大豆苷對(duì)照品（批號(hào)：111738－200501）；皆由中國藥品生物制品檢定所提供；葛藤分散片（批號(hào)：20070110，20070112，20070121）；陰性葛藤分散片，由藥學(xué)院藥劑室提供；甲醇、乙腈（色譜純，Burdick＆Jackson）；水為二次重蒸水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent Zarbax Eclipse C18柱（4.6 mm×150 mm，5μm），柱溫：35℃，流動(dòng)相為甲醇－水（20∶80，V／V），流速1.0 mL·min－1，檢測波長：250 nm，進(jìn)樣量：10μL。

在該色譜條件下葛根素、大豆苷的保留時(shí)間分別為8.9、15.5 min，葛藤分散片的色譜見圖1。

圖1 葛藤分散片的HPLC色譜圖 1.葛根素；2.大豆苷

2.2 供試品溶液的制備 取本品10片研碎后取粉末約0.5 g，精密稱定，置錐形瓶中加甲醇50 mL超聲萃取30 min，放冷，用甲醇定容于100 mL量瓶中，取過0.45μm微孔濾膜的續(xù)濾液1 mL，置10 mL量瓶中加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液［3～5］。

2.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥過的葛根素、大豆苷對(duì)照品各約10 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2.4 線性關(guān)系考察 精密稱取葛根素、大豆苷對(duì)照品適量，加甲醇溶解并稀釋制成濃度分別為9.04、18.08、27.12、36.16、72.32μg·mL－1的葛根素系列標(biāo)準(zhǔn)溶液和濃度分別為9.12、18.24、27.36、36.48、72.96μg·mL－1大豆苷的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件方法測定峰面積，記錄色譜圖［6，7］，以峰面積Y對(duì)濃度X做線性回歸，葛根素回歸方程為：Y＝47.944X＋25.793，r＝0.999 3，大豆苷：Y＝42.33X＋21.73，r＝0.999 1，表明葛根素濃度在9.04～72.32μg·mL－1、大豆苷濃度在9.12～72.96μg·mL－1范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.5 定量限和檢測限 分別精密稱取葛根素和大豆苷對(duì)照品適量，加甲醇溶解并逐步稀釋制成一定濃度的溶液，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件下測定峰面積，以信噪比法計(jì)算，結(jié)果葛根素的最低定量限（S／N＝10）為0.45μg·mL－1，檢出限為（S／N＝3）45.0 ng ·mL－1；大豆苷的最低定量限（S／N＝10）為0.46 μg·mL－1，檢出限（S／N＝3）為46.0 ng·mL－1。

2.6 精密度試驗(yàn) 精密量取“2.3”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液10μL，在上述色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，測定其峰面積，葛根素與大豆苷RSD分別為0.7%與0.3%，表明進(jìn)樣精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液，室溫下放置，分別在0、3、6、9、12、24 h進(jìn)行測定，記錄葛根素與大豆苷的峰面積，計(jì)算RSD分別為0.8%和0.7%，表明葛根素和大豆苷在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號(hào)為20070112的樣品，照“2.2”項(xiàng)下的方法各配制6份供試品溶液，按照含量測定方法平行操作，測定，結(jié)果樣品中葛根素和大豆苷含量的RSD分別為0.7%與0.5%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知含量同一批次的樣品（每片含葛根素26.27 mg，含大豆苷29.18 mg），分別精密加入已知值的80%、100%、120%的葛根素與大豆苷對(duì)照品，按“2.2”項(xiàng)下供試品溶液的處理方法，進(jìn)樣記錄色譜圖，計(jì)算測得量，結(jié)果見表1。

表1 葛藤分散片中葛根素與大豆苷加樣回收率（n＝9）

2.10 系統(tǒng)耐用性試驗(yàn) 取供試品溶液，在保持其他色譜條件不變的情況下，分別改變流速（0.9、1.1 mL·min－1）、柱溫（30、40℃）以及更換同類型色譜柱Xbridge C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5μm）以及Hypersil ODS－2色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）、流動(dòng)相比例甲醇－水（25∶75，V／V）以及甲醇－水（15∶85，V／V）以考察測定條件有微小變動(dòng)時(shí)，測定結(jié)果不受影響的程度。結(jié)果表明，在改變上述色譜條件下的情況下，葛根素的理論板數(shù)均大于4 000，葛根素與大豆苷及相鄰峰的分離度都大于1.5，說明該方法有良好的耐用性。

2.11 樣品含量測定 配置供試品及對(duì)照品溶液，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，測得三批次樣品的含量，結(jié)果見表2。

