高艷霞，楊波

原因不明習(xí)慣性流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion，RSA)是指排除了所有已知引起流產(chǎn)原因、連續(xù)3次或3次以上的反復(fù)早期(妊娠20周內(nèi))流產(chǎn)，是常見的病理妊娠之一［1］。引起RSA的病因復(fù)雜，其中有＞50%的患者病因不明。生殖免疫學(xué)研究認(rèn)為，胚胎的植入是一種半同種異體移植［2］，這與蛻膜組織中正常的免疫微環(huán)境有一定的關(guān)系，尤其是妊娠12周以內(nèi)，胎盤與母體的緊密聯(lián)系還未完全建立時，蛻膜中免疫微環(huán)境對胚胎的生長尤為重要。然而，當(dāng)這種耐受格局被打破時就會導(dǎo)致病理妊娠，甚至流產(chǎn)。人類自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，NK cell)占外周循環(huán)淋巴細(xì)胞的 10% ～15%［3］，在妊娠早期，NK細(xì)胞大約占蛻膜淋巴細(xì)胞的70%［4］，在機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用，包括通過對靶細(xì)胞的識別或分泌細(xì)胞因子對妊娠進(jìn)行免疫調(diào)控，當(dāng)這種作用一旦失衡將會導(dǎo)致RSA的發(fā)生。CD56是220KDa糖蛋白，存在于外周血NK細(xì)胞上，是NK細(xì)胞最重要的表面抗原標(biāo)志。CD25作為白介素2受體α鏈(IL-2Rα)可以通過免疫-內(nèi)分泌-細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)作用于NK細(xì)胞［5］，從而影響母體對胎兒的免疫保護(hù)或免疫攻擊。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光技術(shù)檢測RSA患者和正常妊娠婦女外周血及蛻膜組織中CD56、CD25的表達(dá)水平，初步觀察 CD56、CD25與RSA的關(guān)系，以期探討RSA的免疫學(xué)防病機(jī)制，為RSA的防治策略提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2011年1月—2013年6月在我院婦科門診就診的RSA患者60例為RSA組。入選標(biāo)準(zhǔn):①無誘因流產(chǎn)≥3次;②孕周6～12周，彩超提示胚胎停止發(fā)育(無心管搏動、不能見到胎芽等)，均排除孕期感染及有害物質(zhì)接觸史;③夫婦雙方染色體正常，無嚴(yán)重全身性疾病;④內(nèi)分泌和解剖學(xué)檢查基本正常;⑤男方精液和女方婦科檢查正常;⑥排除自身免疫性疾病等。年齡23～29歲，平均25.6歲。選擇同期在我院婦科門診要求人工流產(chǎn)的婦女70例為對照組，既往均有妊娠和分娩史，無死胎、自然流產(chǎn)史、肝腎及免疫性疾病史，B超提示胚胎發(fā)育正常，近期無服藥、無其他內(nèi)科疾病及病毒感染史。年齡21～34歲，平均27.9歲，孕周6～12周。兩組年齡、流產(chǎn)時孕周比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。所有標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)診斷驗證，所有病例術(shù)前3個月內(nèi)均未經(jīng)激素治療。1.2 標(biāo)本采集及處理 采集絨毛、蛻膜組織，立即用生理鹽水洗凈，取1 g組織固定于70%乙醇中，保存于-4℃冰箱中以備流式細(xì)胞檢測;剩余組織經(jīng)10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，每個標(biāo)本均做4μm連續(xù)切片，以備免疫熒光和免疫組化檢測。各組均采靜脈血4 ml，其中2 ml置于含有肝素抗凝劑的無菌抽血管中，8 h內(nèi)送流式細(xì)胞檢測;其余2 ml置于不含抗凝劑的無菌離心管中，室溫下待其自然凝固后，2000 r/min，離心10 min，取上層血清置于另外一個無菌EP管中，-20℃冰箱保存以備酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測。

