王 玨，沈 雁，張俊玲，涂家生

（1.中國(guó)藥科大學(xué)藥學(xué)院藥劑學(xué)教研室，江蘇南京210009；2.江蘇省蘇北人民醫(yī)院腫瘤科，江蘇揚(yáng)州225001）

·實(shí)驗(yàn)研究·

CD44在不同腫瘤細(xì)胞表面陽性表達(dá)率的實(shí)驗(yàn)研究

王 玨1，沈 雁1，張俊玲2，涂家生1

（1.中國(guó)藥科大學(xué)藥學(xué)院藥劑學(xué)教研室，江蘇南京210009；2.江蘇省蘇北人民醫(yī)院腫瘤科，江蘇揚(yáng)州225001）

目的檢測(cè)CD44在腫瘤細(xì)胞表面的陽性表達(dá)率，為以CD44為靶點(diǎn)的腫瘤靶向治療提供新的理論依據(jù)。方法 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HCT116人結(jié)腸癌細(xì)胞，SGC－7901、MGC－803胃癌細(xì)胞，A549人肺腺癌細(xì)胞，HepG2人肝癌細(xì)胞，CNE－2人鼻咽癌細(xì)胞，U87MG惡性膠質(zhì)瘤等腫瘤細(xì)胞表面CD44表達(dá)情況。結(jié)果各腫瘤細(xì)胞表面均表達(dá)CD44。其中胃癌SGC－7901、MGC－803、肝癌HepG2、鼻咽癌CNE－2細(xì)胞表面CD44細(xì)胞的陽性率分別為17.90%±1.67%、18.36%±9.27%、24.61%±4.0%和19.03%±1.52%，呈高表達(dá)狀態(tài)。結(jié)論SGC－7901、MGC－803、HepG2、CNE－2細(xì)胞與HCT116、A549和U87MG細(xì)胞表面CD44陽性表達(dá)率相比有顯著性差異（P＜0.05）。

CD44；腫瘤靶向；流式細(xì)胞術(shù)；陽性表達(dá)率

侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要生物學(xué)特征，是導(dǎo)致手術(shù)、放療、化療等手段失敗和患者死亡的最主要原因，其中細(xì)胞黏附分子參與整個(gè)過程并起重要作用［1］。CD44是一種細(xì)胞表面黏附分子，在淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和增生的上皮細(xì)胞中都可檢測(cè)到其存在。近年來發(fā)現(xiàn)，CD44分子與許多惡性瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有著密切的聯(lián)系，在這些惡性瘤細(xì)胞表面，CD44分子都有異常表達(dá)［2，3］。

本文將測(cè)定幾種常見腫瘤細(xì)胞表面的CD44表達(dá)情況，為開發(fā)CD44介導(dǎo)的腫瘤靶向給藥系統(tǒng)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和試劑

HCT116，SGC－7901，MGC－803，A549，HepG2，CNE－2，U87MG細(xì)胞株均由中國(guó)藥科大學(xué)藥理教研室提供；RPMI1640培養(yǎng)液、DMEM培養(yǎng)液均購自Gibco公司；FITC標(biāo)記的鼠抗人CD44單克隆抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記的鼠抗人CD44同型對(duì)照抗體均購自Sigma公司；二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Scientific公司）；Facscal流式細(xì)胞儀（美國(guó)BectonDickinson公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人結(jié)腸癌HCT116和腦膠質(zhì)瘤U87MG細(xì)胞用含有10%胎牛血清、100 U·mL－1青霉素和100μg·mL－1鏈霉素的DMEM／F12培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，人胃癌SGC－7901、MGC－803細(xì)胞和人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，人肝癌HepG2細(xì)胞用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)，人鼻咽癌CNE－2用內(nèi)含10%新生牛血清、200 U·mL－1青霉素、200μg·mL－1鏈霉素的RPMI－1640培養(yǎng)。培養(yǎng)條件均為5%CO2、37℃、飽和濕度。所有實(shí)驗(yàn)細(xì)胞均取自對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞表面CD44的表達(dá)0.25%胰酶分別消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT116、SGC－7901、MGC－803、A549、HepG2、CNE－2、U87MG細(xì)胞，顯微鏡下觀察。細(xì)胞呈單細(xì)胞懸液時(shí)用含血清的培養(yǎng)液終止消化，200×g離心5 min，棄上清，再用適量PBS洗滌3遍計(jì)數(shù)，所有細(xì)胞均按每管約106個(gè)細(xì)胞的比例，收集至2個(gè)Eppendorf管中。各腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組加入適量鼠抗人CD44單克隆抗體，對(duì)照組加入等體積CD44同型對(duì)照抗體，室溫避光放置15～30 min，PBS洗滌2遍，500μL PBS重懸，移至流式管中上機(jī)檢測(cè)，收集104個(gè)細(xì)胞，熒光強(qiáng)度以對(duì)數(shù)放大，結(jié)果用CD44細(xì)胞的陽性率表示，數(shù)據(jù)用軟件進(jìn)行分析。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Sigmaplot軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用±SD表示，采用單因素方差分析（One－way，ANOVA）進(jìn)行各組間均數(shù)比較。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如圖1－7所示，各腫瘤細(xì)胞表面均表達(dá)CD44。其中SGC－7901、MGC－803、HepG2、CNE－2細(xì)胞表面CD44細(xì)胞的陽性率分別為17.90%±1.67%、18.36%±9.27%、24.61%±4.0%和19.03%±1.52%，呈高表達(dá)狀態(tài)（圖8）。與HCT116，A549和U87MG細(xì)胞表面CD44陽性表達(dá)率相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 HCT116細(xì)胞CD44陽性表達(dá)率分布圖