表2 三批次葛藤分散片中葛根素與大豆苷的含量測定結(jié)果（n＝6）

由以上測定結(jié)果顯示，本方法測定葛藤分散片中葛根素（C21H20O9）與大豆苷（C21H20O9），快速，準(zhǔn)確，可靠。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 在400～200 nm范圍內(nèi)對(duì)葛根素與大豆苷對(duì)照品進(jìn)行色譜掃描，分別見圖2、3，發(fā)現(xiàn)在葛根素在249.8 nm處有最大吸收，大豆苷在254 nm有最大吸收，因此確定測定樣品檢測波長為250 nm。

圖2 葛根素對(duì)照品紫外掃描圖

圖3 大豆苷對(duì)照品紫外掃描圖

3.2 葛藤分散片提取方法的考察 經(jīng)過對(duì)提取方法，提取溶媒，甲醇用量及提取時(shí)間的試驗(yàn)驗(yàn)證，其葛根素與大豆苷的提取百分含量見表3。

表3 葛藤分散片提取方法葛根素與大豆苷的百分含量

由表3可以確定葛藤分散片的制備方法為，取供試品（批號(hào)：20070110）10片，稱量，研細(xì)，精密稱取平均片重，置于250 mL具塞錐形瓶中，加入50 mL甲醇超聲30 min，放冷，定容于100 mL量瓶，搖勻，精密移取過0.45μm濾膜的續(xù)濾液1 mL定容于10 mL量瓶中，搖勻，取10μL進(jìn)樣分析。

4 結(jié)論

該試驗(yàn)方法采用C18色譜柱，甲醇－水（20∶80，V／V）等度洗脫，可以快速簡便的檢測葛藤分散片中葛根素與大豆苷的含量，采用甲醇超聲30 min，提取葛藤分散片中的葛根素與大豆苷，方法準(zhǔn)確，便捷，提高了試驗(yàn)效率，試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法快速、準(zhǔn)確、可靠，可用于葛藤分散片中葛根素與大豆苷的含量測定，對(duì)其他相關(guān)中藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究有重要的參考價(jià)值。

［1］陳荔，陳樹和，劉焱文.葛根資源、化學(xué)成分和藥理作用研究概況［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2006，17（11）：2305－2306.

［2］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典2010年版（一部）［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：313.

［3］劉玉國，修彥鳳.葛根及其葛根制劑中葛根素含量測定方法概述［J］.基層中藥雜志，1999，13（1）：42－44.

［4］周紅英，王建華，閆鳳云.RP－HPLC分離測定甘葛藤莖葉中葛根素、大豆苷和大豆苷元的含量［J］.中國中藥雜志，2007，10（32）：937－939.

［5］周紅英，李同德，蘇雪慧，等.野葛藤莖及葉總黃酮的含量測定［J］.泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，25（1）：55.

［6］隆穎，于永洲，朱淼.HPLC測定葛根寶軟膠囊中葛根素和大豆苷元的含量［J］.中國醫(yī)學(xué)導(dǎo)報(bào)，2007，4（27）：101－102.

［7］周欣，宋洪濤，游開仙.梯度洗脫HPLC法測定舒肝降脂膠囊中葛根素、大豆苷及大豆苷元的含量［J］.解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2008，24（1）：78－80.

Determ ination of puerarin and daidzin in Kudzu Dispersible Tablet by RP－HPLC

DONG Hong-wei，LIUWan-hui
（School of Pharmacy，Yantai University，Yantai264005，China）

ObjectiveTo establish a RP－HPLCmethod for the determination of puerarin and daidzin in Kudzu Dispersible Tablet.MethodsAgilent Zarbax Eclipse C18column（4.6 mm×150 mm，5μm）was adopted with the mobile phase consisted ofmethanol－water（20∶80，V／V），the flow rate was 1.0 mL·min－1and the detection wavelength was set at250 nm.The column temperature was 35℃and the injection volume was 10μL.ResultsThe linear range of puerarin 9.04～72.32μg·mL－1and 9.12～72.96μg·mL－1for daidzin.The lower limitof quantification of puerarin and daidzin were 0.45 and 0.46μg·mL－1，respectively.The average recovery were 100.2%and 101.7%（n＝9），respectively；RSD were 0.7%and 0.9%，respectively.ConclusionThe method was simple，specific，sensitive and accurate with good repeatability，whichmay be used for the quality control of puerarin and daidzin in Kudzu Dispersible Tablet.

Kudzu Dispersible Tablet；Puerarin；Daidzin；HPLC

R927.2

A

2095－5375（2014）02－0073－003

山東省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（No.032040101）

董宏偉，男，研究方向：藥物分析，E－mail：weid8848＠163.com

劉萬卉，男，教授，研究方向：藥物分析，Tel：13306389032，E－mail：wanhui＠luye.cn