1.3 主要儀器及試劑 PE-CD56多克隆抗體、PECD25單克隆抗體均購置于美國BD公司，鼠抗人CD56多克隆抗體、鼠抗人CD25多克隆抗體均購置于美國Abcam公司，IgG1-PE、IgG1-FITC均購置于美國Abcam公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測方法:①外周血:每組選取無菌抗凝外周靜脈血50μl，4℃孵育10 min后，每組分別加入PE-CD56、PE-CD25抗體3μl，室溫離心2000 r/min，去上清后，每管再加入2 ml PBS，室溫下2000 r/min，離心10 min，重復(fù)一次，棄上清后每管再加入100μl PBS懸浮細(xì)胞，混勻上機(jī)檢測;②蛻膜組織:將蛻膜組織以PBS漂洗3次，剪碎。將組織放入勻漿機(jī)離心管后加PBS至5 ml勻漿，勻漿后的組織在50μm的尼龍網(wǎng)過濾后用PBS沖洗，將殘留的組織棄去，加入PE-CD56、PE-CD25抗體5μl，避光 30 min，每管加入 PBS 2 ml，800 r/min，離心10 min棄上清，再加入PBS后上機(jī)檢測。

1.4.2 免疫熒光檢測蛻膜組織中CD56、CD25表達(dá):①取材:取RSA組和對照組新鮮組織，PBS液沖洗，?。?.5 cm×0.5 cm×0.1 cm組織塊固定后用銅制模具包埋組織;②切片:將厚度4μm的組織切片附于經(jīng)多聚賴氨酸(福州邁新試劑公司)附膜的載玻片上，60℃烘烤過夜;③脫蠟、入水:將切片分別浸于二甲苯中5 min 2次、100%乙醇5 min 2次、95%乙醇5 min 2次、90%乙醇5 min 2次、85%乙醇5 min 2次、75%乙醇5 min 2次、自來水沖洗、PBS洗2次;④1%甲醇過氧化氫，室溫10 min，蒸餾水洗1次，PBS洗5 min×3次;將切片放入0.01 mol檸檬酸鹽緩沖液中，0.1 mol PBS洗5 min×3次;顯微鏡觀察:選擇RSA組和對照組的陽性和陰性組織進(jìn)行100×和400×的顯微照相;判定標(biāo)準(zhǔn):無熒光(-)，極弱的可疑熒光(±)，熒光較弱(+)，但清楚可見，熒光明亮(++)，熒光閃亮(+++～++++);待檢標(biāo)本特異性熒光染色強(qiáng)度達(dá)(++)以上，而各種對照顯示為(+)、(±)或(-)，即可判定為陽性。圖像分析:選擇有意義的組織相，經(jīng)登錄、編號、采集、分析、讀取數(shù)據(jù)、最后存盤。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，兩組間比較采用t檢驗，對各因子之間的相關(guān)性進(jìn)行直線相關(guān)分析，α=0.05為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 CD56、CD25 NK細(xì)胞含量流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果 CD56、CD25 NK細(xì)胞在RSA組外周血和蛻膜組織中的含量均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)，見表1。

2.2 CD56、CD25 NK細(xì)胞免疫熒光檢測結(jié)果 紅色熒光代表CD56 NK細(xì)胞，綠色熒光代表CD25 NK細(xì)胞。在RSA組患者蛻膜組織中CD56、CD25 NK細(xì)胞的熒光染色強(qiáng)度均達(dá)(++)以上，為陽性表達(dá)，而在對照組婦女蛻膜組織中CD56、CD25 NK細(xì)胞的熒光染色強(qiáng)度均為(+)和(±)。RSA組熒光染色強(qiáng)度明顯高于RSA妊娠組，見圖1。

2.3 RSA組外周血CD56與蛻膜組織中CD56、外周血中CD25相關(guān)性 RSA組外周血中CD56與蛻膜組織中CD56和外周血中CD25的表達(dá)均呈正相關(guān)(r=0.713，P=0.032;r=0.367，P=0.014)。

表1 兩組外周血和蛻膜組織中CD56、CD25人類自然殺傷細(xì)胞含量(x±s)

圖1 蛻膜組織中CD56、CD25表達(dá)免疫熒光檢測結(jié)果(×400)A.RSA組CD56表達(dá);B.RSA組CD25表達(dá);C.對照組CD56表達(dá);D.對照組CD25表達(dá)

3 討論

妊娠早期蛻膜化的子宮內(nèi)膜和發(fā)育著的滋養(yǎng)層共同構(gòu)成母胎界面，在母胎界面存在著大量的免疫細(xì)胞來調(diào)節(jié)母體的免疫耐受，從而使胚胎植入的過程不被母體排斥而產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答。妊娠期母體免疫細(xì)胞數(shù)量和活性會發(fā)生很大變化，表現(xiàn)為免疫排斥的減弱和保護(hù)反應(yīng)的增強(qiáng)，從而使母體和胎兒間的免疫處于一種平衡狀態(tài)。