4 討論

最新研究發(fā)現(xiàn)，CD44還被廣泛作為乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、卵巢癌和結(jié)腸直腸癌等多種腫瘤干細(xì)胞的一個(gè)重要表面標(biāo)記分子。另有研究發(fā)現(xiàn)，CD44似乎對(duì)所有類型的癌癥具有顯著的調(diào)節(jié)作用，更闡明這個(gè)標(biāo)記可能有助于評(píng)估其預(yù)后的重要性［4］。

另外，在藥學(xué)研究領(lǐng)域，CD44作為腫瘤靶向給藥系統(tǒng)的靶點(diǎn)已被眾多研究者所關(guān)注，其特異性受體透明質(zhì)酸（HA）作為主動(dòng)靶向基團(tuán)被引入各類給藥系統(tǒng)，如以脂質(zhì)體為基礎(chǔ)的納米載體［5］、陽離子聚合物基因載體［6］、自組裝納米粒［7］等，尤其隨著近年來對(duì)腫瘤干細(xì)胞的研究逐漸深入，以CD44為代表的各類細(xì)胞表面黏附分子被用于多種腫瘤干細(xì)胞的分離、鑒定和純化。因此，研究并探索CD44在各種細(xì)胞系中陽性表達(dá)率的高低可使腫瘤靶向給藥系統(tǒng)的設(shè)計(jì)更加具有針對(duì)性。

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)在實(shí)體腫瘤邊緣組織富集透明質(zhì)酸，同時(shí)腫瘤細(xì)胞表面則高度表達(dá)透明質(zhì)酸受體－CD44

［8，9］。這提示透明質(zhì)酸經(jīng)過受體介導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)途徑對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)、黏附、轉(zhuǎn)移起著重要的作用。在惡性腫瘤細(xì)胞表面的CD44受體對(duì)透明質(zhì)酸具有很高的親和力，能將其結(jié)合后介導(dǎo)胞吞作用將其內(nèi)吞，從而達(dá)到向腫瘤外周組織侵犯及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的目的。CD44受體也表達(dá)于正常組織原代細(xì)胞中，但正常組織原代細(xì)胞的CD44受體大部分處于一種非活化的沉默狀態(tài)，其對(duì)透明質(zhì)酸的親和力遠(yuǎn)低于腫瘤細(xì)胞［10，11］。實(shí)體腫瘤與透明質(zhì)酸的這種關(guān)系，正好為化療藥物的靶向性輸送提供一種可能的途徑，即通過透明質(zhì)酸與CD44受體結(jié)合介導(dǎo)的胞吞作用將藥物靶向性送入腫瘤細(xì)胞內(nèi)。

圖2 SGC－7901細(xì)胞CD44陽性表達(dá)率分布圖

圖3 MGC－803細(xì)胞CD44陽性表達(dá)率分布圖

圖4 A549細(xì)胞CD44陽性表達(dá)率分布圖

圖5 HepG2細(xì)胞CD44陽性表達(dá)率分布圖

圖6 CNE－2細(xì)胞CD44陽性表達(dá)率分布圖

圖7 U87－MG細(xì)胞CD44陽性表達(dá)率分布圖

文獻(xiàn)報(bào)道多數(shù)腫瘤細(xì)胞CD44表達(dá)陽性率在60%以上，有些甚至達(dá)到99%。本研究未得出相同結(jié)論，這可能跟細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)的傳代次數(shù)有關(guān)，傳代次數(shù)越多，細(xì)胞變異和惡化程度越嚴(yán)重，CD44的表達(dá)會(huì)有所改變，但傳代次數(shù)太多會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞貼壁效果下降，影響實(shí)驗(yàn)效果。本研究所用腫瘤細(xì)胞種類偏少，其他腫瘤細(xì)胞類型尚未涉及，有待進(jìn)一步探索。

綜上所述，CD44在胃癌、肝癌、鼻咽癌中呈相對(duì)高表達(dá)，在肺癌、結(jié)腸癌、腦癌中成相對(duì)低表達(dá)。這對(duì)設(shè)計(jì)CD44介導(dǎo)的靶向腫瘤給藥系統(tǒng)奠定了研究基礎(chǔ)。

圖8 CD44在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)（n＝3）

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Analysis on the express of surface adhesion molecule CD44in different tumor cells

WANG Jue1，SHEN Yan1，ZHANG Jun-ling2，TU Jia-sheng1
（1.Department of Pharmacy，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China；2.Department of Oncology，Subei People′s Hospital of Jiangsu Province，Yangzhou 225001，China）

ObjectiveTo detect the expressions of surface adhesionmolecule CD44in tumor cells in order to provide a new theoretical reference for CD44tumor targeted therapy.M ethodsThe expressions of CD44of HCT116，SGC－7901，MGC－803，A549，HepG2，CNE－2 and U87MG cellswere determined by flow cytometry.ResultsCD44was all expressed on these tumor cells.CD44was over expressed on SGC－7901，MGC－803，HepG2 and CNE－2 and the positive expression rate were 17.90%±1.67%，18.36%±9.27%，24.61%±4.0%and 19.03%±1.52%，respectively.ConclusionThere was significant difference between the positive expression rate of SGC－7901，MGC－803，HepG2，CNE－2 and HCT116，A549，U87MG（P＜0.05）.

CD44；Tumor targeted；Flow cytometry；Positive expression rate

R730.23

A

2095－5375（2014）02－0063－005

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目（No.JKPZ2013006）；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.81072588，81201182）

王玨，女，研究方向：基因給藥載體及遞送系統(tǒng)，E－mail：myxwj2007＠163.com

涂家生，男，教授，研究方向：藥物新劑型與新技術(shù)，Tel：13605159819，E－mail：jiashengtu＠cpu.edu.cn