CD56是神經(jīng)細(xì)胞粘連因子，主要在所有的NK細(xì)胞、少部分細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的表面及部分神經(jīng)組織中表達(dá)［6］，是 NK細(xì)胞重要的表面標(biāo)志。CD25又稱為T細(xì)胞活化抗原，既是IL-2Rα也是膜IL-2受體(mIL-2R)［7］。當(dāng)啟動T細(xì)胞時IL-2Rα表達(dá)顯著增多，IL-2Rα可以與IL-2Rβ等鏈形成高親和度受體，對細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮重要的作用。

NK細(xì)胞在正常早孕婦女外周血中的活性較低，而在RSA患者的外周血中活性顯著增高。Coulam等［8］研究發(fā)現(xiàn)早孕婦女外周血中CD56+細(xì)胞的含量明顯升高。有研究顯示，在妊娠期Th2型細(xì)胞因子表達(dá)增加，Th1型細(xì)胞因子表達(dá)降低［9］，因此妊娠可以稱作為“Th2現(xiàn)象”。IL-2是Th1型細(xì)胞因子，可以和受體IL-2R結(jié)合而啟動IL-2R陽性細(xì)胞的活化和增殖，調(diào)節(jié)NK、T和B細(xì)胞的功能從而發(fā)揮免疫監(jiān)視和免疫排斥。本實驗通過流式細(xì)胞術(shù)檢測RSA組和對照組外周血中CD56、CD25 NK細(xì)胞的含量，結(jié)果顯示RSA組外周血中CD56、CD25 NK細(xì)胞的含量顯著高于對照組，提示CD56、CD25可能與RSA的發(fā)病有一定的聯(lián)系。

有研究認(rèn)為，在胚胎著床過程中，絨毛外層滋養(yǎng)細(xì)胞通過蛻膜侵蝕母體子宮螺旋動脈以增加胚胎血供，此時蛻膜NK細(xì)胞表達(dá)大量的NK細(xì)胞受體［10］。蛻膜NK細(xì)胞是母體識別胎兒抗原的主要免疫細(xì)胞，高度表達(dá)抑制性受體，不但可以維持母胎界面的免疫耐受，還與Th1/Th2型細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的平衡和母胎界面的血管重建有關(guān)。當(dāng)NK細(xì)胞過度活化后，可以使Th1/Th2失衡，導(dǎo)致母體血管產(chǎn)生血栓，抑制胎兒血供而使胎盤功能受損。有學(xué)者認(rèn)為，T細(xì)胞的異?；罨梢宰鳛槿焉锸〉囊粋€預(yù)測指標(biāo)［11］。CD25就是T細(xì)胞活化的一個標(biāo)志，CD25可以與IL-2結(jié)合激活T細(xì)胞以增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫。本研究應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光技術(shù)檢測了RSA組和對照組蛻膜組織中CD56、CD25的表達(dá)，結(jié)果顯示RSA組蛻膜組織中CD56 NK細(xì)胞的含量和熒光強(qiáng)度顯著高于對照組。雖然CD25 NK細(xì)胞在蛻膜組織中的表達(dá)量較少，但是在RSA組蛻膜組織中的含量和熒光強(qiáng)度明顯高于對照組。

本研究結(jié)果還顯示，RSA組外周血中CD56與蛻膜組織中CD56的表達(dá)呈正相關(guān)，并且與外周血中CD25的表達(dá)也呈正相關(guān)。提示CD56 NK細(xì)胞在免疫-內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)解下可以分泌多種細(xì)胞因子，并表達(dá)多種細(xì)胞因子的受體，當(dāng)細(xì)胞因子和其受體結(jié)合后又可以反作用于CD56 NK細(xì)胞，從而共同參與機(jī)體免疫的調(diào)節(jié)。

綜上所述，我們對于原因不明RSA的分析不能僅局限于母體因素或者是胎兒因素，只有把母體因素與胎兒因素結(jié)合起來加以考慮和判斷，才能做出正確的診斷，制定出合理的治療方案，從而為RSA的臨床研究和治療提供新的思路。

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